Name: analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney
Uploaded: 2014-08-09T14:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מימון לRAW מבין האפשרויות הבאות: המכון הלאומי לבריאות מעניק K01 DK083512, DP2 OD008470, וR01 DK100237; מרס של # הפרס מענק של 5 FY12-75 הפרוטות הזיל אוקונור Starter Scholar; להתחיל את הכספים מאוניברסיטת נוטר דאם המכללה למדעים והמחלקה למדעים ביולוגיים; ומתנה נדיבה לאוניברסיטת נוטרדאם מאליזבת ומייקל גלאגר מטעם משפחת גלאגר לטפח מחקר בתאי גזע. היו לי המממנים שום תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם, או ההכנה של כתב היד. אנו מודים לצוותות של המחלקה למדעי ביולוגיה על תמיכתם, והמרכז לחקר דג הזברה בנוטרה דאם למסירות היוצאות מן הכלל שלהם בטיפול והרווחה של המושבה דג הזברה שלנו. לבסוף, אנו מודים לחברים של מעבדת המחקר שלנו להערות, דיוניהם ותובנות על עבודה זו.

יש לי המחברים אין לחשוף.

הנה, יש לנו תארנו שיטות המאפשרות ההדמיה של רכיבי קטע נפרון בדג הזברה המבוגר. ההזרקה של conjugates dextran ניאון מאפשרת תיוג PCT מועדף בשל מאפייני endocytic של תאי אבובית הפרוקסימלי אלה 30,38. שיטה זו יכולה להתבצע עם גמישות רבה בשל קיומו של dextrans שניתן להשיג עם להקה של conjugates ניאון שונה. בנוסף, השימוש בdextrans יזין-ניתן לתקן הוא דרך נוחה במיוחד לתייג PCT מגזרים, כפי שנהלי תיוג משניים אינם נדרשים. זה מאפשר זיהוי אות פשוט יחסית והוא תואם עם הרבה מדבקות אחרות ניאון, immunolabeling, ושימוש בקווי כתב מהונדסים. תיוג phosphatase אלקליין גם מסמן את אבובית הפרוקסימלי, עם תגובתיות חזקה בPCT ותגובתיות מעט חלשה יותר בPST. לבסוף, מכתים DBA מאפשר סימון של קטעי אבובית דיסטלי, המציגים characteristic מסועף מורפולוגיה. מולקולות לקטינים שונות, אשר מחייב חלבוני סוכר ממוצא nonimmune, נעשו שימוש נרחב להבחין מגזרי נפרון היונקים 47. זה מעניין, כי DBA בדג הזברה בקורלציה עם מגזרי אבובית דיסטלי, כפי שהוא מנוצל לציון צינורות איסוף בכליות של יונקים 47. יחדיו, יכולות להיות מנוצלים בשיטות אלה בצירופים שונים כדי לתעד הרכב ובתפקוד כליות. מאחר וכל השיטות הללו ניתן להשתמש בתכשירי כליה שלמים, הם מספקים כלים להערכת מבנה נפרון ותפקוד לאורך האיבר ללא כל הסתמכות על השימוש של יותר זמן רב, שיטות מייגע, למשל, עבודת cryosection וimmunolabeling. עם זאת, הכתמים מתוארים במאמר זה הם שיטות קיימא בcryosection. ניתוח cryosection מייצר דגימות (בהשוואה להר שלם) שהם מתאימים יותר לאימונוהיסטוכימיה כדי לזהות pepti הספציפיdes, אם כי כמובן זה סוג של ניתוח דורש הזמינות של נוגדנים ראשוניים מתאימים. למרבה הצער מגבלה העיקרית אחת בעבודה עם מודל החיה דג הזברה נשארת עניה הזמינות של נוגדנים. כך המאחלים נשאר בשימוש נרחב ביותר, כלומר, &#39;ללכת ל, &quot;הליך לניתוח של ביטוי גנים. מאחל באמצעות תגובות מצע BCIP, NBT, ו / או INT לייצר משקעים סגולים או אדומים אינו תואם עם מכתים ניאון על cryosections. אפשרות אחת תהיה להפעיל את השימוש בזיהוי מאחלי ניאון, הליך שעבר אופטימיזציה עבור דגימות עוברי דג הזברה ויכול להיות מותאם לשימוש עם הכליה הבוגרת. התיאור של השיטות במאמר זה וידאו צריך לאפשר לניסויים נוספים עם טכניקות כמו מאחלי ניאון בשילוב עם קווי דג הזברה מהונדסים שבו קטעים בודדים מסומנים עם כתב כגון eGFP או mCherry. לחלופין, השיטות שתוארו כאן could להיבדק בשילוב עם צבעים אחרים חיוניים, למשל, לקטינים אחרים. לפיכך, הסתגלות והרחבת השיטות שתוארו כאן עוד יכולים להיות מופעלת כדי שיתאימו לצרכימים של החוקר להכנות הר שלמים בכליות וניתוח. ככזה, יש להם שיטות אלה פוטנציאל רחב ליישום עם מודל דג הזברה ללימודי התחדשות מתמשכים וגם בדוגמנות מחלה גנטית. יש צורך דחוף במחקר חדשני וטיפולים לייסורי כליות. מיליוני אנשים סובלים מצורה כלשהי של מחלת כליות בכל שנה כתוצאה מגורמים מולדים, אקוטיים, ו / או כרוניים. יתר על כן, השכיחות של מחלת כליות ממשיכה לעלות ברחבי העולם, מה שהופך את המחלות הללו נושא בריאות הציבור עולמי 14,15. טיפולים כגון המודיאליזה זמינים לפי מכונת דיאליזה חיצונית משמשת ללהיפטר הדם של מטופל של פסולת מטבולית אם הכליות שלהם אינן מסוגלות לבצע את התפקיד הזה. לרוע המזל, יש התערבות זו מגבלות, כטיפול מתמשך הוא הכרחי להישרדות. יתר על כן, חולי סופו של דבר דורשים השתלת כליה, אשר יכול לקחת שנים כדי לקבל פעם במטופל שוכבים על waitlist. גם לאחר קבלת להשתלת כליה, חולים רבים סובלים מתופעות לוואי כתוצאה מההליך וחייבים לקרב את ההשפעות הללו לשארית חייהם. קשיים אלה מדגימים את הצורך הרציני לפיתוח טיפולים חדשניים לאו לסייע במניעת מחלת כליות או כדי להגדיל את התחדשות רקמות 8,16,52,53 אולי. בהתחשב במגבלות האתיות הברורה של השימוש במבחן בבני אדם במעבדות ביו, מודלים של בעלי החיים הם חיוניים למחקר של היווצרות מחלה אנושית ועבור הבדיקות של טיפולים חדשים. כתוצאה מהדמיון האנטומי שלה וקרבה אבולוציונית, העכבר הפך המודל הנפוץ ביותר של מחלות בבני אדם 45. עם זאת, יש מגבלות מסוימות עם בעל חיים זה, including חוסר יכולת לחזות התפתחות איבר בגוף חי ומעשיות של השלמת מסכי גנטיים בקנה מידה גדולה. דג הזברה הוא אורגניזם מודל רלוונטי ושימושי ללימוד פיתוח איבר ומודלים למחלות אנושיות 45,46. בכל הקשור למחלות של בני אדם, homologs התפקודי בדג הזברה קיים עבור כמעט 70% מכל הגנים האנושיים 54,55. מחקר שנערך לאחרונה הדגיש את התועלת של דג הזברה לתחומים רבים של 31,37,56 מחקר כליות. מחקרים של התחדשות ותיקון בדג זברה לאחר AKI מצביעים על כך שהתחדשות אפיתל אבובית וneonephrogenesis הם שני תהליכים המתרחשים וחפיפה לאורך כל ההתחדשות timecourse 30,37. השימוש בגנטמיצין נקרא האנטיביוטיקה aminoglycoside נוצל כפרדיגמה פציעה אשר דרך ללמוד את התוצאות של AKI ב29,30,37 דג הזברה מבוגר. במהלך פציעה כשני שבוע תקופה שלאחר מגנטמיצין, טובול פרוקסימליes להתחדש, ובינתיים nephrons החדש להיווצר בכל רחבי האיבר 29,30,37. באופן כללי, המנגנונים המווסתים את התחדשות אפיתל יישארו שנויים במחלוקת. במנגנון מוצע אחד של תהליך התיקון, יש אירוע פציעה אקוטית הראשוני ואחריו השלת תאים מתים לתוך לומן. בשלב הבא, יש סדרה של דה בידול, התפשטות, ואירועי הגירה, לאחר שתאים חדשים לבדל, אכלוס מחדש את הקרום במרתף נפצע ושחזור פונקציה לאתר נפצע. לחלופין, מחקרים אחרים הראו כי תאים חלופיים נובעים מתאי גזע / אב המתגוררים בתוך צינוריות נפרון. באשר לתהליך של neonephrogenesis בדג זברה, אגרגטים הסלולר נצפו AKI הבא על ידי הזרקת גנטמיצין 29,30. אגרגטים אלה מאוחר יותר יבשילו לnephrons החדש שאנך לצינוריות כבר קיימות 29,30. החוט המקשר, המאחד התחדשות אפיתל נפרון וneonephrogenesis הוא גורם המסתורין המוחלט שלהם: כיום יש באופן אקספוננציאלי יותר שאלות על איך מעללי משובי הללו מתרחשים מאשר יש תובנות זמינות. עד כה, עם זאת, כמה שורות מרגשות של ראיות תומכות ברעיון שמחקר התחדשות כליות באמצעות דג הזברה אכן יכול לספק תובנות השוואתיות רלוונטיות לAKI האנושי שיכול להיות גם 56-58 פוטנציאל translational ישיר. הקרנה כימית לזהות מולקולות קטנות המגבירות את השגשוג של תאי אב כליות בעובר דג הזברה, הביא לאחרונה לזיהוי -butanoate מעכב deacetylase היסטון מתיל-4 (phenylthio) (m4PTB) 56,57. מנהל של תרכובת זו לזחלי דג הזברה עם AKI-Induced גנטמיצין גילה כי הישרדות זחל גדלה ושהשגשוג צינורי הכליות היה משופר 56,58. כאשר עכברים עם AKI-Induced איסכמיה המתון טופלו בm4PTB, ההתאוששות שלהם הואצה בassociation עם ירידה בשני מעצר הניוון ומחזור התא צינורי של תאים מתרבים צינורי כליות 58. ממצאים אלה מראים כי המסלולים אחראים להתפתחות תקינה של דג הזברה כליה ו / או תגובת משובי לאקי יהיו נשמרים עם יונקים 56. וכך, בעוד יש צורך במחקרים נוספים כדי להפריד את מנגנוני התחדשות, כלומר לזהות את מסלולי האיתות כי הם מעורבים ולהבין האינטראקציות-דג הזברה שלהם מספקת השדרה מבטיחה אחד להמשיך מטרה חשובה זו בתחום נפרולוגיה. כלים כגון תוויות תא נפרון המתוארות בפרוטוקול זה מייצגים קבוצה אחת של מבחני שיכולים להיות מנוצל כדי להעריך הרכב ופונקציונליות כליות במודלי AKI. יתר על כן, הם יכולים להיות מיושמים לאפיין מודלים מהונדסים של מחלת כליות ועשויים לספק דרכים לזיהוי תרופות כימיות מסוגלות לקדם שיקום של מבנה נפרון לאחר סכר הכליהגיל.

הכליות היא איבר מורכב המקיים מספר רב של פונקציות פיסיולוגיות בגוף. הפונקציה החשובה ביותר של הכליות היא הפרשת פסולת המטבולית, ומשימה זו כרוכה באופן הדוק עם השמירה על הומאוסטזיס נוזל. הכליות מבצעת עבודות אלה על ידי סינון הדם ויצירת שתן, ואילו במקביל ויסות לחץ דם, רמות אלקטרוליטים, ואיזון חומצה בסיס. צינוריות אפיתל מאוד מיוחדות הנקראות נפרונים לשמש כיחידה תפקודית הבסיסית של הכליות 1,2. בבעלי חוליות מבוגרות, nephrons מאורגן בדרך כלל בהסדר מותח ביותר המקיף את מערכת ניקוז מרכזית, ובכך מאפשר לצינוריות רבות לארוז לתוך האיבר קטן למדי. לדוגמא, כל כליה אנושית יכולה להכיל מעל 1 מיליון nephrons 3. יונקים אחרים כמו העכבר להחזיק על סדר 8-10,000 nephrons לכליות 4. מידת המורכבות של כליות שונות בין יונקים אלה וvert האחרebrates בשל שינויים במספר כולל נפרון והפריסה האדריכלית שלהם בתוך הכליות. מינים של בעלי חוליות בצורה רבות כמו שלושה מבנים רצופים בכליות במהלך פיתוח, וכל אחד מציג טופס הגדלת מורכבות בכל קשור לתרומת נפרון והסדר: pronephros, כליה בינים, וmetanephros. מבנה הכליות האחרון להישמר משמש ככליה מבוגרת איבר בדרך כלל כליה בינים או metanephros 2. כל טופס בכליות, לעומת זאת, יש לו הרכב מבוסס נפרון 2. נפרון הוא סוס העבודה של הכליות והוא אחראי על סינון דם יחד עם הפרשת המטבוליט וספיגה. Nephrons הם מבנים צינוריים פשוטים מורכבים מתאי אפיתל ויש לי ארגון מגזרי, שבו תחומים דיסקרטיים, מאוד מיוחדים האפיתלים מובחנים לבצע משימות ספציפיות. בצו של זרימת תסנין דרך נפרון, יש בדרך כלל שלושה חלקים עיקריים שcomprisדואר כל יחידה: (1) גופיף הכליה, (2) אבובית עם הפרוקסימלי, ביניים, ומגזרי דיסטלי, ו (3) צינור איסוף 1. אבובית הפרוקסימלי היא אחראית לספיגה החוזרת של מומסים אורגניים, בעיקר חומצות אמינו וגלוקוז 1. אבובית ביניים (או הלולאה של הנלה) היא אתר מרכזי של רגולציה מלח ומים 1. לבסוף, כוונון עדין של מלח ויונים אחרים מתרחש באבובית דיסטלי וצינור איסוף ומוסדר מאוד על ידי המערכת האנדוקרינית 1. משם, התסנין עובר דרך השופכן ושלפוחית ​​השתן, סופו של דבר לצאת מהגוף כתוצר פסולת 1. אובדן התפקוד הכלייתי יכול לנבוע ממספר רב של גורמים המונעים פעילות נפרון נורמלית. גורמים אלה יכולים להתרחש במהלך התפתחות כליות, למשל, מומים מולדים הגורמים לעיוות של nephrons 5, או גורמים מסוגים שונים של פציעה (שנובעים משני גנטי וenvironmeמקורות פתיחות opening סגירות closures). פציעות שנרכשו מסווגות רחב כפגיעה אקוטית בכליות (AKI) או פגיעה כרונית בכליות (CKD). AKI כרוך אובדן פתאומי של תפקוד הכלייתי, לעתים קרובות כתוצאה מאיסכמיה או רעלן החשיפה 6,7. ביונקים, תיקון אפיתל נפרון הוא אפשרי לאחר פציעות כגון 8, ואנשים רבים להציג שיקום מלא של תפקוד הכלייתי לאחר AKI. עם זאת, AKI קשור גם גבוהה תחלואה ותמותה שדווחו ברחבי 30 רחב - טווח שכיחות 70% 6,7. מחלת כליות כרונית, לעומת זאת, קשורה לאובדן הדרגתי של תפקוד כליות כתוצאה משנים של נזק ממושך, בדרך כלל קשור עם סיסטיק 8,9. יתר על כן, יחסי גומלין קיים בין AKI וCKD, כמו גם אחד יכול להטות מראש פרט ל10-12 האחר. לדוגמא, אלה שסבלו מAKI רגישים יותר למחלת כליות כרונית ואף למוות 13. השכיחות של מחלת כליות, גם בארה&quot;ב ובעולם, הגיעה epideפרופורציות ומיקרופון צפויים לעלות כאוכלוסייה בגילים מתרחבת-לכן יש צורך הולך וגדל לזהות התערבויות רפואת רגנרטיבית לכליות 14,15. למרות הידיעה שחולי AKI יכולים לשחזר, זה כבר זמן רב חשב כי הכליות הוא איבר ללא סמכויות משובי מולדים. השקפה מסורתית זו תוקן באופן דרמטי בשנים האחרונות 16. מחקרים חוקרים נזק כלייתי בעכברים וחולדות לאחר AKI הראו כי תאי אפיתל אבובית נפרון יכולים להתרבות ולבנות מחדש nephrons הפונקציונלי 17-20. למרות יונקים בעלי יכולת הסתגלות זה להתחדש nephrons, יש מגבלות בולטות ותגובות הסתגלות יכולה להיות מופעלות על אשר תוביל לסיסטיק כליות ומחלת הכליות כרוני 21. לדוגמא, מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי אבלציה תאי אפיתל החוזרת ונשנית בnephrons העכברי הייתה קשורה עם התחדשות מצומצמת וnephrons מרמז-סיסטיק כליות havea מוגבל סף התחדשות 22. אין ראיות לכך שהכליות של יונקים הבוגרים מהוות nephrons החדש כדי להחליף את אלה שאבדו או ניזוקו, ובכך ההרס שלהם מוביל לגירעון נפרון 8,9 קבוע. מעניין, כמה בעלי חוליות מגיבות לאקי על ידי התחדשות epithelia נפרון וגם על ידי הפקת nephrons החדש, תהליך המכונה neonephrogenesis או נפרון neogenesis 23. Neonephrogenesis מתרחש בדגים לאחר חשיפת רעלן או כריתה חלקית, ומודלי פציעה באופן הסטורי כללו את דג הזהב 24,25, אמנון 26, להחליק 27, medaka 28, ולאחרונה, דג הזברה 29,30. מתוכם, דג הזברה לספק מודל מחקר גנטי קיימא לגלות מסלולים התאיים ומולקולריים אחראים להתחדשות כליות. במאמר זה וידאו, אנו מדגימים כיצד לתייג מגזרי נפרון בדג זברה מבוגרת. ידע של האנטומיה נפרון, תכונות מולקולריות,ומאפיינים פונקציונליים חיוניים למחקרי כליות עתיד מוצלחים באמצעות דג הזברה. כליות דג הזברה מבוגרת היא מבנה כליה בינים והוא מטבעו פחות מורכב במונחים של מספר נפרון וארגון מאשר מבנה metanephros מצא ביונקים בוגרים, avians, וזוחלים ביום 31 ב. עם זאת, ארגון קטע נפרון דג הזברה הוא דומה ליונקים, ותועד לראשונה בכליה העוברית מבוססת על מחקרי ביטוי גני 31-35. nephrons עובר דג הזברה מכיל מקטעים ליניארי אבובית הכוללים הפרוקסימלי אבובית המפותלת (PCT), אבובית הפרוקסימלי ישרה (PST), דיסטלי המוקדם (DE), ודיסטלי מאוחר (DL) 31-35 (איור 1). nephrons המבוגר דג הזברה יש מגזרים צינורי דומים 30,31,36,37 (איור 1). PCT יכול גם להיות מזוהה על ידי פנוטיפ פונקציונלי: תאי האפיתל בPCT ישלבו תרכובות שכותרתו fluorescently dextran (10-70 KDA בגודל) נוכחת בבמחזור, אשר שימוש בו בשתי כליות דג הזברה העוברית ובוגרות להעריך ספיגת endocytic על ידי התאים אלה אבובית הפרוקסימלי 38-41 (איור 1). הבדל אחד במגזרי נפרון בין דג הזברה ויונקים הוא שדג זברה חסר אבובית ביניים, או לולאה של Henle 30-37; מאז פונקציות מגזר זה ביונקים כדי לחסוך במים, ודג זברה הן מיני מים מתוקים בלי דחיפות להתרכז השתן שלהם, אין זה מפתיע שדג זברה חסר מגזר זה 32,33. לפיכך, הרכב נפרון הכולל נשמרת במידה רבה בין דג הזברה והכליות של יונקים 32,33. קווי דמיון אלה אפשרו דג הזברה להיות כלי מחקר יעילים כדי לחקור את הפונקציות של גנים הביעו כליות במהלך nephrogenesis התפתחותית 32-35,42 ולהדגים מחלות כליה רבות 43,44, ובכך מוסיף לרשימה המשמעותית של תנאים אנושיים שיכול להיות נחקר באמצעותדג הזברה 45,46. היום, בכליות דג הזברה מבוגרת היא מודל אטרקטיבי ללימודים השוואתיים של התחדשות כליות עקב tractability הגנטי שלו וחיך הרחבת של משאבים טכנולוגיים העומד לרשות לחקור את תפקוד גן ומסלולי איתות במין זה. מספר מחקרים השתמשו בכליה ביני דג הזברה כדי לחקור את המנגנונים של התחדשות לאחר AKI 29,30,37. למחקר AKI המשיך באמצעות כליות דג הזברה מבוגרת, זה הכרחי יש שיטות מעודנות לתייג אזורי נפרון שונים ושיטות סקר פונקציונלי נפרון. מספר שיטות לניתוח בכליות מבוגר הותאמו מפרוטוקולי כליה עובריים. זריקת intraperitoneal של dextran שכותרתו fluorescently בדג הזברה המבוגר תוויות האפיתל PCT בnephrons כליה בינים באמצעות אנדוציטוזה 30, כמו בעוברי דג הזברה 38-41 (איור 1). שיטה זו נעשתה שימוש כדי visualizדואר כאשר צינוריות הפרוקסימלי חזרה את רכושם reabsorbing הבאות AKI, המאפשר הערכה אחת של פונקציה פיזיולוגית המשוחזר 30 (איור 1). תכונה נוספת של אבובית הפרוקסימלי נפרון היא שתאי האפיתל במגזר זה יש גבול מברשת 37 שמראה רמות גבוהות של פעילות phosphatase אלקליין אנדוגני. לפיכך, האפיתל הפרוקסימלי יכול להיות מקומי חזותי בכליות דג הזברה מבוגרות תוך שימוש בטכניקת הקרינה מבוססת הידוע בשם (הקרינה אנזים שכותרתו) ELF- -97 47. כאן, אנו מתארים כיצד לבצע מבחני ספיגת dextran ניאון 30,48 בכליות דג הזברה מבוגרות, כדי להשיג הערכה תפקודית של אבובית הפרוקסימלית ולמפות את הגודל וקווי מתאר של קטע אבובית זה. בשלב הבא, אנו מתארים טכניקות לתייג אזורי אבובית הפרוקסימלי של נפרון המבוגר עם phosphatase אלקליין תווית הניאון. שלישית, אנו מציגים בפעם הראשונה שRhodאמין מתויג הקטינים Dolichos biflorus agglutinin (DBA), אשר שימש כסמן כללי של צינורות האיסוף בכליות של היונקים 49, מסמן את המבנים צינוריים של הכליה דג הזברה מבוגרת. כDBA הוא מוציאים לצביעת phosphatase אלקליין, תוויות אלה מספקים דרך להבחין מחבת-הפרוקסימלי לעומת מתיחות מחבת-הדיסטלי של נפרון דג הזברה המבוגר באופן רחב. אורך יישום כתמי ניאון אלה בשני הר שלם וסעיפים היסטולוגית cryostat, אנו לתאם תוויות אלה עם תחומים ביטוי של גני טרנספורטר המומס כי לזהות כל מגזר נפרון. לכן פרוטוקול זה מכיל גם מדריך לנהלים שונה רקמת עיבוד להר שלם רקמות בוגרות בכלאה באתר ניתוח (לוואי) המבוססים על פרוטוקול מאחלי העובר שלנו 50. נהלים אלה יכולים להיות o משמשים בשילובים שונים (איור 2) לתיעוד תכונות מורפולוגיות ותפקודיותnephrons הכליה דג הזברה המבוגר f. כך, יכולים להיות מיושמים בפרוטוקולים אלה ללימודי התחדשות, האפיון פנוטיפי של מודלים מחלת כליות אחרים, ואפילו בשימוש ללמוד היווצרות של הכליה מבוגרת.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

מודל דג הזברה התפתח כמערכת רלוונטית ללימודי פיתוח בכליות, התחדשות ומחלה. שני כליות דג הזברה העוברית ובוגרות מורכבות מיחידות פונקציונליות הידוע בשם nephrons, אשר שמורות ביותר עם חוליות אחרות, לרבות יונקים. מחקר בדג הזברה הוכיח לאחרונה כי שתי תופעות ייחודיות להתרחש לאחר nephrons המבוגר להיגרם נזק: ראשון, יש התחדשות חזקה בתוך nephrons הקיים המחליף את תאי האפיתל אבובית נהרסו; שני, nephrons החדש לחלוטין המיוצר מאבות כליות בתהליך המכונה neonephrogenesis. בניגוד לכך, נראה שבני אדם ויונקים אחרים יש יכולת מוגבלת בלבד להתחדשות אפיתל נפרון. נכון להיום, את המנגנונים אחראים לתופעות התחדשות כליות אלה יישארו הבינו היטב. מאז כליות דג הזברה מבוגרות לעבור שתי התחדשות אפיתל נפרון וneonephrogenesis, הם מספקים סעיף ניסיוני מצטייןdigm ללמוד את האירועים הללו. יתר על כן, יש מגוון רחב של כלים גנטיים ותרופתיים זמינים במודל דג הזברה, שניתן להשתמש כדי להתוות מנגנונים התאיים ומולקולריים המווסתים את התחדשות כליות. היבט חיוני אחת של מחקר כזה הוא ההערכה של מבנה נפרון ותפקוד. פרוטוקול זה מתאר קבוצה של טכניקות תיוג כי ניתן להשתמש כדי לאמוד את הרכב כליות ופונקציונליות נפרון המבחן בכליות דג הזברה המבוגר. לפיכך, שיטות אלה הן נרחב החלים על האפיון פנוטיפי העתיד של פרדיגמות מבוגרות דג הזברה פגיעה בכליות, אשר כוללות, אך אינם מוגבלות, למשטרי חשיפת nephrotoxicant או שיטות גנטיות של מוות של תאים ממוקדים כגון טכניקת אבלציה תא nitroreductase בתיווך. יתר על כן, ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי ללמוד הפרעות גנטיות בהיווצרות כליה מבוגרת ויכולות להיות מיושמות גם כדי להעריך את מצב כליות במהלך דוגמנות מחלה כרונית.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

הכליות מבוגרות דג הזברה היא מערכת מצוינת ללימודי התחדשות ומחלת כליות. היבט חיוני של מחקר כזה הוא ההערכה של מבנה נפרון ותפקוד. פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות שניתן ליישם על מנת להעריך הרכב אבובית נפרון ולהעריך את ספיגה של כליות.

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissection של איברים מן דג הזברה למבוגרים

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

הזרקה לתוך intraperitoneal דג הזברה למבוגרים

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

השתלה של תאים ישירות לתוך הכליה של דג הזברה למבוגרים

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Dissection של הכליה דג הזברה למבוגרים

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך למבוגרים התחדשות זנב סנפיר דג הזברה

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

הדם אוסף של ניתוח ביוכימי דג הזברה למבוגרים בלבד

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging דג הזברה למבוגר

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

הערכה של תפקוד כליה דג הזברה באמצעות assay עמילות פלורסנט

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...