Name: analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney
Uploaded: 2014-08-09T14:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

وأيد هذا العمل من خلال تمويل لRAW مما يلي: المعاهد الوطنية للصحة منح K01 DK083512، DP2 OD008470، وR01 DK100237. مسيرة الدايمات باسل أوكونور كاتب الباحث جائزة منحة # 5 FY12-75. بدء الأموال من جامعة نوتردام كلية العلوم وقسم العلوم البيولوجية؛ وهدية سخية للجامعة نوتردام من إليزابيث ومايكل غالاغر نيابة عن غالاغر الأسرة لتعزيز أبحاث الخلايا الجذعية. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة. نشكر الموظفين من قسم العلوم البيولوجية على دعمهم، ومركز للبحوث اسماك الزرد في نوتردام لتفانيهم المتميز في رعاية ورفاهية لدينا مستعمرة الزرد. أخيرا، نشكر أعضاء مختبر أبحاثنا على تعليقاتهم والمناقشات والرؤى عن هذا العمل.

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هنا، التي وصفناها الأساليب التي تمكن التصور من مكونات قطاع كليون في الزرد الكبار. حقن تقارن ديكستران الفلورسنت يمكن وضع العلامات PCT تفضيلية بسبب خصائص التقامي هذه الخلايا نبيب الداني 30،38. هذه الطريقة لا يمكن أن يؤديها مع مرونة كبيرة بسبب وجود dextrans التي يمكن الحصول عليها مع سرب من تقارن الفلورسنت مختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام dextrans يسين قابل للتثبيت هو وسيلة مريحة وخاصة لتسمية قطاعات معاهدة التعاون بشأن البراءات، وليس مطلوبا من إجراءات وضع العلامات الثانوية. وهذا يتيح الكشف عن إشارة واضحة نسبيا ومتوافق مع العديد من العلامات الأخرى الفلورسنت، immunolabeling، واستخدام خطوط مراسل المعدلة وراثيا. وضع العلامات الفوسفاتيز القلوية يصادف أيضا نبيب الداني، مع تفاعل قوي في معاهدة التعاون بشأن البراءات وأضعف قليلا التفاعل في PST. أخيرا، وتلطيخ DBA يمكن وسم قطاعات أنبوب صغير البعيدة، والتي عرض الفصلaracteristic تشعبت التشكل. مختلف الجزيئات كتين، والتي هي بروتينات ملزمة السكر المنشأ nonimmune، وقد استخدمت على نطاق واسع للتمييز بين شرائح كليون الثدييات 47. ومن المثير للاهتمام أن DBA في الزرد يرتبط مع شرائح أنبوب صغير البعيدة، كما انها تستخدم للاحتفال القنوات جمع في الكلى الثدييات 47. أخذت معا، وهذه الأساليب يمكن استخدامها في تركيبات مختلفة لتوثيق تكوين الكلوي وظيفة. حيث أن جميع هذه الأساليب يمكن استخدامها في الأعمال التحضيرية الكلى كلها، لأنها توفر أدوات لتقييم هيكل كليون وظيفة في جميع أنحاء الجهاز دون الاعتماد كليا على استخدام المزيد من الوقت تستغرق وأساليب مملة، على سبيل المثال، العمل cryosection وimmunolabeling. ومع ذلك، فإن البقع الموضحة في هذه المقالة الأساليب هي قابلة للحياة في cryosection. تحليل عينات Cryosection يولد (مقارنة كله جبل) التي هي أكثر ملاءمة لالمناعية للكشف عن pepti محددةقصر، على الرغم بالطبع هذا النوع من التحليل يتطلب توافر الأجسام المضادة الأولية المناسبة. للأسف الحد رئيسي واحد في العمل مع نموذج حيواني الزرد يبقى توافر الفقراء من الأجسام المضادة. وهكذا تبقى WISH الأكثر استخداما، أي &quot;بأول ل،&quot; إجراء لتحليل التعبير الجيني. أتمنى باستخدام تفاعلات الركيزة BCIP، NBT، و / أو INT لإنتاج رواسب الأرجواني أو الأحمر غير متوافق مع تلطيخ الفلورسنت على cryosections. ويتمثل أحد الخيارات لاستدعاء استخدام الكشف WISH الفلورسنت، وهو الإجراء الذي تم الأمثل لعينات الجنينية الزرد، ويمكن أن تكون مصممة للاستخدام مع الكلى الكبار. وصف الأساليب في هذه المقالة الفيديو يجب أن تسمح لمزيد من التجارب مع تقنيات مثل WISH الفلورسنت في تركيبة مع خطوط الزرد المعدلة وراثيا التي وصفت شرائح الفردية مع مراسل مثل EGFP أو mCherry. بدلا من ذلك، الأساليب المذكورة هنا قد يزيد عدد الجياعد يتم اختبارها في تركيبة مع الأصباغ الحيوية الأخرى، على سبيل المثال، يكتينس الأخرى. وبالتالي، يمكن الاحتجاج مزيد من التكيف وتوسيع الطرق الموضحة هنا لتناسب احتياجات الباحث عن كامل الاستعدادات جبل الكلى والتحليل. على هذا النحو، وهذه الأساليب لها إمكانات العامة للتنفيذ مع نموذج الزرد للدراسات تجديد الجارية، وكذلك في النمذجة مرض وراثي. هناك حاجة ملحة للبحث والعلاجات المبتكرة للالآلام الكلوية. الملايين من الناس يعانون من شكل ما من أشكال أمراض الكلى في كل عام أن ينتج عن أسباب خلقية، الحادة و / أو المزمنة. وعلاوة على ذلك، وانتشار أمراض الكلى في ارتفاع مستمر في جميع أنحاء العالم، مما يجعل هذه الأمراض مشكلة صحية عامة عالمية 14،15. تتوفر العلاجات مثل غسيل الكلى حيث تخدم آلة غسيل الكلى الخارجية لتخليص دم المريض من النفايات الأيضية إذا كلاهم ليست قادرة على أداء هذا الدور. للأسف، هذا التدخل له حدود، والعلاج الجارية ضرورية من أجل البقاء. وعلاوة على ذلك، سوف تحتاج في نهاية المطاف مرضى زرع الكلى، والذي يمكن أن يستغرق سنوات للحصول مرة واحدة يتم وضع المريض على قائمة الانتظار. حتى بعد الحصول على عملية زرع الكلى، العديد من المرضى يعانون من آثار سلبية نتيجة لهذا الإجراء، ويجب أن المعركة هذه الآثار لبقية حياتهم. هذه الصعوبات تظهر الحاجة جادة لتطوير علاجات جديدة لمساعدة إما منع أمراض الكلى أو ربما إلى زيادة تجديد الأنسجة 8،16،52،53. نظرا للقيود أخلاقية واضحة لاستخدام اختبار المواضيع الإنسان في المختبرات الطبية الحيوية، النماذج الحيوانية ضرورية لدراسة الأمراض التي تصيب البشر والتسبب لاختبار علاجات جديدة. نتيجة لتشابهه التشريحية والقرب التطوري، أصبح الماوس النموذج الأكثر استخداما على نطاق واسع من الأمراض التي تصيب البشر 45. ومع ذلك، هناك بعض القيود مع هذا الحيوان، امبعجز جي لتصور تطوير الجهاز في الجسم الحي والتطبيق العملي استكمال شاشات جينية واسعة النطاق. الزرد هي نموذج كائن ذات صلة ومفيدة لدراسة تطوير الجهاز والنمذجة من الأمراض التي تصيب البشر 45،46. في ما يخص الأمراض التي تصيب البشر، homologs الوظيفية في الزرد وجود ما يقرب من 70٪ من جميع الجينات البشرية 54،55. وقد أبرزت الأعمال الأخيرة فائدة الزرد لكثير من مجالات البحث 31،37،56 الكلى. وتشير الدراسات إلى التجديد والإصلاح في الزرد بعد AKI أن تجديد أنبوب صغير الظهارية وneonephrogenesis نوعان من العمليات التي تحدث وتتداخل في جميع أنحاء تجديد timecourse 30،37. وقد استخدمت استخدام المضادات الحيوية أمينوغليكوزيد دعا جنتاميسين باعتبارها النموذج إصابة من خلالها لدراسة نتائج AKI في 29،30،37 الزرد الكبار. على مدى ما يقرب من أسبوعين من اصابة في الفترة التالية جنتاميسين، وtubul الدانيتجديد وفاق، وفي الوقت نفسه النيفرون جديدة تشكل في جميع أنحاء الجهاز 29،30،37. بشكل عام، فإن الآليات التي تنظم تجديد الظهارية لا تزال مثيرة للجدل. في واحدة آلية المقترحة من عملية الإصلاح، هناك حالة الإصابة الحادة الأولي تليها النزع من الخلايا الميتة في التجويف. بعد ذلك، هناك سلسلة من دي التمايز، والانتشار، وأحداث الهجرة، وبعد ذلك تفرق خلايا جديدة، إعادة إسكانها الغشاء القاعدي الجرحى واستعادة وظيفة إلى الموقع المصاب. بدلا من ذلك، واشارت دراسات أخرى أن الخلايا تنشأ من استبدال الخلايا الجذعية / السلف الموجودة داخل الأنابيب كليون. وفيما يتعلق بعملية neonephrogenesis في الزرد، وقد لوحظت المجاميع الخلوية التالي AKI بواسطة حقن جنتاميسين 29،30. هذه المجاميع تنضج لاحقا إلى النيفرون الجديدة التي راسيا في الأنابيب القائمة بالفعل 29،30. القاسم المشترك الذي يوحد كليون الظهارية تجديد وneonephrogenesis هو عامل الغموض الهائل من: في الوقت الحاضر هناك أضعافا مضاعفة المزيد من الأسئلة حول كيفية حدوث هذه المفاخر التجدد من هناك رؤى المتاحة. حتى الآن، ومع ذلك، العديد من خطوط مثيرة للأدلة تدعم فكرة أن الأبحاث تجديد الكلوي باستخدام الزرد يمكن أن توفر في الواقع رؤى المقارنة ذات الصلة في AKI الإنسان التي قد يكون لها أيضا متعدية المباشر المحتمل 56-58. الفحص الكيميائي لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تزيد من انتشار الخلايا الكلوية السلف في الجنين الزرد أدى مؤخرا إلى تحديد deacetylase هيستون المانع ميثيل 4- (phenylthio) -butanoate (m4PTB) 56،57. كشفت إدارة هذا المجمع ليرقات الزرد مع الناجم عن جنتاميسين AKI أن بقاء اليرقات وزادت وتعززت أن انتشار أنبوبي كلوي 56،58. عندما عولجت فئران مع المعتدل الناجم عن نقص التروية AKI مع m4PTB، وتسارع الانتعاش في مساعدينتقم مع انخفاض في كل من ضمور أنبوبي ودورة الخلية القبض على الخلايا المتكاثرة أنبوبي كلوي 58. وتشير هذه النتائج إلى أن مسارات طبيعية المسؤولة عن تطوير الكلى الزرد و / أو استجابة التجدد إلى AKI سيتم حفظها مع الثدييات 56. وهكذا، في حين أن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لندف بصرف النظر آليات تجديد وهما لتحديد مسارات الإشارات التي تشارك ويوفر لهم فهم التفاعلات الزرد واحد سيلة واعدة لتحقيق هذا الهدف المهم في مجال أمراض الكلى. أدوات مثل التسميات خلية كليون الموصوفة في هذا البروتوكول تمثل مجموعة من المقايسات التي يمكن استخدامها لتقييم تكوين الكلوي وظائف في نماذج AKI. علاوة على ذلك، يمكن تطبيقها لوصف النماذج المعدلة وراثيا من مرض في الكلى ويمكن أن توفر طرق لتحديد العلاجات الكيميائية قادرة على تعزيز استعادة هيكل كليون بعد سد الكلويالعمر.

الكلى هو الجهاز المعقد الذي يحقق العديد من الوظائف الفسيولوجية في الجسم. أهم وظيفة الكلى هي إفراز النفايات الأيضية، وتتشابك هذه المهمة بشكل وثيق مع الحفاظ على توازن السوائل. الكلى يؤدي هذه الوظائف من خلال تصفية الدم وتشكيل البول، في حين تنظم بالتزامن ضغط الدم، ومستويات المنحل بالكهرباء، والتوازن الحمضي القاعدي. الأنابيب الظهارية درجة عالية من التخصص ودعا النيفرون بمثابة وحدة وظيفية أساسية في الكلى 1،2. في الفقاريات الكبار، ويتم تنظيم النيفرون عادة في ترتيب ملفوف بإحكام المحيطة بها نظام الصرف الصحي المركزي، مما يسمح لكثير من الأنابيب لحزمة إلى الجهاز صغير إلى حد ما. على سبيل المثال، يمكن أن تحتوي كل كلية البشري أكثر من 1 مليون النيفرون 3. الثدييات الأخرى مثل الماوس تمتلك بناء على أمر من 8-10000 النيفرون في الكلى 4. درجة التعقيد الكلوي تختلف بين هذه الثدييات وغيرها من نبات أخضرebrates بسبب الاختلافات في إجمالي عدد كليون والتصميم المعماري في غضون الكلى. أنواع الفقاريات تشكل ما يصل الى ثلاثة هياكل الكلى المتعاقبة خلال التنمية، ويعرض كل شكل زيادة التعقيد فيما يتعلق الوقف كليون وترتيب: للسليفة الكلوة، mesonephros، والكلوة التالية. هيكل الكلوي الماضي ليتم الاحتفاظ بمثابة الكلى الكبار الجهاز، عادة mesonephros أو الكلوة التالية 2. كل شكل الكلى، ولكن لديه تكوين القائم على كليون 2. النيفرون هو العمود الفقري في الكلى وهو المسؤول عن ترشيح الدم جنبا إلى جنب مع إفراز الأيض واستيعابهم. النيفرون هي هياكل أنبوبية بسيطة تتألف من الخلايا الظهارية ولها تنظيم المجزأ، التي المنفصلة، ​​مجالات متخصصة للغاية من ظهائر متباينة أداء مهام محددة. في ترتيب تدفق الترشيح من خلال كليون، هناك عادة ثلاثة أجزاء رئيسية comprisالبريد لكل وحدة: (1) كرية الكلى، (2) مع أنبوب صغير القريبة والمتوسطة والبعيدة قطاعات، و (3) جمع القناة 1. نبيب الداني هو المسؤول عن استيعاب من المواد المذابة العضوية، وأهمها الجلوكوز والأحماض الأمينية 1. نبيب المتوسطة (أو حلقة من هنلي) هو موقع كبير من الملح والماء التنظيم 1. أخيرا، صقل من الملح والأيونات الأخرى يحدث في نبيب القاصي وجمع القناة ويتم تنظيم كبير من قبل نظام الغدد الصماء 1. من هناك، ويسافر الراشح من خلال الحالب والمثانة، والخروج في نهاية المطاف الجسم كمنتج النفايات 1. فقدان وظائف الكلى يمكن أن تنبع من العديد من الأسباب التي تمنع النشاط كليون العادي. يمكن أن تحدث هذه الأسباب أثناء التطور الكلى، مثل العيوب الخلقية التي تؤدي إلى تشوه من النيفرون 5، أو لأسباب من أنواع مختلفة من الإصابة (النابعة من كلا الوراثية وenvironmeأصول ntal). تصنف على نطاق واسع الإصابات المكتسبة وإصابة حادة في الكلى وكالة (آكي) أو إصابة الكلى المزمن (CKD). AKI ينطوي على خسارة مفاجئة من وظيفة الكلى، غالبا ما ينتج عن نقص التروية أو السم التعرض 6،7. في الثدييات، وإصلاح الظهارية كليون ممكن بعد مثل هذه الإصابات 8، وكثير من الناس تظهر الاستعادة الكاملة من وظيفة الكلى بعد AKI. ومع ذلك، يرتبط AKI أيضا مع ارتفاع معدلات المراضة والوفيات التي تم الإبلاغ عنها عبر واسع 30 - 70٪ النطاق الإصابة 6،7. CKD، في المقابل، ويرتبط مع الفقدان التدريجي لوظائف الكلى الناتج عن سنوات من الضرر لفترات طويلة، التي ترتبط عادة مع التليف 8،9. وعلاوة على ذلك، يوجد تفاعل بين AKI وCKD، وإما يمكن لأحد أن يهيئ الفرد للآخرين 10-12. على سبيل المثال، أولئك الذين عانوا من AKI هم أكثر عرضة للCKD وحتى الموت 13. الإصابة بأمراض الكلى، سواء في الولايات المتحدة وجميع أنحاء العالم، وقد بلغ epideومن المتوقع النسب وهيئة التصنيع العسكري في الارتفاع مع توسع-بالتالي السكان الذين تتراوح أعمارهم بين أن هناك حاجة متزايدة لتحديد التدخلات الطب التجديدي ل14،15 الكلى. على الرغم من معرفة أن المرضى AKI يمكن استرداد، منذ فترة طويلة يعتقد أن الكلى هو الجهاز دون صلاحيات التجدد الفطرية. تم عرض هذه النظرة التقليدية المعدلة بشكل كبير في السنوات الأخيرة 16. وقد أظهرت دراسات التحقيق الضرر الكلوي في الفئران والجرذان بعد AKI أن الخلايا الظهارية كليون أنبوب صغير يمكن أن تتكاثر وإعادة بناء النيفرون الوظيفية 17-20. على الرغم من أن الثدييات تمتلك هذه القدرة على التكيف لتجديد النيفرون، وهناك قيود ملحوظة والاستجابات غير القادرة على التأقلم يمكن أن تسبب التي تؤدي إلى التليف الكلوي وCKD 21. على سبيل المثال، أظهرت دراسة حديثة أن تكرار الاجتثاث الخلايا الظهارية في النيفرون الفئران ارتبط تجديد تقلص والنيفرون، مما يشير إلى تليف الكلى هفعصام محدودة تجديد عتبة 22. ليس هناك أدلة على أن البالغين الكلى الثدييات يشكل النيفرون جديدة لتحل محل تلك المفقودة أو التالفة، وبالتالي تدميرها يؤدي إلى عجز دائم 8،9 كليون. ومن المثير للاهتمام، وبعض الفقاريات لا تستجيب لAKI بواسطة ظهائر تجديد كليون وأيضا إنتاج النيفرون الجديدة، المشار إليها باسم عملية neonephrogenesis أو كليون neogenesis 23. Neonephrogenesis يحدث في الأسماك بعد التعرض للسموم أو بتر جزئي، وشملت نماذج إصابة تاريخيا ذهبية 24،25، البلطي 26، 27 تزلج، الميداكا 28، ومؤخرا، الزرد 29،30. من هذه، الزرد تقدم نموذجا قابلا للتطبيق الأبحاث الجينية لاكتشاف مسارات الخلوية والجزيئية المسؤولة عن تجديد الكلوي. في هذه المقالة الفيديو، ونحن لشرح كيفية تسمية قطاعات كليون في الزرد الكبار. علم التشريح كليون، وميزات الجزيئية،والخصائص الفنية ضرورية للدراسات المستقبلية الكلى ناجحة باستخدام الزرد. الكلى الزرد الكبار هو بنية mesonephros وبطبيعتها هي أقل تعقيدا من حيث عدد كليون وتنظيم من هيكل الكلوة التالية وجدت في الثدييات الكبار، avians، والزواحف 31. ومع ذلك، الزرد تنظيم قطاع كليون يماثل إلى الثدييات، وثقت لأول مرة في الكلى الجنينية استنادا إلى دراسات التعبير الجيني 31-35. النيفرون الجنين الزرد تحتوي على شرائح خطية نبيب التي تشمل نبيب الملتوية القريبة (PCT)، النبيبات الدانية على التوالي (PST)، البعيدة في وقت مبكر (DE)، والقاصي الراحل (DL) 31-35 (الشكل 1). النيفرون الزرد الكبار تمتلك قطاعات أنبوبي مماثلة 30،31،36،37 (الشكل 1). كما يمكن التعرف على معاهدة التعاون بشأن البراءات من قبل النمط الظاهري وظيفية: سوف الخلايا الظهارية في المعاهدة تتضمن مركبات ديكستران fluorescently المسمى (10-70 كيلو دالتون في حجم) موجودة فيالتداول، التي استخدمت في كل من الجنينية والكبار الكلى الزرد لتقييم امتصاص التقامي بواسطة هذه الخلايا نبيب الداني 38-41 (الشكل 1). فارق واحد في قطاعات كليون بين الزرد والثدييات هو أن الزرد تفتقر إلى أنبوب صغير وسيطة، أو حلقة من هنلي 30-37. لأن هذا جزء ظائف في الثدييات للحفاظ على المياه، والزرد هي أنواع المياه العذبة دون حاجة ملحة للتركيز البول، فإنه ليس من المستغرب أن الزرد تفتقر هذه الشريحة 32،33. وهكذا، فإن الحفاظ تكوين كليون العام إلى حد كبير بين الزرد والكلى الثدييات 32،33. وقد مكنت هذه التشابهات الزرد أن يكون أداة بحث فعالة للتحقيق وظائف الجينات وأعرب الكلوي خلال التنموية 32-35،42 تكون الكلية ونموذج العديد من أمراض الكلى 43،44، مما يضيف إلى قائمة كبيرة من الشروط البشرية التي يمكن أن تكون التحقيق باستخدامالزرد 45،46. اليوم، الكلى الزرد الكبار هو نموذج جذاب للدراسات المقارنة للتجديد الكلوي بسبب قابلية الإستطراق لها الجيني والحنك توسيع الموارد التكنولوجية المتاحة لاستجواب وظيفة الجين ومسارات الإشارات في هذا النوع. وقد استخدمت العديد من الدراسات وmesonephros الزرد للتحقيق في آليات تجديد بعد AKI 29،30،37. لمواصلة البحث AKI باستخدام الكلى الزرد الكبار، فمن الضروري أن يكون طرق رائعة لتسمية المناطق كليون مختلفة وأساليب لدراسة وظائف كليون. وقد تم تكييف عدة طرق للتحليل الكلى البالغين من بروتوكولات الكلى الجنينية. حقن داخل الصفاق من ديكستران fluorescently المسمى في الزرد الكبار تسميات ظهارة معاهدة التعاون بشأن البراءات في mesonephros النيفرون عبر الإلتقام 30، كما في الأجنة الزرد 38-41 (الشكل 1). وقد استخدم هذا الأسلوب لvisualizه عندما الأنابيب القريبة استعادة الممتلكات إمتصاص ثانية في أعقاب AKI، والتي تمكن من تقييم واحد استعادة وظيفة فسيولوجية 30 (الشكل 1). ميزة أخرى من كليون نبيب الداني هي أن الخلايا الظهارية في هذا القطاع تمتلك الحدود فرشاة 37 التي تظهر مستويات عالية من النشاط الذاتية الفوسفاتيز القلوية. وهكذا، فإن ظهارة القريبة يمكن أن تكون مترجمة بصريا في الكلى الكبار الزرد باستخدام تقنية القائم على مضان المعروفة باسم ELF- (انزيم المسمى الإسفار) 47 -97. هنا، نحن تصف كيفية تنفيذ المقايسات امتصاص الفلورسنت ديكستران 30،48 في الكلى الكبار الزرد، وذلك للحصول على التقييم الوظيفي للنبيب الداني ورسم خريطة للحجم وملامح هذه الشريحة أنبوب صغير. المقبل، ونحن تصف التقنيات لتسمية المناطق نبيب القريبة من كليون الكبار مع الفلورسنت الفوسفاتيز القلوية التسمية. الثالث، وتبين لنا لأول مرة أن rhodأمين الموسومة كتين Dolichos biflorus راصة (DBA)، والتي تم استخدامها كعلامة العامة للمجاري جمع في الكلى الثدييات 49، يصادف الأنابيب البعيدة للبالغين الكلى الزرد. كما DBA تبادلية لالفوسفاتيز القلوية تلطيخ، هذه التسميات توفر وسيلة للتمييز على نطاق واسع لعموم الداني مقابل تمتد لعموم البعيدة للكليون الكبار الزرد. من خلال تنفيذ هذه البقع الفلورية في كل من جبل بأكمله والمقاطع النسيجية ناظم البرد، فإننا ربط هذه التسميات مع مجالات التعبير عن الجينات نقل المذاب التي تنفرد بتحديد كل قطعة كليون. لذا يحتوي هذا البروتوكول أيضا دليل لإجراءات معالجة الأنسجة تعديل لأنسجة البالغين جبل بأكمله في الموقع التهجين (WISH) في التحليل القائم على موقعنا على الجنين بروتوكول WISH 50. يمكن استخدام هذه الإجراءات في توليفات مختلفة (الشكل 2) لتوثيق الصفات المورفولوجية والوظيفية سو الكبار النيفرون الكلى الزرد. وبالتالي، هذه البروتوكولات يمكن تطبيقها على الدراسات تجديد، وتوصيف المظهري من غيرها من النماذج مرض الكلى، وحتى تستخدم لدراسة تشكيل الكلى الكبار.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

وقد برز نموذج الزرد كنظام ذات الصلة لدراسة تطوير الكلى، وتجديد والمرض. كلا تتكون الكلى الزرد الجنينية والكبار من الوحدات الوظيفية المعروفة باسم النيفرون، والتي يتم حفظها للغاية مع الفقاريات الأخرى، بما في ذلك الثدييات. وقد أظهرت الأبحاث في الزرد مؤخرا أن اثنين من الظواهر المميزة ارشح بعد النيفرون الكبار تكبد الضرر: أولا، هناك تجديد قوي داخل النيفرون القائمة التي تحل محل الخلايا الظهارية أنبوب صغير تدميرها؛ الثانية، يتم إنتاج النيفرون جديدة كليا من الأسلاف الكلى في عملية تعرف باسم neonephrogenesis. في المقابل، البشر والثدييات الأخرى يبدو أن لديها سوى قدرة محدودة لكليون الظهارية التجدد. حتى الآن، الآليات المسؤولة عن هذه الظواهر تجديد الكلى لا تزال ضعيفة مفهومة. منذ الكلى الزرد الكبار على حد سواء الخضوع كليون الظهارية تجديد وneonephrogenesis، أنها توفر الفقرة التجريبية المتميزةdigm لدراسة هذه الأحداث. وعلاوة على ذلك، هناك مجموعة واسعة من الأدوات الوراثية والدوائية المتوفرة في نموذج الزرد التي يمكن استخدامها لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم تجديد الكلوي. واحد جانبا أساسيا من هذه البحوث هو تقييم هيكل كليون وظيفة. يصف هذا البروتوكول مجموعة من تقنيات وضع العلامات التي يمكن استخدامها لقياس وظائف الكلى تكوين اختبار نفرون في الكلى الزرد الكبار. وهكذا، وهذه الأساليب قابلة للتطبيق على نطاق واسع على توصيف المظهري المستقبل الزرد نماذج الكبار إصابة الكلى، والتي تشمل ولكن لا تقتصر على الأنظمة التعرض nephrotoxicant أو الأساليب الوراثية لموت الخلايا المستهدفة مثل nitroreductase بوساطة تقنية الاجتثاث الخلية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الأساليب لدراسة الاضطرابات الوراثية في تشكيل الكلى الكبار ويمكن أن تطبق أيضا على تقييم الوضع الكلوي خلال النمذجة المرض المزمن.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

الكلى الكبار الزرد هو نظام ممتاز للتجديد وأمراض الكلى الدراسات. جانبا أساسيا من هذه البحوث هو تقييم هيكل كليون وظيفة. يصف هذا البروتوكول عدة المنهجيات التي يمكن تنفيذها لتقييم تكوين كليون أنبوب صغير وتقييم استيعاب الكلوي.

تحليل التركيب كليون وظيفة في الكلى اسماك الزرد الكبار

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

زرع نخاع الكلى في الجامعة اسماك الزرد الكبار

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

تشريح هيئات من اسماك الزرد الكبار

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

حقن داخل الصفاق الى اسماك الزرد الكبار

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

زرع الخلايا مباشرة في الكلى من اسماك الزرد الكبار

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

تشريح الكلى اسماك الزرد الكبار

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

في الجسم الحي من Electroporation Morpholinos في شبكية العين اسماك الزرد الكبار

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

في Electroporation المجراة من Morpholinos في الكبار التجديد زعنفة الذيل الزرد

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

جمع الدم لتحليل الكيمياء الحيوية في الزرد الكبار

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging اسماك الزرد الكبار

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

تقييم الزرد وظائف الكلى باستخدام التخليص الفحص الفلورسنت

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...