Name: analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney
Uploaded: 2014-08-09T14:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de financiering aan RAW uit het volgende: National Institutes of Health verleent K01 DK083512, DP2 OD008470 en R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar subsidie ​​award # 5-FY12-75; opstarten fondsen van de University of Notre Dame College of Science and Department of Biological Sciences; en een gulle gift aan de Universiteit van Notre Dame van Elizabeth en Michael Gallagher namens de Gallagher familie te bevorderen stamcelonderzoek. De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, dataverzameling en analyse, besluit tot publicatie, of voorbereiding van het manuscript. Wij danken de medewerkers van de afdeling Biologische Wetenschappen voor hun steun, en het Centrum voor Onderzoek zebravis in Notre Dame voor hun uitstekende inzet in de zorg en het welzijn van onze zebravis kolonie. Tot slot danken wij de leden van onze research lab voor hun opmerkingen, discussies en inzichten over dit werk.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier hebben wij werkwijzen beschreven die de visualisatie van nefron segment componenten in de volwassen zebravissen inschakelen. De injectie van fluorescerende dextran conjugaten maakt preferentiële PCT etikettering vanwege de endocytisch eigenschappen van deze proximale tubulus cellen 30,38. Deze werkwijze kan worden uitgevoerd met een grote flexibiliteit door de aanwezigheid van dextranen die kan worden verkregen met een heel scala aan verschillende fluorescente conjugaten. Bovendien, het gebruik van lysine-fixeerbaar dextranen is een bijzonder gemakkelijke manier om PCT segmenten labelen secundaire labeling procedures niet vereist. Dit is een relatief eenvoudige signaaldetectie en is geschikt voor vele andere fluorescente labels, immunokleuring en het gebruik van transgene reporter lijnen. Alkalische fosfatase etikettering markeert ook de proximale tubulus, met sterke reactiviteit in de PCT en iets zwakkere reactiviteit in de PST. Ten slotte DBA kleuring maakt labeling distale tubulus segmenten die een ch weergevenaracteristic vertakte morfologie. Verschillende lectine moleculen, die suiker bindende eiwitten van immune oorsprong, zijn uitgebreid gebruikt voor zoogdiercellen nefron segmenten 47 onderscheiden. Het is interessant dat DBA in de zebravis correleert met distale tubulus segmenten, zoals het wordt gebruikt om verzamelbuizen markeren zoogdieren nieren 47. Tezamen kunnen deze werkwijzen worden gebruikt in verschillende combinaties renale samenstelling en functie documenteren. Omdat al deze methoden kunnen worden gebruikt geheel nier preparaten, zij instrumenten te nefron structuur en functie gehele orgaan te evalueren zonder geheel te vertrouwen op het gebruik van tijdrovend, vervelend werkwijzen, bijvoorbeeld cryosectie werk en immunokleuring. Echter, de in dit artikel beschreven methoden vlekken levensvatbaar zijn in cryosectie. Cryosectie analyse genereert monsters (in vergelijking met hele mount), dat beter geschikt is voor immunohistochemie specifieke pepti detecteren zijndes, hoewel natuurlijk dit type analyse vereist de beschikbaarheid van passende primaire antilichamen. Er is nog een belangrijke beperking in samenwerking met de zebravis diermodel blijft de slechte beschikbaarheid van antilichamen. Zo WISH blijft de meest gebruikte, dat wil zeggen, &#39;go-to&#39; procedure voor de analyse van genexpressie. WISH met BCIP, NBT, en / of INT substraat reacties op paars of rood neerslag te produceren is niet compatibel met fluorescerende vlekken op vriescoupes. Een mogelijkheid is het gebruik van fluorescente detectie WISH, een procedure die is geoptimaliseerd voor zebravis embryo monsters en kunnen worden aangepast voor gebruik bij een volwassen nier roepen. De beschrijving van de methoden die in deze video artikel moet het mogelijk maken voor verdere experimenten met technieken zoals fluorescerende WISH in combinatie met transgene zebravis lijnen waarin afzonderlijke segmenten zijn voorzien van een verslaggever, zoals eGFP of mCherry. Als alternatief, de methoden hier beschreven Could getest in combinatie met andere vitale kleurstoffen, bijvoorbeeld andere lectinen. Zo kon verdere aanpassing en uitbreiding van de hier beschreven methoden worden ingeroepen om de behoeften van de onderzoeker voor de ganse berg nier voorbereidingen en analyse aan te passen. Als zodanig zijn deze werkwijzen hebben brede mogelijkheden voor de uitvoering van de zebravis model voor continue regeneratie studies en ook genetische ziektemodel. Er is dringend behoefte aan innovatief onderzoek en behandelingen voor nier aandoeningen. Miljoenen mensen lijden aan een vorm van nierziekte elk jaar als gevolg van congenitale, acute en / of chronische oorzaken. Verder is de prevalentie van nierziekte blijft wereldwijd toenemen, waardoor deze ziekten wereldwijd gezondheidsprobleem 14,15. Bewerkingen zoals hemodialyse beschikbaar waarbij een extern dialysemachine dient bloed van metabole afvalstoffen van een patiënt af als hun nieren niet in staat om deze taak. Helaas, Deze ingreep heeft beperkingen, zoals lopende behandeling nodig is om te overleven. Bovendien zullen patiënten uiteindelijk vereisen een niertransplantatie, die jaren kan duren om te ontvangen zodra een patiënt op een wachtlijst wordt geplaatst. Zelfs na het verkrijgen van een niertransplantatie, vele patiënten lijden aantasting als gevolg van de behandeling en moeten deze effecten voor de rest van hun leven vechten. Deze problemen tonen de dringende behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe behandelingen ofwel voorkomen nierziekte of misschien vergroten weefselregeneratie 8,16,52,53. Gezien de duidelijke ethische beperkingen van het gebruik van menselijke proefpersonen in biomedische laboratoria diermodellen essentieel voor de studie van humane pathogenese en het testen van nieuwe behandelingen. Door de anatomische gelijkenis en evolutionaire nabijheid, is de muis de meest algemeen gebruikt model voor humane ziekten 45. Er zijn echter bepaalde beperkingen met dit dier, including onvermogen om orgel ontwikkeling in vivo en de uitvoerbaarheid van de voltooiing van grootschalige genetische screens visualiseren. Zebravis zijn relevant en nuttig modelorganisme voor de studie van orgaanontwikkeling en modellering van menselijke ziekten 45,46. Met betrekking tot ziekten bij de mens, functionele homologen in zebravis bestaan ​​voor bijna 70% van alle menselijke genen 54,55. Recent werk heeft gewezen op het nut van de zebravis voor veel gebieden van onderzoek nier 31,37,56. Studies van regeneratie en reparatie in zebravis na AKI suggereren dat tubulus epitheel regeneratie en neonephrogenesis zijn twee processen die zich voordoen en overlap de hele regeneratie tijdsverloop 30,37. Het gebruik van een aminoglycoside antibioticum gentamicine is gebruikt als een blessure paradigma, waardoor de uitkomsten van AKI studeren in volwassen zebravissen 29,30,37. Meer dan een ongeveer twee weken tijd na letsel door gentamicine, de proximale Tubules regenereren, en ondertussen nieuwe nefronen vormen het hele orgel 29,30,37. In het algemeen zijn de mechanismen die de epitheliale regeneratie reguleren blijven zeer controversieel. In een voorgestelde mechanisme van het herstelproces is er de initiële acute schade event gevolgd door afwerpen van dode cellen in het lumen. Vervolgens is er een aantal de-differentiatie, proliferatie en migratie gebeurtenissen, waarna nieuwe cellen differentiëren herbevolken gewonden basaalmembraan en functieherstel de verwonde plaats. Als alternatief hebben andere studies gesuggereerd dat vervangende cellen ontstaan ​​uit stam / voorlopercellen die binnen nefron buisjes wonen. Met betrekking tot het proces van neonephrogenesis in de zebravis, hebben cellulaire aggregaten waargenomen volgende AKI door gentamicine injectie 29,30. Deze aggregaten later rijpen in nieuwe nefronen die regelrecht in reeds bestaande tubuli 29,30. De rode draad die nefron epitheliale regeneratie en neonephr verenigtogenesis is hun pure mysterie factor: op dit moment zijn er exponentieel meer vragen over hoe deze regeneratieve staaltjes optreden dan er beschikbaar zijn inzichten. Tot op heden, echter, een aantal spannende lijnen van bewijs ondersteunen het idee dat de nieren regeneratie onderzoek met behulp van zebravis inderdaad kan bieden relevante vergelijkende inzichten in de menselijke AKI dat ook kan hebben directe translationeel potentieel 56-58. Chemical screening kleine moleculen die de proliferatie van renale progenitorcellen in de zebravis embryo recent geleid tot de identificatie van de histone deacetylase inhibitor methyl-4-(fenylthio) -butanoate (m4PTB) 56,57 verhogen identificeren. Toediening van deze verbinding bij de zebravis larven met gentamicine geïnduceerde AKI bleek dat larvale overleving stijgt en dat de renale tubulaire proliferatie werd versterkt 56,58. Bij muizen met matige ischemie geïnduceerde AKI werden behandeld met m4PTB, werd hun herstel versneld association met een reductie van zowel tubulaire atrofie en celcyclus van prolifererende renale tubulaire cellen 58. Deze bevindingen suggereren dat de routes die verantwoordelijk zijn voor de normale zebravis nier ontwikkeling en / of de regeneratieve respons op AKI worden geconserveerd met zoogdieren 56. Dus, terwijl verdere studies nodig zijn om te plagen elkaar de mechanismen van regeneratie-namelijk de signaalwegen die betrokken zijn te identificeren en begrijpen van hun interacties-de zebravis biedt een veelbelovende weg om deze belangrijke doelstelling op het gebied nefrologie streven. Instrumenten zoals het nefron cel labels in dit protocol beschreven vertegenwoordigen een groep assays die kunnen worden gebruikt om renale samenstelling en functionaliteit evalueren AKI modellen. Verder, kunnen ze worden toegepast om transgene modellen van nierziekte karakteriseren en kunnen manieren om chemische therapieën kunnen bevorderen herstel van nefron structuur na renale dam te identificerenleeftijd.

De nier is een complex orgaan dat een veelvoud van fysiologische functies in het lichaam vervult. De belangrijkste functie van de nieren is metabolisch afval uitscheiding, en deze taak is nauw verweven met het onderhoud van de vloeistof homeostase. De nier voert deze banen door het filteren van het bloed en de vorming van urine, terwijl gelijktijdig het reguleren van de bloeddruk, elektrolyten en zuur-base-evenwicht. Zeer gespecialiseerde epitheliale tubuli genaamd nefronen dienen als de basis-functionele eenheid van de nier 1,2. Bij volwassen gewervelde dieren, zijn nefronen meestal georganiseerd in een strak opgerold arrangement rondom een ​​centraal afvoersysteem, waardoor voor vele buisjes in te pakken in de vrij kleine orgel. Zo kan elke humane nier meer dan 1 miljoen nefronen 3 bevatten. Andere zoogdieren als de muis te bezitten in de orde van 8-10.000 nefronen per nier 4. De mate van verminderde complexiteit verschilt deze zoogdieren en andere vertwaterdieren gevolg van variaties in totaal nefron aantal en de architectonische ontwerp binnen de nier. Gewervelde species vormen wel drie opeenvolgende nier structuren tijdens de ontwikkeling, en iedere displays toenemende complexiteit wat nefron schenking en opstelling: de pronephros, mesonephros en metanefros. De laatste renale structuur te behouden dient als de volwassen nier orgel-meestal een mesonephros of een metanefros 2. Elke nier vorm, echter, een nefron-gebaseerde samenstelling 2. De nefron is het werkpaard van de nieren en is verantwoordelijk voor bloedfiltratie naast metaboliet secretie en reabsorptie. Nefronen zijn eenvoudige buisvormige structuren bestaat uit epitheliale cellen en hebben een segmentale organisatie, waarbij discrete, zeer gespecialiseerde domeinen van gedifferentieerde epitheel te voeren specifieke taken. In de volgorde van filtraat stroom door het nefron zijn er meestal drie belangrijke onderdelen die comprise elke eenheid: (1) de renale lichaampje, (2) een buisjes met proximale, intermediate, en distale segmenten, en (3) een verzamelen kanaal 1. Het proximale tubulus is verantwoordelijk voor de reabsorptie van organische opgeloste stoffen, met name glucose en aminozuren 1. De tussenliggende tubulus (of lus van Henle) is een belangrijke plaats van zout en water regelgeving 1. Tot slot, fine-tuning van zout en andere ionen optreedt in de distale tubulus en verzamelen van kabelgoten en is sterk gereguleerd door het endocriene systeem 1. Vandaar, het filtraat reist door de ureter en blaas, uiteindelijk verlaten het lichaam als een afvalproduct 1. Het verlies van de nierfunctie kan het gevolg zijn van een veelheid van oorzaken die de normale nefron activiteit te voorkomen. Deze oorzaken kunnen optreden tijdens de ontwikkeling nier, bijvoorbeeld aangeboren afwijkingen die leiden tot misvorming van nefronen 5, of oorzaken van verschillende soorten schade (als gevolg van zowel genetische en environmental afkomst). Verworven letsels zijn over het algemeen gecategoriseerd als acute nierschade (AKI) of chronische nierschade (CKD). AKI gaat een abrupt verlies van de nierfunctie, vaak als gevolg van ischemie of toxine blootstelling 6,7. In zoogdieren, nefron epitheliale reparatie mogelijk na dergelijke verwondingen 8, en veel mensen vertonen een volledig herstel van de nierfunctie na AKI. Echter, AKI ook geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit die zijn gerapporteerd over een breed 30 - 70% incidentie bereik 6,7. CKD daarentegen wordt geassocieerd met progressieve verlies van nierfunctie dat resulteert uit jaren langdurige schade doorgaans geassocieerd met fibrose 8,9. Verder bestaat er een wisselwerking tussen AKI en CKD, hetzij als men een individu kan predisponeren tot overige 10-12. Bijvoorbeeld, degenen die hebben geleden onder AKI zijn vatbaarder voor CKD en zelfs de dood 13. De incidentie van een nierziekte, zowel in de VS en wereldwijd, heeft epidemiolo bereiktmic proporties en zal naar verwachting toenemen als de bejaarde populatie breidt-daarom is er een groeiende behoefte aan regeneratieve geneeskunde interventies te identificeren voor de nieren 14,15. Ondanks de wetenschap dat AKI-patiënten kan herstellen, is het al lang gedacht dat de nier is een orgaan zonder aangeboren regeneratieve krachten. Deze traditionele visie is drastisch herzien in de afgelopen jaren 16. Studies die nierbeschadiging in muizen en ratten na AKI gebleken dat nefron tubulus epitheelcellen kunnen prolifereren en herbouwen functionele nefronen 17-20. Hoewel zoogdieren bezitten dit adaptief vermogen om nefronen regenereren, zijn er opvallende beperkingen en maladaptieve reacties kunnen worden veroorzaakt die leiden tot nier fibrose en CKD 21. Bijvoorbeeld, een recente studie heeft aangetoond dat herhaalde epitheelcellen ablatie in murine nefronen werd geassocieerd met verminderde regeneratie en renale fibrose suggereert nefronen havea beperkt regeneratie drempel 22. Er is geen bewijs dat de volwassen zoogdieren nier vormt nieuwe nefronen om verloren of beschadigde te vervangen, waardoor hun vernietiging leidt tot een permanente nefron tekort 8,9. Interessant is dat sommige gewervelde dieren reageren op AKI door regeneratie van nefron epitheel en ook de productie van nieuwe nefronen, een proces dat ook als neonephrogenesis of nefron neogenese 23. Neonephrogenesis komt voor in vis na blootstelling toxine of gedeeltelijke resectie, en letsel modellen hebben in het verleden onder meer de goudvis 24,25, tilapia 26, skate 27, medaka 28, en meer recent, de zebravis 29,30. Van deze zebravis zorgen voor een levensvatbaar genetisch onderzoek model om de cellulaire en moleculaire routes die verantwoordelijk zijn voor renale regeneratie ontdekken. In deze video artikel laten we zien hoe je nefron segmenten labelen in volwassen zebravissen. Kennis van nefron anatomie, moleculaire eigenschappen,en functionele kenmerken zijn essentieel voor een succesvolle toekomst renale studies met behulp van de zebravis. De volwassen zebravissen nier is een mesonephros structuur en is inherent minder complex qua nefron aantal en organisatie dan de metanefros structuur gevonden bij volwassen zoogdieren, avians, en reptielen 31. Echter, zebravis nefron segmentorganisatie is analoog aan zoogdieren, en werd eerst gedocumenteerd in de embryonale nier gebaseerd op genexpressie studies 31-35. Zebravis embryo nefronen bevatten lineaire tubulus segmenten die de proximale tubulus (PCT) bevatten rechte proximale tubulus (PST), distale vroeg (DE) en distale eind (DL) 31-35 (Figuur 1). Zebravis volwassen nefronen bezitten gelijkaardige buisvormige segmenten 30,31,36,37 (figuur 1). De PCT kan ook worden geïdentificeerd door een functionele fenotype: epitheelcellen in de PCT zal fluorescent gelabelde dextran verbindingen (10-70 kDa groot) aanwezig in het verwerkencirculatie, die is gebruikt in zowel de embryonale en volwassen zebravissen nier endocytotische opname bepalen van deze proximale tubulus cellen 38-41 (Figuur 1). Een verschil in nefron segmenten tussen zebravis en zoogdieren is dat de zebravis ontbreekt een intermediaire tubulus of lus van Henle 30-37; aangezien dit segment functies in zoogdieren om water te besparen, en de zebravis zijn een zoetwatervis zonder een dringende noodzaak om hun urine te concentreren, is het niet verwonderlijk dat de zebravis ontbreekt dit segment 32,33. Zo wordt de totale nefron samenstelling grotendeels geconserveerd tussen de zebravis en zoogdieren nier 32,33. Deze overeenkomsten hebben gesteld zebravis een doeltreffend onderzoeksinstrument de functies van renale expressie gebrachte genen te onderzoeken gedurende ontwikkelings nefrogenese 32-35,42 en modelleren vele nierziekten 43,44, nog afgezien van de aanzienlijke lijst van menselijke aandoeningen die kunnen plaatsvindt onderzocht middelszebravis 45,46. Vandaag de dag, de volwassen zebravissen nier is een aantrekkelijk model voor vergelijkende studies van de nierfunctie regeneratie vanwege de genetische volgzaamheid en het uitbreiden van het gehemelte van de beschikbare technologische hulpmiddelen om de functie van genen en signaalwegen ondervragen in deze soort. Verschillende studies hebben de zebravis mesonephros gebruikt om de mechanismen van regeneratie na AKI 29,30,37 onderzoeken. Voor voortgezet AKI onderzoek met behulp van de volwassen zebravissen nier, is het essentieel om verfijnde methoden om verschillende nefron regio&#39;s en methoden te labelen om nefron functionaliteit enquête hebben. Verschillende methoden voor volwassen nier analyse zijn op basis van embryonale nier protocollen. Intraperitoneale injectie van fluorescent gelabelde dextran in de volwassen zebravissen labelt de PCT epitheel in mesonephros nefronen via endocytose 30, zoals zebravisembryo&#39;s 38-41 (Figuur 1). Deze werkwijze is gebruikt om visualize wanneer proximale tubuli weer hun reabsorbing pand volgende AKI, die een beoordeling van de herstelde fysiologische functie 30 (figuur 1) mogelijk maakt. Een ander kenmerk van het nefron proximale tubulus is dat de epitheelcellen in dit segment een borstel rand 37 die hoge niveaus van endogene alkalische fosfatase activiteit toont bezitten. Aldus kan het proximale epitheel visueel worden gelokaliseerd in de volwassen zebravissen nier met een op fluorescentie gebaseerde techniek die ELF- (Enzyme-gelabelde fluorescentie) -97 47. Hier beschrijven we hoe fluorescerende dextran opname assays 30,48 in de volwassen zebravissen nier, teneinde een functionele beoordeling van de proximale tubulus verkrijgen en kaart de grootte en de contouren van de tubulus segment. Vervolgens beschrijven we technieken om de proximale tubulus gebieden van de volwassen nefron voorzien van het fluorescentie merkteken alkalische fosfatase. Ten derde tonen we voor de eerste keer dat de Rhodamine-gemerkte lectine Dolichos biflorus agglutinine (DBA), die is gebruikt als een algemene merker van de verzamelbuizen in de zoogdierlijke nier 49, markeert de distale tubuli van de volwassen zebravissen nier. Als DBA is wederzijds exclusief voor alkalische fosfatase vlekken, deze labels bieden een manier om in grote lijnen te onderscheiden pan-proximale versus pan-distale delen van de volwassen zebravissen nefron. Tijdens de uitvoering van deze fluorescerende vlekken in zowel hele mount en cryostaat histologische coupes, correleren we deze labels met expressie domeinen van opgeloste transporter genen die eigen is aan elke nefron segment. Daarom is dit protocol bevat ook een handleiding voor de gemodificeerde weefselverwerking procedures voor volwassen weefsel ganse berg in situ hybridisatie (WISH)-analyse op basis van onze embryo WISH protocol 50. Deze procedures kunnen worden gebruikt in verschillende combinaties (figuur 2) te documenteren morfologische en functionele of volwassen zebravissen nier nefronen. Aldus kunnen deze protocollen worden toegepast regeneratie studies, de fenotypische karakterisatie van andere nierziekte modellen en zelfs gebruikt om de vorming van de volwassen nier bestuderen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

De zebravis model heeft zich ontpopt als een relevant systeem om ontwikkeling nieren, regeneratie en ziekte te bestuderen. Zowel de embryonale en volwassen zebravissen nieren uit functionele eenheden bekend als nefronen die sterk geconserveerd met andere vertebraten, waaronder zoogdieren. Onderzoek in de zebravis heeft onlangs aangetoond dat twee kenmerkende verschijnselen transpireren na volwassen nefronen schade lijden: ten eerste, er is robuust herstel binnen bestaande nefronen dat de vernietigde tubulus epitheelcellen vervangt; tweede, zijn geheel nieuwe nefronen geproduceerd uit renale voorouders in een proces dat bekend staat als neonephrogenesis. Daarentegen, mensen en andere zoogdieren lijken slechts een beperkte vermogen tot nefron epitheliale regeneratie hebben. Tot op heden, de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze nier regeneratie verschijnselen blijven slecht begrepen. Omdat volwassen zebravissen nieren ondergaan zowel nefron epitheliale regeneratie en neonephrogenesis, ze bieden een uitstekende experimentele paradigm om deze gebeurtenissen te bestuderen. Verder is er een groot aantal genetische en farmacologische hulpmiddelen op zebravis model dat kan worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanismen die nier regeneratie regelen bakenen. Een essentieel aspect van dit onderzoek is de evaluatie van nefron structuur en functie. Dit protocol beschrijft een reeks labeling technieken die kunnen worden gebruikt om renale samenstelling en testen nefron functionaliteit meten in de volwassen zebravissen nier. Aldus zijn deze werkwijzen zijn breed toepasbaar op de toekomst fenotypische karakterisatie van volwassen zebravissen nierschade paradigma, die omvatten maar zijn niet beperkt tot, nephrotoxicant blootstelling regimes of genetische methoden gerichte celdood zoals nitroreductase gemedieerde ablatie techniek. Verder kunnen deze werkwijzen worden gebruikt om genetisch verstoringen bij volwassen nier vorming bestuderen en ook kan worden toegepast op nierstatus tijdens chronische ziektemodel beoordelen.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Analyse van Nephron samenstelling en functie in de Adult zebravis Kidney

De zebravis volwassen nier is een uitstekend systeem voor renale regeneratie en ziekte studies. Een essentieel aspect van dit onderzoek is de beoordeling van de nefron structuur en functie. Dit protocol beschrijft een aantal methoden die kunnen worden toegepast om nefron tubule samenstelling te beoordelen en om de renale reabsorptie evalueren.

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Transplantatie van Whole nier Marrow in Adult zebravis

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissectie van organen van de Adult zebravis

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Intraperitoneale injectie in de Adult zebravis

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Transplantatie van cellen direct in de nieren van Volwassen zebravis

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Dissectie van de Adult zebravis Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in het regenereren van Adult Zebravissen Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Bloedafname voor biochemische analyse bij volwassen zebravis

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Adult zebravis

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Evaluatie van de zebravis Kidney Functie Met behulp van een TL-Ontruiming Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...