Name: analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney
Uploaded: 2014-08-09T14:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

이 작품은 다음에서 RAW로 자금에 의해 지원되었다 : 건강의 국립 연구소는 K01 DK083512, DP2 OD008470 및 R01 DK100237을 부여; 십센트 바 오코너 초보 학술 보조금 수상 # 5 - FY12-75 년 3 월; 과학 및 생물 과학학과의 노트르담 대학의 대학에서 기금을 시작; 그리고 갤러거 가족을 대신하여 엘리자베스와 마이클 갤러거에서 노트르담 대학에 관대 한 선물은 줄기 세포 연구를 촉진한다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비에서 어떤 역할을 없었다. 우리는 그들의 지원을 위해 생명 과학의 부서의 직원을 감사하고, 우리의 제브라 피쉬 식민지의 보호 및 복지에 뛰어난 헌신 노트르담 Zebrafish의 연구 센터. 마지막으로, 우리는이 작품에 대한 자신의 의견, 토론과 통찰력에 대한 우리의 연구 실험실의 구성원을 감사드립니다.

저자가 공개하는 게 없다.

여기서는 성인 지브라 피쉬의 네프론 세그먼트 성분의 시각화를 가능하게 방법을 설명 하였다. 형광 덱스 트란 복합체의 주입이 근위 세뇨관 세포 30,38의 세포 내 이입 특성으로 인해 특혜 PCT 라벨링을 할 수 있습니다. 이 방법 때문에 다른 형광 결합체 떼 얻을 수있다 덱스 트란의 존재를 매우 유연 수행 될 수있다. 보조 라벨 절차가 요구되지 않기 때문에 또한, 라이신 정착 덱스 트란의 사용은, PCT 세그먼트에 레이블 특히 편리하다. 이것은 비교적 간단한 신호 검출을 가능하게하고 많은 다른 형광 라벨, immunolabeling 및 트랜스 제닉 리포터 라인의 사용과 호환 가능하다. 알카라인 포스파타제는 또한 PST에서 PCT 강한 반응성이 약간 약한 반응성, 근위 세뇨관을 표시합니다. 마지막으로, DBA 염색 채널을 표시 원위 세뇨관 세그먼트의 표시를 할 수 있습니다aracteristic는 형태를 분기. 면역성 원산지 설탕 결합 단백질 아르 다양한 렉틴 분자, 포유 동물 네프론 세그먼트 47을 구별하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. 그것은이 포유 동물의 신장 47에서 수집 덕트를 표시하는 데 사용되는 것과 제브라 피쉬의 DBA는 원위 세뇨관 세그먼트와 관련이 있다는 흥미로운 일이다. 종합적으로, 이들 방법은 조성물 및 신장 기능을 문서화하는 다양한 조합으로 사용될 수있다. 이들 방법 모두는 전체 신장 제제에 사용될 수 있기 때문에, 이들은 전적으로 더 시간 소모적 인 지루한 방법, 예를 들면, 동결 절단 (Cryosections) 작업과 immunolabeling의 사용에 의존하지 않고도 장기에 걸쳐 네프론의 구조와 기능을 평가하는 툴을 제공한다. 그러나,이 방법 문서에서 설명 얼룩을 동결 절단 (Cryosections)에서 실행 가능하다. 동결 절단 (Cryosections) 분석은 면역 조직 화학 특정 pepti을 감지하기에 더 적합합니다 (전체 마운트에 비해) 샘플을 생성DES는 물론 비록 이러한 유형의 분석은 적절한 일차 항체의 가용성을 필요로한다. 불행하게도 제브라 피쉬 동물 모델 작업에서 하나의 주요 제한은 항체의 가난한 가용성 남아있다. 따라서 WISH는, 즉, 가장 널리 사용되는 유지 &#39;고우에&#39;유전자 발현 분석을위한 절차. 보라색 ​​또는 적색 침전물을 생성 BCIP, NBT, 및 / 또는 기판 INT 반응을 이용하면 WISH 저온부에 형광 염색법과 호환되지. 하나의 옵션은 형광 검출 WISH, 제브라 피쉬 배아 샘플을 위해 최적화되었으며 성인 신장 함께 사용하도록 맞추어 질 수있는 절차의 사용을 호출하는 것이다. 이 비디오 문서의 방법에 대한 설명은 각각의 세그먼트가 같은 eGFP는 또는 mCherry 등의 기자로 표지 된 형질 전환 제브라 피쉬 라인과 함께 형광 WISH 같은 기술을 추가 실험을 허용해야합니다. 대안 적으로, 방법은 여기에 기재된 coul다른 중요한 염료, 예를 들어, 다른 렉틴와 함께 테스트를 할 거라고. 따라서, 상기 적응 및 여기에 기술 된 방법의 확장은 전체의 마운트 신장 준비 및 분석을위한 연구자의 필요에 따라 호출 될 수있다. 따라서,이 방법은 지속적인 재생 연구 제브라 피쉬 모델 구현 및 유전 적 질병 모델링 광범위한 잠재력을 가지고있다. 신장 고통 혁신적인 연구 및 치료에 대한 필요성이 높아지고있다. 수백만 명의 사람들이, 선천성 급성 및 / 또는 만성 원인의 결과 매년 신장 질환의 일부 양식에서 고통 받고 있습니다. 또한, 신장 질환의 유병률은 이러한 질병 글로벌 공중 보건 문제 (14, 15)을 전 세계적으로 증가하고 있습니다. 외부 투석 기계가 자신의 신장이이 역할을 수행 할 수없는 경우 신진 대사 폐기물의 환자의 혈액을 제거하는 역할을함으로써 이러한 혈액 투석 등의 치료를 사용할 수 있습니다. 불행하게도지속적인 치료가 생존을 위해 필요하므로이 개입, 제한 사항이 있습니다. 또한, 환자는 결국 환자가 대기자 명단에 배치되면받을 수 년이 걸릴 수있는 신장 이식을 필요로 할 것이다. 심지어 신장 이식을 획득 한 후, 많은 환자는 프로 시저의 결과로 부작용을 고통과 그들의 삶의 나머지 부분에 대한 이러한 효과를 전투해야합니다. 이러한 어려움은 신장 질환을 예방 혹은 조직 재생 8,16,52,53을 확대하는 데 도움이 중 하나를 새로운 치료법의 개발에 대한 심각한 필요성을 보여줍니다. 생물 의학 실험실에서 인간 피험자의 사용의 명백한 윤리적 한계를 감안하면, 동물 모델은 인간 질병의 발병 기전 연구를위한 새로운 치료법의 테스트를 위해 필수적이다. 그 해부학 적 유사성 진화 근접성 결과, 마우스는 인간의 질병 (45)의 모델에 가장 널리 사용되고있다. 그러나이 동물과 특정 제한 includ,가무능력을 보내고 것은 생체 내 및 대규모 유전자 스크린을 완성 실용성 장기 개발을 시각화한다. 제브라 피쉬는 인간의 질병 45, 46의 장기 개발 및 모델링 연구를위한 적절하고 유용한 모델 생물이다. 인간의 질병에 관해서는, 제브라 피쉬의 기능 동족체는 인간의 모든 유전자 (54, 55)의 약 70 % 존재한다. 최근 연구는 신장 연구 31,37,56 여러 지역의 제브라 피쉬의 유용성을 강조하고있다. AKI 후 제브라 피쉬의 재생 및 수리의 연구는 세관 상피 재생 및 neonephrogenesis가 발생 30,37 timecourse 재생에 걸쳐 중복이 프로세스가 있음을 시사한다. 아미노 글리코 사이드 항생제라는 겐타 마이신의 사용은 성인 제브라 피쉬 29,30,37에서 AKI의 결과를 연구를 통해 부상 패러다임으로 활용되고있다. 겐타 마이신에서 약 2 주간의 기간에 다음과 같은 부상에 걸쳐, 근위부 tubul에스 다시 생성하고, 그 사이에 새로운 네프론은 장기 29,30,37에 걸쳐 형성한다. 일반적으로, 상피 재생을 조절하는 메커니즘이 매우 논란 남아있다. 복구 프로세스의 일 제안 된기구에서, 루멘으로 사균의 벗기이어서 초기 급성 부상 이벤트가있다. 다음으로, 새로운 세포가 분화 한 후, 역 분화, 증식 및 마이그레이션 일련의 이벤트, 부상 기저막을 다시 채우기 및 부상 사이트에 기능을 복원을있다. 또한, 다른 연구는 대체 세포가 네프론의 세관 내에 상주 줄기 / 전구 세포에서 발생하는 것을 제안했다. 제브라 피쉬에 neonephrogenesis의 프로세스에 관해서는, 세포 응집체 29,30 겐타 마이신 주입하여 다음 AKI 관찰되었다. 이 집계는 나중에 기존 세관 (29, 30)에 연결 (plumb) 새로운 네프론에 성숙. 네프론 상피 재생 및 neonephr을 통합하는 공통점ogenesis는 깎아 지른듯한 미스터리 요소 : 현재이 재생 업적을 사용할 수 통찰력이보다 발생 방법에 대한 기하 급수적으로 더 많은 질문이 있습니다. 그러나 현재까지의 증거 몇 가지 흥미로운 라인은 제브라 피쉬를 사용하여 신 재생 조사 사실도 직접 번역 잠재적 인 56-58가있을 수 있습니다 인간의 AKI에 관련 비교 통찰력을 제공 할 수있는 개념을 지원합니다. 화학적 스크리닝 최근 히스톤 데 아세틸 라제 억제제 메틸 4 - (페닐 티오) -butanoate (m4PTB) 56,57 식별되었다 제브라 피쉬 배아 신장 전구 세포의 증식을 증가 작은 분자의 동정을 행 하였다. 겐타 마이신에 의한 AKI와 제브라 피쉬의 유충이 화합물의 관리 애벌레의 생존이 증가하고 신 세뇨관 증식 (56, 58)를 향상되었습니다 것으로 나타났습니다. 중간 허혈 유발 AKI와 마우스가 m4PTB로 처리되었을 때, 자신의 회복 ASSOC 가속화되었다세뇨관 세포 증식 (58)의 양쪽 관상 위축 및 세포주기 정지에 감소 iation. 이러한 연구 결과는 정상적인 제브라 피쉬의 신장 개발 및 / 또는 AKI에 회생 응답에 책임이있는 경로는 포유류 56과 보존된다는 것을 시사한다. 따라서, 더 많은 연구가 관여하는 신호 전달 경로를 확인하고 상호 작용 - 제브라 피쉬는 신장학 분야에서 중요한 목표를 추구하는 하나의 약속 수단을 제공 이해하는 재생 - 즉의 메커니즘을 떨어져 애타게하는 데 필요한있다. 이와 프로토콜에 설명 네프론 셀 라벨 같은 도구 AKI 모델에서 신장 조성물 및 기능성을 평가하기 위해 이용 될 수 분석법 중 하나기를 나타낸다. 또한, 이들은 신장 질환의 트랜스 제닉 모델을 특성화하기 위해 적용 할 수있는 신장 네프론 후 댐 구조의 복원을 촉진 할 수있는 화학 치료제를 식별하는 방법을 제공 할 수있다연령.

신장은 체내에서 생리 기능의 다수를 만족 복잡한 기관이다. 신장의 가장 중요한 기능은 신진 대사 폐기물 배출하고,이 작업은 밀접하게 유체 항상성의 유지와 얽혀있다. 신장 병용 혈압, 전해질 수준, 산 - 염기 평형을 조절하면서, 혈액을 여과하고 소변을 형성하여 이러한 작업을 수행한다. 네프론이라는 고도의 전문 상피 세관은 신장 1, 2의 기본 기능 단위의 역할을한다. 성인 척추 동물에서 네프론은 일반적으로 많은 세관은 매우 작은 장기로 포장하는, 따라서 수 있도록 중앙 집중식 배수 시스템을 둘러싼 단단히 코일 배열로 구성됩니다. 예를 들어, 각 인간의 신장 이상 1,000,000 네프론 세를 포함 할 수 있습니다. 마우스와 같은 다른 포유류 신장 4 당 8-10000 네프론의 순서에 가지고있다. 신장 복잡성의 정도는이 포유류와 다른 높이 요 사이에 차이가전체 네프론의 수가 변형 및 신장 내에서의 구조적 배치로 인한 ebrates. pronephros, mesonephros 및 metanephros : 척추 동물의 종은 최대 3 개의 연속 개발하는 동안 신장의 구조 및 네프론 자질 및 배치와 관련하여 복잡성을 증가 각 양식에 표시를 형성한다. 유지하는 구조는 최종 신장 성인 신장 장기 전형적 mesonephros 또는 metanephros이 역할을한다. 각 신장 형태는, 그러나, 네프론 계 조성물이있다. 네프론은 신​​장의 주력이고 대사 분비 및 재 흡수와 함께 혈액 여과를 담당합니다. 네프론은 상피 세포로 구성된 간단한 관상 구조입니다 차별화 된 상피 세포의 분리, 고도의 전문 도메인이 특정 작업을 수행하는 분절 조직을 보유하고 있습니다. 네프론을 통한 여과 유량 위하여, 일반적으로 3 주요 부를 compris 그 존재각 전자 장치 (1) 신장 소체, 기단, 중간 및 원위 세그먼트 (2) 세뇨관, 및 (3) 집합관 1. 근위 세뇨관 유기 용질, 특히 포도당과 아미노산을 하나의 재 흡수에 대한 책임이있다. 중간 가느 다란 관 (또는 헨레 루프)는 소금과 물 규제가 하나의 주요 사이트입니다. 마지막으로, 소금과 다른 이온의 미세 조정은 원위 세뇨관과 집합관에서 발생하는 높은 내분비 시스템 (1)에 의해 조절된다. 거기에서, 여액은 궁극적 노폐물 한 바와 같이 본체를 종료, 및 방광 요관을 통해 여행. 신장 기능의 감소는 정상적인 활동 네프론을 방지 원인 다수 유래 할 수있다. 이러한 원인은 신장 개발, 예를 들면, 부상의 다른 유형에서 네프론 5, 또는 원인의 기형을 초래할 선천성 결함 (유전 및 environme 모두에 따른 중에 발생할 수ntal 기원). 획득 부상은 크게 급성 신장 손상 (AKI) 또는 만성 신장 손상 (CKD)으로 분류됩니다. AKI는 종종 허혈이나 독소에 노출 6,7로 인한 신장 기능의 급격한 손실을 포함한다. 포유 동물에서 상피 수리 네프론은 부상 후 8 가능하고, 많은 사람들은 AKI 후 신장 기능의 완전한 회복을 나타낸다. 70 %의 발생 범위 6,7 - 그러나, AKI는 넓은 (30)를 통해보고 된 높은 이환율과 사망률과 관련이 있습니다. CKD는 대조적으로, 일반적으로 섬유화 8,9과 관련된 장기 손상의 년의 결과 신장 기능의 점진적인 감소와 연관되어 있습니다. 어느 하나가 다른 10 ~ 12에 개인을 걸리기 수 또한, 상호 작용은 AKI와 CKD 사이에 존재합니다. 예를 들어, AKI에서 고통을 사람들은 CKD와 죽음 (13)에 더 민감하다. 신장 질환의 발생률은 미국 및 전 세계적으로 모두 epide에 도달했습니다마이크 비율과는 세 인구는 신장 (14, 15)에 대한 재생 의학의 개입을 식별 할 필요성이있다 - 따라서 확장으로 증가 할 것으로 예상된다. AKI 환자가 회복 할 수있는 지식에도 불구하고, 긴 신장이 선천적 인 재생 능력이없는 기관이라고 생각하고있다. 이 전통적인보기는 극적으로 최근 16 년에 개정되었다. AKI 후 마우스 및 쥐에서 신장 손상을 조사하는 연구는 네프론의 세뇨관 상피 세포 증식 및 기능 네프론 17-20를 재 구축 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 포유 동물은 네프론을 다시 생성이 적응 능력을 가지고 있지만, 신장 섬유증 및 CKD 21로 이어질 트리거 할 수 있습니다 주목할만한 한계와 부적응 반응이있다. 예를 들어, 최근의 연구는 쥐의 네프론에서 반복 상피 세포의 박리가 감소 된 재생 및 근래 신장 섬유증 - 제안 네프론와 관련이 있음을 증명EA는 재생 임계 값 (22)을 제한했다. 성인 포유 동물의 신장, 분실 또는 손상된 것들을 대체 할 새로운 네프론을 형성하여 자신의 파괴는 영구적 인 네프론 적자 8,9 리드 있다는 증거는 없습니다. 흥미롭게도, 어떤 척추 동물은 콩팥의 상피를 재생하여도 새로운 네프론을 생산하여 AKI에 응답 마십시오 과정은 neonephrogenesis 또는 네프론 신생 (23)라고 함. Neonephrogenesis 독소에 노출 또는 부분 절제술 후 물고기에서 발생, 부상 모델은 역사적으로 최근에는 금붕어 24, 25, 틸라피아 (26), 스케이트 (27), 송사리 (28), 그리고 제브라 피쉬 (29, 30)을 포함했다. 이들 중, 제브라 피쉬 신장 재생에 책임 세포 및 분자 경로를 발견하도록 가능한 유전자 연구 모델을 제공한다. 이 비디오 문서에서는, 우리는 성인 제브라 피쉬에서 네프론 세그먼트 레이블을하는 방법을 보여줍니다. 네프론의 해부학, 분자 기능에 대한 지식,기능적인 특성은 제브라 피쉬를 사용하여 성공적인 미래 신장 연구에 필수적이다. 성인 zebrafish의 신장은 mesonephros 구조입니다 성인 포유류, avians, 파충류 31에있는 metanephros 구조보다 네프론의 수와 조직의 관점에서 본질적으로 덜 복잡하다. 그러나, 제브라 피쉬 네프론 세그먼트는 포유 동물 조직과 유사하며, 제 유전자 발현 연구에 기초하여 31-35 배아 신장에서 설명 하였다. 제브라 피쉬 배아 네프론은 근위 세뇨관 (PCT)를 포함 선형 세관 세그먼트, 근위 곧은 세관 (PST), 말초 초기 (DE) 및 말초 말 (DL) 31 ~ 35 (그림 1)이 포함되어 있습니다. Zebrafish의 성인 네프론 유사한 관 세그먼트에게 30,31,36,37 (그림 1)를 가지고있다. PCT 또한 기능적 표현형에 의해 식별 될 수있다 : PCT 상피 세포에 존재하는 형광 표지 덱스 트란 화합물 (10-70 kDa의 크기)를 포함한다배아 및 성인 지브라 피쉬 신장 모두에서 사용되어왔다 순환 이러한 근위 세뇨관 세포 38-41 (도 1)에 의해 세포 내 이입 흡수를 평가한다. 제브라 피쉬와 포유류 사이의 네프론 분야에서 한 가지 차이점은 제브라 피쉬는 중간 세관 또는 헨레 30-37의 루프 부족이다; 포유 동물에서이 세그먼트 기능은 물을 절약하고, 제브라 피쉬는 소변을 집중 긴급없는 담수 종 때문에, 제브라 피쉬는이 세그먼트 (32, 33)이 부족한 것은 놀라운 일이 아니다. 따라서, 전체적인 네프론 조성물은 크게 제브라 피쉬 및 포유류 신장 32,33간에 보존된다. 이러한 유사성은 발달 nephrogenesis 32-35,42 중에 신장 발현 유전자의 기능을 조사함으로써, 인간 일 수 조건의 실질적인리스트에 추가하는, 수많은 신장병 43, 44를 모델링하기 위해 효과적인 연구 도구로 지브라 피쉬를 활성화 사용하여 조사제브라 피쉬의 45, 46. 오늘날, 성인 zebrafish의 신장으로 인해 유전 온순함이 종의 유전자 기능과 신호 전달 경로를 심문 할 수 기술 자원의 확대 입맛에 신 재생의 비교 연구를위한 매력적인 모델입니다. 여러 연구 AKI 29,30,37 후 재생의 메커니즘을 조사하기 위해 제브라 피쉬 mesonephros을 사용했다. 성인 zebrafish의 신장을 계속 사용 AKI 연구의 경우, 네프론의 기능을 조사하기 위해 다른 네프론 지역과 방법에 레이블 절묘한 방법이 필수적이다. 성인 신장의 분석을위한 여러 가지 방법이 배아 신장 프로토콜에서 적응하고있다. 성인 제브라 피쉬의 형광 표지 덱스 트란의 복강 내 주사는 제브라 피쉬 배아 38-41 (그림 1)에서와 같이, 엔도 시토 시스 (30)를 통해 mesonephros의 네프론의 PCT 상피 레이블. 이 방법은 visualiz하는 데 사용되었습니다근위 세뇨관 복원 생리 기능 30 (그림 1)의 한 평가를 할 수 AKI을, 다음 자신의 재 흡수 특성을 회복 전자. 네프론 근위 세뇨관의 또 다른 특징은이 분야에서 상피 세포가 내인성 알칼리 포스파타제 활성의 높은 수준을 나타내고 브러시 테두리 (37)를 갖고 있다는 점이다. 따라서, 근위 상피 ELF- (효소 형광 표지)로 알려진 형광 기반 기술 -97 (47)를 사용하여 성인 제브라 신장 시각적 지역화 될 수있다. 여기서는 근위 세뇨관의 기능 평가를 획득하고이 세뇨관 세그먼트의 크기 및 형상을 매핑하도록, 제브라 피쉬 신장 성인 형광 덱스 트란 흡수 분석법 30,48보기를 수행하는 방법을 설명한다. 다음으로는 형광 라벨 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase)와 성인 네프론의 근위 세뇨관 영역을 레이블 기술을 설명합니다. 셋째, 우리는 처음으로로드 &#39;게재아민 태그 렉틴 Dolichos는 포유류 낭 (49)에 포집 관의 일반적인 마커로 사용되었다 응집소 (DBA) biflorus, 제브라 피쉬 성인 신장의 원위 세관을 표시한다. DBA는 알칼리성 포스 파타 아제 염색에 상호 배타적이기 때문에,이 라벨은 크게 성인 zebrafish의 네프론의 팬 원심 뻗어 대 팬 근위을 구별 할 수있는 방법을 제공합니다. 전체 마운트 및 저온 유지 조직 학적 섹션 모두에서 이러한 형광 얼룩의 구현을 통해, 우리는 고유 각 네프론 세그먼트를 식별 용질 수송 유전자의 발현 도메인과이 라벨의 상관 관계. 따라서이 프로토콜은 또한 우리의 배아 WISH 프로토콜 50을 기반으로 현장 하이브리드 (WISH) 분석에서 성인 조직 전체 마운트에 대한 수정 된 조직 처리 절차에 대한 안내가 포함되어 있습니다. 이러한 절차는 O 형태 학적 및 기능적 특성을 문서화하는 다양한 조합으로 (그림 2)을 사용할 수 있습니다F 성인 zebrafish의 신장 네프론. 따라서,이 프로토콜은 재생 연구, 다른 신장 질환 모델의 표현형 특성에 적용 할 수 있으며, 심지어 신장 성인의 형성을 연구하는 데 사용.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

제브라 피쉬 모델은 신장 개발, 재생과 질병을 연구하는 중요한 시스템으로 떠오르고있다. 모두 배아와 성인 zebrafish의 신장이 높은 포유 동물을 포함한 다른 척추 동물에 보존되어 네프론로 알려진 기능 단위로 구성되어있다. 제브라 피쉬의 연구는 최근 성인 네프론 손상이 발생 후 2 독특한 현상이 발산 것을 증명하고있다 : 첫째, 파괴 세관 상피 세포를 대체 기존의 네프론 내에서 강력한 재생이; 둘째, 완전히 새로운 네프론은 neonephrogenesis으로 알려진 과정에서 신장 전구 세포로부터 생성된다. 대조적으로, 인간과 다른 포유류 네프론 상피 재생을위한 제한된 능력을 가지고있는 것처럼 보인다. 현재까지, 이러한 신장 재생 현상에 대한 책임이 메커니즘은 제대로 이해 남아있다. 성인 zebrafish의 신장이 모두 네프론 상피 재생 및 neonephrogenesis를 받아야하기 때문에, 그들은 뛰어난 실험 항을 제공이러한 이벤트를 공부 다임. 또한, 신 재생을 조절 세포와 분자 메커니즘을 서술하기 위해 사용될 수있다 제브라 피쉬 모델에서 사용할 수있는 약리학 적 및 유전 적 다양한 도구가있다. 이러한 연구의 한 중요한 양태는 네프론의 구조와 기능의 평가이다. 이 프로토콜은 성인 zebrafish의 신장에 신장 조성물 및 테스트 네프론 기능을 측정하는 데 사용할 수있는 표시 기술의 집합을 설명한다. 따라서, 이들 방법은 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는다 성인 지브라 피쉬 신장 손상 패러다임, nephrotoxicant 노광 체제 또는 nitroreductase 매개 세포 어블 레이션 기술로서 표적 세포 사멸 유전자 방법 미래 표현형 특성에 널리 적용 할 수있다. 또한, 이들 방법은 성인의 신장 형성 유전 섭동을 연구하는데 사용될 수 있으며, 만성 질환 모델링시 신장 상태를 평가하기 위해 적용될 수있다.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

성인 Zebrafish의 신장에서 네프론의 구성 및 기능 분석

제브라 피쉬의 성인 신장은 신장 재생과 질병 연구를위한 훌륭한 시스템입니다. 이러한 연구의 중요한 양태는 네프론의 구조와 기능의 평가이다. 이 프로토콜은 네프론의 세뇨관 조성물을 평가하기 위해 신장 재 흡수를 평가하도록 구현 될 수있는 몇 가지 방법론을 설명한다.

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

성인 Zebrafish의 전체 신장 마로우의 이식

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

연구

생물학

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

성인 Zebrafish에서 기관의 해부

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

성인 Zebrafish에 Intraperitoneal 사출

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

직접 성인 Zebrafish의 신장에 세포의 이식

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

성인 Zebrafish의 신장의 해부

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

생성중 성인 Zebrafish 테일 핀으로 Morpholinos의 생체내 Electroporation에

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

성인 Zebrafish의 생물 화학 분석을위한 혈액 수집

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

성인 Zebrafish의를 Gavaging

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

형광 정리 분석을 사용하여 Zebrafish의 신장 기능의 평가

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...