Name: isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes
Uploaded: 2014-06-05T13:45:00
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저자는 소화 분자 연구 UPENN NIDDK 센터의 분자 병리 및 이미징 코어 및 이미징에 대한 지원은 간 질환 (P30의 DK50306)에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 (RGW에) 건강의 국립 연구소 (R01 DK-092111)에서와 프레드 수잔 Biesecker 소아 간 센터에서 교부금에 의해 및 (SK에) 어린 시절 간 질환 연구 및 교육 네트워크에서 친교에 의해 지원되었다.

달리 명시되지 않는 한 전체 절차는 실온에서 수행된다. 모든 동물의 작업은 지역 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 프로토콜에서 인도적인 조건 하에서 수행되어야한다. 1. 장비의 제조 및 솔루션 <ol><li> 조직 문화 후드와 인큐베이터 (그림 1A)에 근접 마우스 수술 테이블을 설정합니다. 참고 : 필요한 장비는 해부 현미경, 광원, 12.5 cm 긴 직선 홍채 ?...

<ol>
	<li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model.">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).</li><li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells.">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).</li><li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats.">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li><li>Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver.">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li><li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+bile+ducts:+Essentials+for+the+clinical+hepatologist.">Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist.</a> J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).</li><li>Carpentier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+ductal+plate+cells+give+rise+to+cholangiocytes,+periportal+hepatocytes,+and+adult+liver+progenitor+cells.">Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).</li><li>Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+polarized+bile+duct+units+from+mouse+liver.">Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).</li><li>Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extra-hepatic+cholangiocyte+cilia+are+abnormal+in+biliary+atresia.">Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).</li><li>Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+extrahepatic+biliary+epithelium:+the+peribiliary+glands+as+progenitor+cell+compartment.">Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment.</a> Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li></ol>

여기에 설명하는 것은 신생아를 포함한 모든 연령대의 마우스 마우스의 간외 담관에서 순수한 cholangiocytes을 분리하는 기술이다. 기술 간외 cholangiocytes은 간내 cholangiocytes 별도로 연구 될 수 있다는 장점을 제공하고, 이러한 세포의 집단 사이의 주요 차이점을 확인하는 연구를 용이하게 할 수있다. 우리는 최근하다는 연구가이 방법에 의해 고립 된 붉은 털 로타 바이러스 8에 감염 간외 chola...

내부 및 간외 cholangiocytes의 기원과 발전은 현저하게 다르다. 간은 복부 foregut의 내배엽 5 게실에서 개발하고 있습니다. 뇌 영역은 간내 담도 나무 5를 생성하는 동안 게실의 꼬리 영역은 간외 담도 트리를 형성한다. 간내 덕트 cholangiocytes는 요정 포털 지역 6 유관 플레이트 주변의 전구 세포에서 파생됩니다. 이러한 세포는 간세포 또는 cholangiocytes 6 하나로 분화 할 수있는 능력이있다. 이 cholangiopathies 특별히 cholangiocytes의 하나의 카테고리를 타겟팅 할 수 있습니다 주어진 중요한 임상 적 의미를 가지고 있습니다. Alagille 증후군은 간내 덕트에 영향을 미치는 예를 들어, 담도 폐쇄증은 처음, 신생아의 간외 덕트에 영향을 미칩니다. 마우스 및 래트에서의 간내 cholangiocytes 및 담관 유닛 절연 다중 디스크립션이있다. 에vestigators 덕트 분리 이후의 부산물에 의해 하나의 세포를 고립, 또는 간 소화 항체에 의해 특정 세포 표면 마커 1-4을 표현 cholangiocytes의 풀다운있다. 기능 및 편광 담관 단위 간 소화 크기 여과 (7)에 의해 고립되었다. 담관 유닛 절연 cholangiocytes 시험관 1,2 ductular 구조를 개발하기 위해 도시되었지만, 자극을 분비하고 분비 유체 7을 설명하기 위해 응답 할 수있다. 이러한 방법의 제한은 소화 효소와 간 관류에 대한 전문 기술 전문 지식과 특별한 장비의 필요성이 (가) 있습니다. 또, 간엽 세포 3 오염의 위험이있다. 구체적 신생아 간외 담관에서 간외 담관 cholangiocytes를 분리 방법은 상술되지 않았다. 이 논문은 신생아를 격리 할 수​​있는 간단한 방법을 설명합니다잘 순도 높은 수준의 성인 간외 담관 세포로의. 이 기술은 내부 및 간외 cholangiocytes과 간외 덕트를 포함 담도 폐쇄증과 같은 질병의 메커니즘에 대한 연구 사이의 차이에 대한 연구를 촉진 할 것이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="942">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:323px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DMEM/F12 (1:1)</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11320-033</td>
			<td>500ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">FBS</td>
			<td style="width:323px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11150</td>
			<td>25 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MEM with non-essential amino acids</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11140-019</td>
			<td>5 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Insulin-transferrin-selenium</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">51300-044</td>
			<td>5 ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Na Pyruvate</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-000-CL</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Chemically-defined lipid concentrate</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11905-031</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">30-002-CI</td>
			<td>5ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15750-060</td>
			<td>0.2ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9508-100ml</td>
			<td>0.13ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">MEM vitamin solution</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11120-052</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:323px;">Biowhittaker</td>
			<td style="width:119px;">17-605E</td>
			<td>5ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5mg/ml stock concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:323px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-005-CL</td>
			<td>5ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Bovine pituitary extract</td>
			<td style="width:323px;">Gemini</td>
			<td style="width:119px;">500-102</td>
			<td>1.1ml, used in BEC media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, Stock conc 393ug/ml dilute with ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">3 3&#39;,5-triiodo-L-thyronine</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6397</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Epidermal growth factor</td>
			<td style="width:323px;">millipore</td>
			<td style="width:119px;">01-101</td>
			<td>0.5ml, used in BEC media, 25ug/ml dilute with DMEM F12+1%BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Forskolin</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F6886</td>
			<td>5ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411mg/ml and dilute with DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fungizone</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15290-018</td>
			<td>1ml, used in BEC media and 500 ul in the isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Rat-tail collagen</td>
			<td style="width:323px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">354236</td>
			<td>variable depending on concentration of collagen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:323px;">USB Corporation</td>
			<td align="right" style="width:119px;">75889</td>
			<td>use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">dH2O</td>
			<td style="width:323px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">NaOH 10N</td>
			<td style="width:323px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ss255-1</td>
			<td>Dilute to 1N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">collagenase type XI from Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:323px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C7657</td>
			<td>dilute in DMEM and sterile filter before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">trypsin-EDTA (1x) 0.25%</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>3 ml, incubate max 10 minutes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">trypsin-EDTA (10x) 0.5%</td>
			<td style="width:323px;">Gibco/ Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15400-054</td>
			<td>3 ml, incubate max 10 minutes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;"></td>
			<td style="width:323px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:323px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645</td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Light source (fiberoptic illuminator)</td>
			<td style="width:323px;">Schott-Fostec</td>
			<td style="width:119px;">Ace EKE LR 92240</td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">12.5 cm straight iris scissors</td>
			<td style="width:323px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">6&#34; non-serrated curved forceps with fine tips</td>
			<td style="width:323px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">4&#34; serrated stainless forceps with fine tips</td>
			<td style="width:323px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Other models acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes

간 인트라 및 간외 담관이 발달 별개이며, 차동 특정 질환에 의해 영향을받을 수있다. 그러나, 내부 및 간외 cholangiocytes, 신생아와 성인 세포 사이의 차이가 잘 이해되지 않습니다. 간내 담관에서 cholangiocytes의 분리를위한 방법은 잘 1-4 설정됩니다. 이 별개의 cholangiocyte 집단 간의 차이를 이해하고, 간외 덕트를 대상으로 이와 같은 담도 폐쇄증과 같은 질병을 공부에 큰 도움이 될 것이지만, 특히 신생아에서 간외 유관 세포의 분리, 아직 설명되지 않았습니다. 신생아 및 성인 마우스 양쪽 간외 담관 세포를 분리하기 위해 최적화 된 기술은 여기에서 설명한다. 이 기술은 섬유 아세포와 같은 중간 엽 세포에서 최소한의 오염과 순수한 세포 인구를 산출한다. 이 메 톡시D는 철저한 해부와 지방과 섬유 아세포 층을 제거하는 긁기 다음 간외 덕트 및 담낭의 제거를 기반으로합니다. 구조는 실험적인 사용을 위해 다음 트립신 될 수 있으며, 도금 재 단층에 cholangiocytes의 파생물을 할 수 있도록 약 3 주 동안 콜라겐 배양의 두꺼운 층에 포함됩니다.

신생아 마우스 간외 우수한 순도 cholangiocytes, K19의 면역 형광 염색법에 의해 설명되는 것과 같이 (그림 2A와 2B)의 인구의 분리에이 프로토콜의 결과를 사용하는; 우리는 성인 쥐에서 세포를 분리 비슷한 결과를 얻을 수 있습니다. 우리는 두꺼운 콜라겐 겔에 단일 층을 형성하기 위해 갓 고립 담관의 세포 3 주 정도 관찰했다. cholangiocytes는 절연 도관으로부터 세포 시트를 형성하는 두꺼?...

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Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

신생아 생쥐의 간외 담관에서 cholangiocytes을 분리하는 기술을 설명한다. 덕트 꼼꼼하게 해부 한 다음 세포는 두꺼운 콜라겐 젤의 부산물에 의해 격리됩니다. 이 방법은 간외 담관 개발 및 병리 공부를위한 유용한 도구를 제공합니다.

신생아 간외 Cholangiocytes의 분리

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Research

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