Name: isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes
Uploaded: 2014-06-05T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes at JoVE.com

المؤلفون ممتنون لعلم الأمراض الجزيئية والتصوير الأساسية لمركز جامعة بنسلفانيا NIDDK للدراسات الجزيئية في أمراض الجهاز الهضمي والكبد (P30 DK50306) للحصول على المساعدة مع التصوير. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01 DK-092111) ومن Biesecker مركز سوزان أطفال الكبد وفريد ​​(لRGW) وزمالة من شبكة الطفولة أمراض الكبد البحوث والتعليم (لSK).

يتم تنفيذ الإجراء بأكمله في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. ينبغي تنفيذ جميع أعمال الحيوانية في ظل ظروف إنسانية في إطار بروتوكول وافقت عليها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام المحلي (IACUC). 1. إعداد المعدات وحلول <ol st...

<ol>
	<li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model.">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).</li><li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells.">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).</li><li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats.">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li><li>Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver.">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li><li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+bile+ducts:+Essentials+for+the+clinical+hepatologist.">Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist.</a> J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).</li><li>Carpentier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+ductal+plate+cells+give+rise+to+cholangiocytes,+periportal+hepatocytes,+and+adult+liver+progenitor+cells.">Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).</li><li>Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+polarized+bile+duct+units+from+mouse+liver.">Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).</li><li>Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extra-hepatic+cholangiocyte+cilia+are+abnormal+in+biliary+atresia.">Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).</li><li>Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+extrahepatic+biliary+epithelium:+the+peribiliary+glands+as+progenitor+cell+compartment.">Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment.</a> Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li></ol>

الموصوفة هنا هي تقنية لعزل cholangiocytes نقية من القناة الصفراوية خارج الكبد من الفئران من الفئران من جميع الأعمار، بما في ذلك حديثي الولادة. تقدم هذه التقنية ميزة أن cholangiocytes خارج الكبد يمكن دراستها بمعزل عن cholangiocytes داخل الكبد، ويمكن أن تسهل دراسات لتحديد الاختلافات الرئ?...

أصل وتطور من داخل وخارج الكبد cholangiocytes تختلف بشكل ملحوظ. الكبد يتطور من رتج من المعى الأمامي الأديم الباطن بطني 5. المنطقة الذيلية من رتج تشكل الشجرة الصفراوية خارج الكبد، في حين أن المنطقة الجمجمة يولد الشجرة الصفراوية داخل الكبد 5. وتستمد cholangiocytes القناة داخل الكبد من الخلايا الاصلية في جميع أنحاء لوحة الأقنية في المناطق المحيطة البوابة 6. هذه الخلايا لديها القدرة على التمايز إلى خلايا الكبد أو إما cholangiocytes 6. هذا له آثار سريرية كبيرة بالنظر إلى أن cholangiopathies قد تستهدف على وجه التحديد فئة واحدة من cholangiocytes. على سبيل المثال، يؤثر رتق القناة الصفراوية خارج الكبد في البداية القنوات من حديثي الولادة، في حين Alagille متلازمة يؤثر القنوات داخل الكبد. هناك أوصاف متعددة من عزلة cholangiocytes داخل الكبد والقناة الصفراوية وحدات من الفئران والجرذان. فيvestigators عزلت الخلايا واحد عن طريق عزل مجاري الهواء وثمرة لاحقة، أو عن طريق الهضم والكبد الأجسام المضادة هدم من cholangiocytes معربا عن علامات محددة سطح الخلية 1-4. وقد تم عزل وحدات القناة الصفراوية الوظيفية والاستقطاب من قبل الهضم والكبد حجم الترشيح 7. وحدات القناة الصفراوية هي قادرة على الاستجابة للمحفزات إفرازية وإظهار إفراز السائل 7، في حين ثبت cholangiocytes معزولة لتطوير الهياكل ductular في المختبر 1،2. وتشمل القيود المفروضة على هذه الأساليب الحاجة إلى الخبرة الفنية المتخصصة ومعدات خاصة لنضح الكبد مع الإنزيمات الهضمية. بالإضافة إلى ذلك، هناك خطر التلوث مع خلايا اللحمة المتوسطة 3. وهناك طريقة لعزل خارج الكبد cholangiocytes القناة الصفراوية، وتحديدا من القناة الصفراوية خارج الكبد حديثي الولادة، لم يتم وصفه سابقا. توضح هذه الورقة تقنية مبسطة لعزل الأطفال حديثي الولادةق كذلك خلايا القناة الصفراوية خارج الكبد الكبار على مستويات عالية من النقاء. وهذه التقنية تسهيل دراسة الاختلافات بين cholangiocytes والبحث في آليات الأمراض مثل رتق القناة الصفراوية التي تنطوي على القنوات خارج الكبد داخل وخارج الكبد.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="942">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:323px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DMEM/F12 (1:1)</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td>500ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">FBS</td>
			<td style="width:323px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11150</td>
			<td>25 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MEM with non-essential amino acids</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11140-019</td>
			<td>5 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Insulin-transferrin-selenium</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">51300-044</td>
			<td>5 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Na Pyruvate</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-000-CL</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Chemically-defined lipid concentrate</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11905-031</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">30-002-CI</td>
			<td>5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15750-060</td>
			<td>0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9508-100ml</td>
			<td>0.13ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MEM vitamin solution</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11120-052</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:323px;">Biowhittaker</td>
			<td style="width:119px;">17-605E</td>
			<td>5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-005-CL</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bovine pituitary extract</td>
			<td style="width:323px;">Gemini</td>
			<td style="width:119px;">500-102</td>
			<td>1.1ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">3 3&#39;,5-triiodo-L-thyronine</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6397</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Epidermal growth factor</td>
			<td style="width:323px;">millipore</td>
			<td style="width:119px;">01-101</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Forskolin</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F6886</td>
			<td>5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fungizone</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15290-018</td>
			<td>1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Rat-tail collagen</td>
			<td style="width:323px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">354236</td>
			<td>variable depending on concentration of collagen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:323px;">USB Corporation</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75889</td>
			<td>use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">dH2O</td>
			<td style="width:323px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">NaOH 10N</td>
			<td style="width:323px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ss255-1</td>
			<td>Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">collagenase type XI from Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C7657</td>
			<td>dilute in DMEM and sterile filter before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">trypsin-EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>3 ml, incubate max 10 minutes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">trypsin-EDTA (10x) 0.5%</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15400-054</td>
			<td>3 ml, incubate max 10 minutes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;"></td>
			<td style="width:323px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:323px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645</td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Light source (fiberoptic illuminator)</td>
			<td style="width:323px;">Schott-Fostec</td>
			<td style="width:119px;">Ace EKE LR 92240</td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">12.5 cm straight iris scissors</td>
			<td style="width:323px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">6&#34; non-serrated curved forceps with fine tips</td>
			<td style="width:323px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">4&#34; serrated stainless forceps with fine tips</td>
			<td style="width:323px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes

القناة الصفراوية خارج الكبد وداخل الكبد تختلف تنمويا، ويمكن أن تتأثر بشكل مختلف عن أمراض معينة. ومع ذلك، فإن الاختلافات بين cholangiocytes داخل وخارج الكبد، وبين الخلايا حديثي الولادة والكبار، ليست مفهومة جيدا. طرق لعزل cholangiocytes القناة الصفراوية داخل الكبد من راسخة 1-4. عزل خلايا الأقنية خارج الكبد، خصوصا من حديثي الولادة، لم يتم بعد وصفها، على الرغم من أن هذا من شأنه أن تكون ذات فائدة كبيرة في فهم الاختلافات بين السكان cholangiocyte متميزة في دراسة والأمراض مثل رتق القناة الصفراوية التي يبدو أنها تستهدف القنوات خارج الكبد. الموصوفة هنا هو أسلوب الأمثل لعزل الخلايا القناة الصفراوية خارج الكبد على حد سواء حديثي الولادة والكبار الماوس. هذه التقنية تعطي السكان الخلية نقية مع الحد الأدنى من التلوث من خلايا اللحمة المتوسطة مثل الخلايا الليفية. هذا methoويستند د على إزالة القنوات خارج الكبد والمرارة، تليها تشريح دقيق وتجريف لإزالة طبقات الدهون والخلايا الليفية. هي جزء لا يتجزأ الهياكل في طبقات سميكة من الكولاجين وتربيتها لمدة ما يقرب من 3 أسابيع للسماح ثمرة cholangiocytes في الطبقات الوحيدة، التي يمكن بعد ذلك إعادة trypsinized ومطلي للاستخدام التجريبي.

استخدام هذا البروتوكول النتائج في عزل السكان من الأطفال حديثي الولادة الماوس cholangiocytes خارج الكبد مع نقاء ممتازة، كما يتبين من K19 المناعي تلطيخ (أرقام 2A و 2B)؛ نحقق نتائج مماثلة عزل خلايا من فئران بالغة. وقد لاحظنا أن يستغرق 3 أسابيع لخلايا من القناة الصفراوية ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes at JoVE.com

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

يوصف تقنية لعزل cholangiocytes من القناة الصفراوية خارج الكبد من الفئران حديثي الولادة. يتم تشريح بدقة القنوات، ثم يتم عزل الخلايا عن طريق ثمرة في المواد الهلامية الكولاجين سميكة. وهذه الطريقة توفر أداة مفيدة لدراسة خارج الكبد الصفراء تطوير القناة وعلم الأمراض.

عزل الأطفال حديثي الولادة خارج الكبد Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Neutrophil Isolation Protocol

العدلة عزل بروتوكول

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

عزل الخلايا البطانية صمامي

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

عزلة ذبابة الفاكهة السوداء البطن الخصيات

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

العزلة وثقافة الأطفال حديثي الولادة ماوس العضلية

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

عزلة الجنينية البطيني الخلايا البطانية

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

عزل الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء من الفئران حديثي الولادة

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

يعيش التصوير خلية من فأر الابتدائية حديثي الولادة العضلية بعد الغدانية وLentiviral تنبيغ طريق متحد البؤر المجهري القرص الغزل

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...