Name: flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization
Uploaded: 2014-07-17T16:00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization at JoVE.com

Questo lavoro è stato in parte sostenuto da un finanziamento a RAW da ciascuno dei seguenti: sovvenzioni NIH K01 DK083512, DP2 OD008470 e R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar concessione di una sovvenzione # 5-FY12-75; avvio di fondi presso l&#39;Università di Notre Dame College of Science e del Dipartimento di Scienze Biologiche. Vorremmo in particolare ringraziare Elizabeth e Michael Gallagher, insieme con tutta la famiglia Gallagher, che ha impartito un dono generoso alla University of Notre Dame di promuovere ricerca sulle cellule staminali. I finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l&#39;analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto. Ringraziamo il personale del Dipartimento di Scienze Biologiche per il loro supporto, e il Centro per la Ricerca Zebrafish a Notre Dame per la loro straordinaria dedizione nella cura e nel benessere della nostra colonia zebrafish. Infine, ringraziamo i membri del nostro laboratorio di ricerca per i loro commenti, discussioni e approfondimenti su questo lavoro, comecosì come Marigold (Maripooka) e Zinnia Wingert per fornire naturalmente capannone baffi felini per rendere più eccellenti strumenti sferza per la nostra ricerca.

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Zebrafish hanno dimostrato di essere un organismo modello estremamente prezioso per tutta la comunità di ricerca negli ultimi anni. Zebrafish esporre un notevole grado di conservazione genetica con quella dei vertebrati superiori, ed i vantaggi relativi alla loro anatomia, l&#39;allevamento, e il ciclo di vita rendono questa specie molto suscettibili di analisi sperimentali. Inoltre, il progresso delle tecniche molecolari applicabili alla zebrafish ha ulteriormente promosso l&#39;uso di questo organismo modello nella ricerca scientifica. Ad esempio, una grande varietà di linee di zebrafish transgenici sono stati generati per studiare la progressione della malattia e di rispondere a molte domande fondamentali che sono alla base dei meccanismi fondamentali dello sviluppo, tra cui organogenesi. Pertanto, basato sull&#39;uso dinamica di zebrafish sia malattia e ricerca evolutiva, metodologie di etichettatura cella e segnale quantificazione sono un aspetto cruciale di analisi dati. Mentre i metodi che utilizzano un fluorescentetibodies possono essere utilizzati per rilevare l&#39;espressione proteica in zebrafish transgenico, ricercatori tipicamente si basano su procedure standard come WISH 12-16 per esaminare la localizzazione spazio-temporale dei trascritti genici in un campione zebrafish non transgenico fisso. Infatti, WISH è una delle tecniche più utilizzate in biologia 16, ed è uno strumento fondamentale utilizzato per caratterizzare il fenotipo di mutazioni genetiche e perturbazioni genetiche chimici. Tuttavia, WISH è associato a un numero di potenziali insidie ​​e sfide. Per confermare la specificità del ribroprobe antisenso, riboprobes senso possono essere usate come controllo per valutare la specificità di antisenso riboprobe pattern di colorazione. Mentre le sezioni 4 e 5 sono presentati nell&#39;ordine di etichettatura e il rilevamento di una sonda marcata con digossigenina seguita dalla sonda marcato con fluoresceina, questo ordine può essere invertito. In genere, i segnali più deboli (geni con livelli di espressione più bassi) sono meglio rilevate con le sonde digossigenina marcato e questa macchiasviluppato prima con un substrato viola, seguito da rilevamento e colorazione del segnale più forte (gene più abbondantemente espressa) utilizzando il substrato rosso. Tuttavia, se le reazioni a due colori stanno per essere eseguita, si raccomanda di varie combinazioni di etichette e substrati sono testati per trovare la procedura che è più adatto per la raccolta e l&#39;analisi dei dati. Inoltre, i tempi previsti il ​​blocco, l&#39;incubazione degli anticorpi e lavaggio fornite nelle sezioni 4-5 sono su misura per gli embrioni di età inferiore a 24 ore dopo la fecondazione; lunghi intervalli di questi stessi passi con embrioni anziani possono portare a un accumulo di sale sul campione. Suggerimenti per la risoluzione Ampie embrione WISH zebrafish norma sono già stati documentati in letteratura 12-16. Probabilmente il dilemma più comune è elevato background. Si consiglia di aumentare il numero di lavaggi MABT nel passaggio 4,7 a 15-20 lavaggi in caso di necessità, però, nella nostra esperienza l&#39;aggiunta del pernottamento MABT &#39;super-wash&#39;dà ottimi risultati se usato in combinazione con 10 o più brevi lavaggi MABT prima di procedere al passaggio 4.8. Un altro esempio dilemma è scarsa infiltrazione sonda, che può verificarsi con riboprobes lunghe. Tosatura la riboprobe seguente Passo 3.6 tramite idrolisi alcalina può neutralizzare questo. Nella nostra esperienza con i giovani campioni, la sonda taglio non è in genere necessaria. Tuttavia, si dovrebbe tenere a mente che parametri come questo può essere fattori che contribuiscono al risultato di un esperimento WISH, e noi suggerire l&#39;esame di queste istruzioni per la risoluzione dei problemi utili già a disposizione del pubblico nella comunità come necessario per affinare i parametri sperimentali per volontà nel proprio di ricerca 12. Oltre alle tecniche tradizionali WISH 12-16, vi è stato un continuo emergere di progressi nelle metodologie desiderio e protocolli alternativi che sono stati formulati. Questi includono nuovi modi di rilevazione del segnale, ad esempio attraverso l&#39;uso di fluorescenza 17-19, a metodi che consentono la localizzazione dei microRNA 20. Anche così, nonostante i molti miglioramenti che sono stati fatti per i metodi di etichettatura cella corrente, l&#39;efficacia di queste procedure sono negato se la macchia (s) non può essere facilmente visualizzato all&#39;interno del campione di interesse in un punto desiderato. Questa limitazione è problematico per i ricercatori soprattutto quando si riferisce alle prime fasi embrionali di ontogenesi zebrafish, che potrebbe potenzialmente portare a lacune nella nostra comprensione dei vari processi di sviluppo che si presentano in questi periodi. Durante il normale sviluppo zebrafish, il sacco vitellino progressivamente diminuire di dimensioni come le età embrioni 11. Pertanto, in queste fasi di sviluppo successive (&gt; 24 ore dopo la fecondazione), WISH colorazione è abbastanza semplice da analizzare perché l&#39;embrione è più grande rispetto al suo adiacente sacco vitellino. Tuttavia, questo non è il caso dalla fase di gemma coda ai primi somitogenesis (quando l&#39;embrionalemassa è posizionato intorno al tuorlo) dove il sacco vitellino opaco volte può oscurare la visualizzazione della macchia. Di conseguenza, il metodo di montaggio piatto è stato concepito per contribuire ad alleviare i problemi di imaging e di analisi dei dati associati alla caratterizzazione dei campioni iniziali zebrafish (schematizzate in Figura 1 e Figura 2), ed è stato ampiamente utilizzato in quanto la fenotipizzazione sistematica di mutazioni genetiche isolate dai primi larga scala schermi genetici 21. Dal momento che l&#39;avvento della tecnica di montaggio piatta, l&#39;analisi dei primi stadi di sviluppo è stato notevolmente migliorato. Una volta che il tuorlo viene rimosso dall&#39;embrione, è possibile appoggiare la embrione su un vetrino con l&#39;orientamento desiderato per l&#39;imaging. Questa posizione bidimensionale permette di visualizzare l&#39;intero embrione in una volta, che elimina la necessità di ruotare il campione. Numerosi tessuti sono situati in ampi settori dell&#39;embrione, comei precursori che formano il sangue e reni. Inoltre, uno può avere bisogno di confrontare i diversi tessuti in via di sviluppo diversi in una sola volta. Montaggio piatta consente al ricercatore di visualizzare contemporaneamente l&#39;intero dominio di questi gruppi di cellule, e, quindi, può essere di grande aiuto quantificazioni come una misura zona per un tessuto o di cellule conteggi. Questa tecnica ha infine contribuito a portare a molte scoperte riguardanti una serie di importanti meccanismi di sviluppo alla base emopoiesi, neurogenesi e organogenesi. Così, una volta padroneggiato, le applicazioni di questa semplice tecnica per i ricercatori sono abbastanza sostanziali. Ad esempio, in uno studio che analizza scelta lignaggio durante emopoiesi, pianeggiante montare le preparazioni di embrioni di zebrafish nelle fasi somite 14 e 18 (ss) sono stati utilizzati per illustrare i cambiamenti che si sono verificati nel modello di espressione del fattore di trascrizione PU.1 dito di zinco tra wild-type e GATA1 morpholino iniettato embrioni 22.Questo metodo ha permesso la rilevazione di un dominio PU.1 espanso a 18 ss, indicando che GATA1 è più probabile regolazione dell&#39;espressione di PU.1 nella massa cellulare intermedia (ICM) intorno a questo punto di tempo. Embrioni montati forfettaria aggiuntiva colorate per i diversi geni eritroidi tra cui gtpbp1 e epsin dimostrato una perdita di espressione di questi geni in mutanti VLT che erano GATA1 - / -. Ulteriori analisi hanno mostrato alcun cambiamento nell&#39;espressione dei geni erythoid come biklf e testhymin che erano noti per essere indipendente dall&#39;attività gata. Pertanto, in combinazione con altri loro risultati sperimentali, è stato rivelato che GATA1 è essenziale nella regolazione del differenziamento delle cellule all&#39;interno lineage mielo-eritroide. In uno studio di sviluppo della cresta neurale, monta piatti sono stati usati per esaminare l&#39;espressione Crestin in mont blanc (mob M610) mutanti in uno studioesaminando i ruoli di mont blanc e la funzione del gene tfap2a 23. Alle 10 e 20 ss, espressione Crestin è stato interamente abrogato in testa ed era diminuita nella regione del tronco di mob mutanti M610 rispetto al normale espressione wild-type, in ultima analisi aiutare questo gruppo per concludere sull&#39;importanza del Monte Bianco e tfap2a regolamento durante la formazione cresta neurale. Inoltre, in termini di organogenesi, supporti piane hanno permesso la scoperta della presenza di domini distinti nel campo progenitore renale fase iniziale dello sviluppo del rene embrionale zebrafish, noto come i pronephros. L&#39;embrione zebrafish fornisce un sistema conservati e ancora anatomicamente semplice per studiare come progenitori renali provocano le unità funzionali nefrone che compongono i pronephros, un processo noto come nefrogenesi 6,7 (Figura 4). Appartamento analisi montare è stata utile per domini dei documenti di riprogenitori nali e per analizzare l&#39;esito delle variazioni del segnalamento RA durante pronephros patterning 6,7 (Figura 5), che in precedenza era sconosciuto. Presi insieme, questi esempi suggeriscono che ci sono davvero molte applicazioni di massima per questo appartamento montare protocollo nello studio dei diversi processi che si verificano durante il normale sviluppo e gli stati malati. Concettualmente, questa procedura piatto di montaggio è abbastanza semplice nel complesso. Tuttavia, le manipolazioni e il grado di finezza necessarie per padroneggiare questo metodo può essere molto impegnativo da padroneggiare, in assenza di dimostrazione visiva. Pertanto, questo protocollo è stato compilato per consentire ai ricercatori, soprattutto quelli nuovi al modello di zebrafish, con la possibilità di capire meglio come eseguire questa tecnica e condividere i nostri consigli sui reattivi in ​​grado di ottimizzare la gestione dei tessuti. Ci auguriamo che questo protocollo consentirà in ultima analisi altri nella comunità per perfezionare le condizioni del campione più ideale per essere used per il premio di imaging, analisi dei dati e la comunicazione dei loro risultati nelle pubblicazioni. In definitiva, questo dovrebbe consentire ai ricercatori di superare gli ostacoli anatomici del zebrafish durante l&#39;embriogenesi iniziale, che può oscurare la presentazione dei risultati sperimentali, e risolvere questi attraverso l&#39;uso di questa tecnica semplice ma significativo.

Il zebrafish, Danio rerio, è diventata un organismo ampiamente utilizzato nello studio della biologia dello sviluppo. Zebrafish sono un tropicali, specie d&#39;acqua dolce vertebrati appartenenti alla famiglia dei ciprinidi. Zebrafish sono stati inizialmente utilizzati per la ricerca ambientale per ottenere informazioni sui pericoli di potenziali sostanze inquinanti dell&#39;acqua, come erano facilmente reperibili, poco costoso e facile da mantenere 1. Negli ultimi 30 anni, il pesce zebra è stato riconosciuto come un docile geneticamente sistema modello vertebrato per una serie di motivi. Zebrafish mostrano un alto livello di conservazione anatomica e fisiologica con vertebrati superiori inclusi mammiferi 2,3. Recenti sequenza annotazione del genoma ha rivelato che circa il 70% dei geni umani hanno almeno una controparte zebrafish 4. Ad esempio, molti geni ortologhi che svolgono un ruolo importante durante lo sviluppo renale sono state riscontrate tra queste specie 5-7. Questo dramatic grado di conservazione per quanto riguarda la biologia cellulare e molecolare ha permesso ai ricercatori di creare modelli per una vasta gamma di malattie umane in zebrafish 8, e zebrafish sono diventati uno strumento prezioso per identificare potenziali terapie farmacologiche utilizzando schermi genetici chimiche 9. Inoltre, il modello zebrafish è in grado non solo di ricapitolare una serie di complessi processi di sviluppo e stati di malattia che si vedono negli esseri umani, ma diversi attributi aggiuntivi anche aumentare il suo appeal come organismo modello per gli studi embriologici. Zebrafish sono ovipari e si riproducono attraverso la deposizione delle uova di trasmissione, che fornisce ai ricercatori un facile accesso agli embrioni dall&#39;inizio della fecondazione 10. Altri vantaggi includono la dimensione dell&#39;embrione, la trasparenza, e rapido, sviluppo esterno 10. Inoltre, gli adulti di zebrafish possesso di elevata fecondità e di solito producono relativamente grandi dimensioni della covata che può variare tra 200-500a settimana, in ultima analisi, consentendo ai ricercatori di condurre esperimenti di throughput elevato, come ad esempio gli schermi chimici fenotipo based, con facilità 9. Anche così, nonostante la pletora di vantaggi che vengono esposti dal modello zebrafish, ci sono sfide che riguardano l&#39;analisi e la comunicazione dei risultati sperimentali ottenuti da primi stadi di sviluppo. In alcuni casi, l&#39;anatomia intrinseca del zebrafish potrebbe oscurare la visualizzazione dei dati propri. Dopo la fecondazione, la cellula iniziale subisce più eventi scissione progredire dello sviluppo 11. Seguendo gastrulation, l&#39;asse embrionale emerge nella fase tailbud (10 HPF) tale che è avvolto intorno al tuorlo 11. Come successivo sviluppo procede attraverso il periodo di segmentazione, il tronco crescerà in massa e anche allungare da allungamento assiale tale che una coda con una porzione del sacco vitellino si estendono dalla massa tuorlo centrale11. Tra il tailbud e 20 stage somite (19 HPF), i tentativi di osservare le caratteristiche specifiche di sviluppo dopo l&#39;utilizzo di diversi protocolli di colorazione, come WISH, può essere difficile sia per visualizzare e fotografare a causa della geometria dell&#39;embrione e l&#39;opacità del il sacco vitellino. Un modo per eliminare questi problemi è quello di rimuovere il tuorlo e poi appiattire l&#39;embrione in un campione bidimensionale che può essere analizzato in modo più semplice. Le seguenti risorse di protocollo e video, forniscono una guida per come deyolk successo e TV montare un embrione seguente fissazione e colorazione, utilizzando l&#39;esempio di uno o due colori WISH colorazione. WISH è una tecnica largamente usata che consente il rilevamento di specifici acidi nucleici in campioni conservati e permette per il sito (s) di espressione genica da rilevare all&#39;interno dei tessuti così. Tecniche WISH sono state ampiamente descritte, e può essere eseguita con vari substrati colori nonché l&#39;influenzasistemi di rilevamento orescent 12-20. Qui forniamo il nostro protocollo WISH modificato utilizzato per gli embrioni di zebrafish tra le tailbud e segmentazione fasi di sviluppo. Protocolli WISH alternativi, tuttavia, sono compatibili con la procedura di montaggio piatto qui descritto, come rilevato in via preliminare del protocollo di seguito. Inoltre, montaggio piatto potrebbe essere utilizzato in combinazione con qualsiasi numero di tecniche di visualizzazione esistenti, come tutta la immunoistochimica mount, o linea cellulare etichette di monitoraggio, che non sono descritti in questo protocollo. Nel complesso, la tecnica di montaggio flat può consentire una migliore analisi superiore e la presentazione dei dati ottenuti da esperimenti con le prime fasi di sviluppo embrionale in zebrafish.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:163px;">50 X E3</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">1 X E3</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Dilute 50 X E3 in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">mesh tea strainer</td>
			<td style="width:96px;">English Tea Store</td>
			<td style="width:119px;">SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">embryo incubation dish</td>
			<td style="width:96px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">35-1005</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">transfer pipet</td>
			<td style="width:96px;">Samco</td>
			<td style="width:119px;">202, 204</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">flat-bottom microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:96px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">87003-300; 87003-298</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glass vial</td>
			<td style="width:96px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">225012</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">1 X Pbst</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Tween-20 stock</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">10X Pbs&#160;</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB11072</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">19210</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 &#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">filter sterilization unit</td>
			<td style="width:96px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430516</td>
			<td style="width:383px;">1L filter system, 0.45 um CA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">MeOH</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">34860-4L</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">proteinase K</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">03-115-879-001</td>
			<td style="width:383px;">Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">HYB+</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11175025910; 11685619910</td>
			<td style="width:383px;">Refer to manufacturer instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">SP6 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11487671001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10881775001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">T3 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11031171001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">RNase 1 inhibitor</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3335399001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycogen</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10901393001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td style="width:383px;">Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">molecular grade distilled water</td>
			<td style="width:96px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">25-055-CM</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">waterbath</td>
			<td style="width:96px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">51221073</td>
			<td style="width:383px;">Model 2831</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">nanodrop</td>
			<td style="width:96px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000c</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;"></td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">formamide</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00600</td>
			<td style="width:383px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">20X SSC</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB13156</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">MAB</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">MABT</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">MAB + 0.1% Tween-20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:163px;">block solution</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 &#176;C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 &#176;C&#8212;if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">FCS (fetal calf serum) stock</td>
			<td style="width:96px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16140089</td>
			<td style="width:383px;">Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">BSA (bovine serum albumin) stock</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00448</td>
			<td style="width:383px;">Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 &#176;C. Store undissolved BSA flakes at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">anti-digoxigenin antibody</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11-093-274-910</td>
			<td style="width:383px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">anti-fluorescein antibody</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11-426-338-910</td>
			<td style="width:383px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">12-well staining dish</td>
			<td style="width:96px;">BD-Falcon</td>
			<td style="width:119px;">35-3225</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">pre-staining&#160; buffer</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">staining solution-purple</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">staining solution-red</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples)..</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">NBT stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6876</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">INT stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I8377</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">BCIP stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B8503</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">DMF (dimethylformaldehyde)</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00450</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycine</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8898</td>
			<td style="width:383px;">&#160;0.1 M glycine, pH 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">small plastic Petri dish</td>
			<td style="width:96px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430589, 430588</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycerol</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7893</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">fine forceps</td>
			<td style="width:96px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:383px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:163px;">lash tool</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">glass slide</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:383px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">glass coverslip</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:383px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">modeling clay</td>
			<td style="width:96px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:383px;">Other craft modeling clay products can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">slide holder</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587-10</td>
			<td style="width:383px;">Cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:96px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645, SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">compound microscope</td>
			<td style="width:96px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">80i, 90i</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization

L&#39;embrione zebrafish è oggi comunemente utilizzato per la ricerca di base e biomedica per studiare il controllo genetico dei processi di sviluppo e di modellare anomalie congenite. Durante il primo giorno di vita, l&#39;embrione di zebrafish progredisce attraverso molte fasi di sviluppo, tra cui la fecondazione, segmentazione, gastrulazione, la segmentazione, e l&#39;organogenesi di strutture come il rene, cuore e sistema nervoso centrale. L&#39;anatomia di un giovane embrione di zebrafish presenta diverse sfide per la visualizzazione e l&#39;analisi dei tessuti coinvolti in molti di questi eventi, perché l&#39;embrione si sviluppa in associazione con una massa tuorlo round. Così, per l&#39;analisi accurata e di imaging di fenotipi sperimentali in campioni embrionali fissi tra il tailbud e 20 somiti stadio (10 e 19 ore dopo la fecondazione (HPF), rispettivamente), come quelli colorati con tutta montare ibridazione in situ (WISH), essa è spesso desiderabile rimuovere l&#39;embrione dal tuorlo besaurito e posizionarlo piatto su un vetrino. Tuttavia, l&#39;esecuzione di una procedura piatto di montaggio può essere noioso. Pertanto, efficace ed efficiente piano di montaggio preparazione è notevolmente facilitata attraverso la dimostrazione visiva della tecnica dissezione, e anche aiutato da utilizzando reagenti che aiutano nella gestione ottimale dei tessuti. Qui, forniamo il nostro protocollo augurio per il rilevamento di uno o due colori dell&#39;espressione genica nell&#39;embrione zebrafish, e dimostrare come la procedura di montaggio piatta può essere eseguita su questo esempio di un campione fisso colorato. Questo protocollo di montaggio piatta è ampiamente applicabile allo studio di molte strutture embrionali che emergono durante primo sviluppo zebrafish, e può essere implementata in combinazione con altri metodi di colorazione eseguite su campioni embrionali fissi.

La procedura di montaggio piatta protocollo comporta la trasformazione di zebrafish dalla sua anatomia normale, in cui l&#39;asse del corpo è avvolto intorno ad un pallone tuorlo in posizione centrale, in una bidimensionale preparazione (Figura 1A). Montare tutto l&#39;imaging del giovane zebrafish è limitata dalla natura di come l&#39;asse embrionale è avvolto intorno al tuorlo. Come risultato, viste laterali o dorsali intero monte esemplari embrionali colorata possono acquisire solo una parte dell&#39;asse o tessuti particolari oscuri (Figura 1B). In confronto, deyolking e appiattimento dell&#39;embrione consente all&#39;intera asse embrionale da visualizzare contemporaneamente (Figura 1B). Queste limitazioni sono dimostrate esaminando un desiderio embrione macchiato che è stato etichettato con riboprobes antisenso per rilevare irx3b (viola), che segna un sottoinsieme dei progenitori renali adiacenti ai metameri 7 a 13, e myod1 (rosso), che etichetta ilsomiti (figura 1b). Il campo di irx3b + progenitori renali è oscurata in tutto il monte vista laterale perché trascrizioni irx3b sono abbondanti nel sistema nervoso centrale, rendendo il campo renale praticamente impossibile da visualizzare con l&#39;angolazione laterale; Inoltre, il campo di irx3b + progenitori renali è solo parzialmente visibile quando l&#39;embrione viene ruotato in una telecamera dorsale perché il campo è avvolto intorno al tuorlo (Figura 1B). Tuttavia, una vista dorsale dello stesso embrione seguente montaggio piatta consente l&#39;intero campo di irx3b + progenitori renali da analizzare in modo semplice rispetto ai somiti lungo il tronco e altre strutture embrionali (Figura 1B). Così, elaborati domini spaziali possono essere idealmente documentati con questo metodo. Diversi passaggi importanti sono coinvolti nella corretta esecuzione della procedura piatto monte. Per eseguire questa technique, la palla tuorlo deve essere prima staccato dall&#39;embrione corretta (Figura 2A), che può essere fatto con strumenti pregiati come un paio di pinze sottili mentre l&#39;embrione è visualizzato utilizzando uno stereomicroscopio. Dopo la rimozione greggio della palla tuorlo, uno strumento di ciglia multa viene utilizzato per raschiare via granuli di tuorlo che sono rimasti attaccato per l&#39;embrione (Figura 2B). La rimozione dei rimanenti granuli tuorlo contribuisce a facilitare la visualizzazione dei tessuti embrionali. Infine, l&#39;embrione deyolked è manipolato per posizionarlo stabilmente su un vetrino (Figura 2C), che permette l&#39;osservazione e aiuti documentazione del campione utilizzando software di imaging e una telecamera collegata al microscopio. Gli strumenti di ciglia sono dispositivi fatti in casa che possono essere costruiti mediante apposizione di una frustata adatto per un puntale utilizzando colla, che possono essere montati su un manico se lo si desidera (Figura 3A, tavolo Materials). Diversi campioni ciglia possono essere prelevati per produrrelash strumenti con caratteristiche leggermente diverse in termini di lunghezza e cono (Figura 3B), che ogni utente può avere diverse predilezioni per una volta che iniziano a sperimentare la procedura di piano di montaggio. Esempi di campioni ciglia sono naturalmente capannone ciglia umani, naturalmente capannone capelli o baffi ispidi animali, e, infine, di varietà sintetiche di ciglia disponibili in commercio trovati nei reparti di vendita al dettaglio di cosmetici. La zona circostante e contenente il campione (s) posizionato su un (Figura 4A) vetrino può essere ripreso per l&#39;analisi ad alta risoluzione. Una combinazione di sonde sono stati usati per etichettare i progenitori renali in via di sviluppo che danno origine al rene nel tipo di embrione selvaggio nelle prime fasi di sviluppo con due colori WISH, e poi pianeggiante montare i preparativi sono stati effettuati per visualizzare i campioni (figura 4B, 4C ). Durante le fasi iniziali somite, progenitori renali sono delimitate in un modello a forma di U da Th.EIR espressione dei trascritti (viola) pax2a circondano il mesoderma parassiale che esprime in concomitanza delta C (DLC) (red) (colonna di sinistra, Figura 4B) 6,7. In confronto, quando trascritti DLC sono stati rilevati con un substrato viola, e sono stati etichettati in combinazione con il Krox20 marcatore hindbrain (rosso), un sottodominio rostrale dei progenitori renali è stata visualizzata che esprime DLC (colonna destra, Figura 4B), come osservato in precedenza 6,7. Montare preparati piatti possono essere utilizzati in modo simile a studiare somitogenesis fasi successive. Nella fase somite 14, abbiamo analizzato l&#39;espressione di marcatori renali pax2a, slc4a4, e SLC12A3 (viola) con smyhc1 (rosso), che segna i somiti (Figura 4C). Queste combinazioni consentono la mappatura dell&#39;intero dominio progenitore renale con pax2a, mentre rivela che un sottogruppo di cellule in un sottodominio expr rostraleessed slc4a4a e si distinguevano per una caudale sottodominio non sovrapposizione dei progenitori renali che hanno espresso SLC12A3. WISH due colori e la preparazione montare piatto sono anche utili per lo studio dei domini cellulari durante l&#39;organogenesi in zebrafish con mutazioni genetiche o altre perturbazioni della esposizione ambientale a piccole molecole 6,7 (Figura 5). NLS zebrafish e mutanti lib presentano mutazioni in aldeide deidrogenasi 1a2 (aldh1a2, precedentemente noto come raldh2), che codifica un enzima necessario per la biosintesi dell&#39;acido retinoico (RA). RA è essenziale per il corretto sviluppo di molti tipi di cellule renali tra cui la formazione di cellule podociti che contribuiscono a rendere il filtro sangue del rene embrionale, noto come glomerulo 6,7. WISH è stato eseguito per etichettare i progenitori podociti con wt1a in concomitanza con la delimitazione delle tha lo sviluppo di somiti con smyhc1 e hindbrain con Krox20 in embrioni di tipo selvatico, NLS embrioni mutanti, embrioni lib mutanti, e gli embrioni trattati con un inibitore chimico ALDH, DEAB (Figura 5). Embrioni con l&#39;espressione aldh1a2 carente mostrato espressione wt1a ridotto rispetto al tipo di embrioni selvatici, mentre gli embrioni DEAB-trattati hanno mostrato una abrogazione delle trascrizioni wt1a (Figura 5, colonna di destra). Presi insieme, questi risultati rappresentativi dimostrano come la tecnica del piatto supporto può essere utilizzato per analizzare e documentare le differenze anatomiche con precisione in embrione, e quindi essere implementato per studi di sviluppo importanti. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" /> Figura 1. Panoramica del montaggio preparazione piattarazione per gli embrioni di zebrafish. A) La procedura di montaggio piatta permette la visione simultanea dei tessuti lungo l&#39;asse embrionale perché la massa tuorlo centrale viene rimosso e l&#39;embrione stabilmente posizionato su una superficie piana. B) Immagini di un intero monte WISH embrione tinto in viste laterali e dorsali, e poi, dopo una preparazione piatto di montaggio è stata condotta. L&#39;embrione è stato colorato con sonde antisenso per rilevare trascritti del gene che codifica per irx3b (viola) e myod1 (rosso). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" /> Figura 2. Schema della procedura di montaggio appartamento in embrioni di zebrafish. A) L&#39;embrione viene prima grossolanamente deyolked per rimuovere la maggior parte della massa tuorlo, poi (B) la superficie ventrale è finemente deyolked per rimuovere i rimanenti granuli tuorlo, edopo aver lavato l&#39;embrione è (C) montato lato dorsale su un vetrino per l&#39;analisi visiva e / o dell&#39;immagine fotografica. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" /> Figura 3. Fotografie di esempio strumenti di ciglia rispetto a pinza sottile. A) strumenti sferza fatti in casa sono stati ripresi insieme a un paio di serie di una pinza sottile, posizionato accanto a un righello metrico per fornire un riferimento. B) Visualizzazione ingrandita della sferza strumenti accanto alle belle pinze, con il riferimento millimetrica prevista lungo la parte superiore della vista . Due diversi strumenti di ciglia vengono mostrati, con l&#39;asterisco (*) utilizzato per contrassegnare la sferza ottenuto da un capannone naturalmente ciglio umano, e doppio asterisco (**) utilizzato per contrassegnare una frustata che è stato ottenuto da un capannone naturalmente felino baffo e tagliata per fare una fine un po &#39;ottuso. In ogni case, la sferza è stato infilato attraverso la punta della pipetta e apposto con vari strati di colla per creare progressivamente una forte tenuta per stabilizzare / ancorare la sferza alla pipetta collegato a un dispositivo di movimentazione. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" /> Figura 4. Caratterizzazione dei cambiamenti evolutivi in campo progenitore renale nel wild type embrione di zebrafish. A) Far scorrere schematica che indica l&#39;area ripreso per analisi in (B, C). B) tipo selvatico embrioni a 1, 3, e 5 somiti fase erano macchiati da due colori WISH per valutare la composizione del campo progenitore renale che dà salire al rene embrionale, o pronephros. (Colonna a sinistra) trascrizioni di codifica il fattore di trascrizione pax2a (tinto in viola) segnano diverse popolazioni nell&#39;embrione, tra cui il p renalecampo rogenitor che emerge dal mesoderma intermedio. Trascrizioni di codifica Notch legante dlc segnano i somiti che si formano dal mesoderma parassiale (tinto in rosso). (Colonna di destra) Quando l&#39;espressione di trascritti DLC (colorati in viola) e hindbrain rhombomere marcatore Krox20 (tinto in rosso) sono esaminati negli stessi embrioni, espressione dlc può essere osservato in un sottodominio rostrale dei progenitori renali adiacenti ai somites 1-5, che è stato oscurato durante la co-colorazione di DLC con pax2a. C) embrioni di tipo selvatico allo stadio 14 somite erano doppia o tripla tinto con una combinazione di un marcatore renale (viola), il marcatore smyhc1 somite (red) , e il hindbrain rhombomere marcatore Krox20 (anche rosso). (Pannello superiore) In questa fase, le trascrizioni pax2a continuano a delimitare i progenitori renali. (Middle, pannelli inferiori) Nel territorio progenitore renale, un sottodominio rostrale è contrassegnatada slc4a4 e trascritti che codificano SLC12A3 segnare un sottodominio caudale. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" /> Figura 5. L&#39;uso di preparati montati piatti a caratterizzare i fenotipi causati da mutazioni genetiche o perturbazioni genetiche chimici che modulano la biosintesi dell&#39;acido retinoico. WISH Il modello di espressione allo stadio 15 somite di wt1a (viola) e smyhc1/krox20 (rosso) è stato confrontato tra i tipi selvatici e gli embrioni con anomalie in acido retinoico (RA) la produzione a causa di difetti di aldeide deidrogenasi 1a2 (NLS e mutazioni lib) o l&#39;inibizione chimica di retinaldehyde deidrogenasi con dietilaminobenzaldehide (DEAB). La riduzione della produzione di RA in lib è leggermente più grave di nls, taleche gli embrioni lib esprimono leggermente ridotta colorazione delle trascrizioni wt1a di simile in scena nls embrioni mutanti, mentre il trattamento DEAB dei tipi selvatici è associata a completa abrogazione di espressione wt1a.

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Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

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