Name: analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney
Uploaded: 2014-08-09T14:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av midler til RAW fra følgende: National Institutes of Health gir K01 DK083512, DP2 OD008470, og R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar stipend award # 5-FY12-75; starte opp midler fra University of Notre Dame College of Science og Institutt for biologi; og en sjenerøs gave til University of Notre Dame fra Elizabeth og Michael Gallagher på vegne av Gallagher Family å fremme stamcelleforskning. De bevilgende myndighet hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker staber av Department of Biological Sciences for deres støtte, og Center for Sebrafisk Forskning ved Notre Dame for sin enestående engasjement i omsorg og velferd for våre sebrafisk koloni. Til slutt vil vi takke alle medlemmer av vår forskningslaboratorium for sine kommentarer, diskusjoner og innsikt om dette arbeidet.

Prosedyrene for å arbeide med sebrafisk som er beskrevet i denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Notre Dame. Merk: En guide til nyre og nevronet anatomi i sebrafisk er gitt (figur 1). En oversikt over de metoder som er beskrevet i denne protokollen er gitt som et flytskjema (figur 2) for å illustrere hvordan flere merking prosedyrer kan utføres på samme nyre prøven. For-del 7 på WISH forberedelse for voksne nyre studier, er fremgangsmåten som gis her indikerer hvordan å modifisere behandlingen av sebrafisk embryoer, som nylig publisert 50, for å tilveiebringe en teknisk veiledning for vellykket WISH analyse i nyrene organ. 1. Voksen Sebrafisk intraperitoneal injeksjon med dekstran av interesse <ol><li> Klargjør det ønskede fluorescensmerkede dekstran lager (e) ved å løse opp den dekstran-pulver i destillert vann ved en konsentrasjonpå 50 mg / ml, og deretter lagre aliquoter i mikrosentrifugerør ved -20 ° C i mørket. Merk: Forskjellige fluorescensmerkede dekstraner er kommersielt tilgjengelige. Velg dekstran for bruk basert på en kombinasjon av andre merker som er ønsket, og sørge for at de riktige fluorescerende filtre er tilgjengelig med mikroskopene som vil bli benyttet. Lysin-fixable dekstraner viser fluorescens uten ytterligere merking skritt i leveprøver, unfixed vevsprøve fra avlives prøver, og faste prøver. </li><li> Tine ønsket dekstran lager og lagrer på is i mørket mens du utfører trinn 01.03 til 01.05. Pakk mikrorøret i aluminiumsfolie for å beskytte den mot lys under behandling. </li><li> Bedøve en voksen sebrafisk mellom 5-7 måneder i alder ved å plassere fisken i en tallerken som inneholdt enten 0,02% Tricaine eller 0,001% 2-Phenoxyethanol for ca 1 - 2 min. Merk: Det er å foretrekke å bruke voksen sebrafisk av denne aldersgruppen fordi yngre fisk kan ha SMAll nyrer som er vanskelig å dissekere og nyre prøver fra gamle fisk kan inneholde masser av arrvev som ikke kan analyseres. Når den er riktig bedøvet, vil voksen sebrafisk ikke oppvise en respons til trykk på stimulering, som kan bli testet ved hjelp av en skje eller stump sonde til forsiktig berøring halefinnen på fisken. </li><li> Ved hjelp av en plastskje, løfte fisken fra fatet, dekanter løsningen og forsiktig plassere dyret på en våt svamp mold, ventral side opp. </li><li> Ved å bruke en 31 G 1,0 cc insulinsprøyte, injisere 20 pl opptint dekstran stamløsning inn i den intraperitoneal plass. Orienter nålen slik at innsettingen finner sted ved en spiss vinkel på den ventrale midtlinje av buken. For å unngå punktering organer, før nålen deretter litt heve det slik som å løfte kroppen veggen av fisk og skape et rom der for å injisere dekstran løsning 48. Merk: Alternativt kan dekstran lager fortynnes, f.eks, i et forhold på 1: 2 eller 2: 1 (dekstran: disdestillert vann), for å redusere bakgrunns fluorescens i prøven. </li><li> Forsiktig med fisken tilbake til tanken for å tillate gjenvinning fra anestesi. Merk: Opptak av dekstran med proksimale tubuli segment skjer innen 8 - 12 timer og kan påvises i minst opp til 3 dager etter injeksjon (ppt). Analyse på tre dpi gir sterk tubule signal med lav bakgrunn fluorescens i de nyre stromale populasjoner. Fortsett til del 2 for hele fjellet undersøkelse av dekstran opptak alene, hvis ytterligere merking ikke er ønsket. For kombi merking, fortsett til del 3 for å forberede vev for hele fjellet undersøkelse av dekstran opptak, så del 4 til dobbel-label med alkalisk fosfatase og / eller del 5, for å utføre DBA dobbel eller trippel-merking. For forskning ved hjelp av histologiske snitt, fortsett til del 6 for instruksjoner om hvordan du kan lage fine deler av nyrene ved hjelp av en cryostat og hvordan å farge disse med ulike etiketter og / eller immunhistokjemi med primær og sekundær Antibodies. </li></ol> 2. Dissection og Flat Mount Utarbeidelse av Adult Sebrafisk Nyre fra en Ikke fiksert Animal Sample å visualisere Fluorescent Dextran Merking av proksimale tubuli <ol><li> Avlive dekstran-injisert voksen sebrafisk ved å plassere den i en skål med 0,2% Tricaine pH 7,0 4 - 5 min. Merk: Sørg for at fisken har blitt avlivet før du fortsetter, ved å overvåke nøye om gjellene har opphørt bevegelse og hjertet har sluttet å slå 36. </li><li> Ved hjelp av en plastskje, løfte fisken fra Tricaine løsning, dekanter løsningen og plassere dyret på en vev eller papir håndkle. </li><li> Bruk en skarp to disseksjon saks for å lage et kutt bak gjelle operculum og fjerne hodet. </li><li> Umiddelbart åpne fiskekroppen med disseksjon saks ved å lage en lang ventralt innsnitt fra topp til bunnen av halefinnen. </li><li> Fjern de indre organer i fisken ved hjelp av et par fine tang.</li><li> Bruk super-fine nåler disseksjon til pin åpen kroppsveggene for å tillate visualisering av nyrene organ, som hefter til ryggveggen av dyret. </li><li> Bruk fin pinsett til å løsne nyre fra rygg veggen. </li><li> Forsiktig plassere nyrene inn i en 5 ml glassampulle innehold 1X PBS og vask 3 ganger med 3-5 ml frisk 1X PBS i 5 min hver. Merk: Anvendelse av en glassampulle for behandling av voksne nyreprøver muliggjør visualisering av vev og tillater vaskinger med store volumer (i forhold til vevet masse) på ca 3 - 5 ml. Alternativt kan en 12-brønns celledyrkningsskål benyttes. Mens en plast mikrosentrifugerør kunne brukes, kan den standard størrelse rørene (1,5 ml) begrenser vasking. </li><li> Fjern nyrene med en overføring pipette og sted på et rent glass lysbilde med 1-2 dråper 1X PBS. </li><li> Bruk fin pinsett å flate nyrene på lysbildet, og pass på at ingen vev har krøllet eller på annen måte veltetpå seg selv. Merk: Alternativt kan en tungsten ledning verktøyet brukes til å lage små snitt i bindevevet til rette flat posisjonering av nyre. </li><li> Plasser små biter av modelleire på hvert hjørne av en 18 x 18 mm glass dekkglass og sakte sette dekkglass på nyrene. Merk: Litt vinkel dekkglass under plassering for å minimere overlapping luftbobler i løsningen 50. De modellering leire divots er ca 2 mm i diameter (figur 2A). Alternativt kan tribuner av vakuumfett erstattes i stedet for modelleringsleire. Legg til en ytterligere dråpe 1X PBS for å fylle rommet mellom dekkglass og glass-slide om nødvendig. </li><li> Observer og / eller bilde nyrene ved å plassere glass-slide i synsfeltet på et stereomikroskop eller sammensatt mikroskop med det passende filter. Merk: Se Figur 2A for makroskopisk utseende på dette lysbildet forberedelse. </li></ol> 3. FIXAsjon, Dissection, Permeabilization og fjerning av pigmentering av Adult Sebrafisk Nyre <ol><li> Forbered en frisk fiksativ løsning av 4% paraformaldehyde (PFA) / 1X PBS / 0,1% DMSO eller tine en frossen delmengde av 4% PFA / 1 X PBS og tilsett 0,1% DMSO. Forsiktig: PFA er giftig og PFA løsninger skal håndteres på en kjemisk hette mens iført egnet personlig verneutstyr, inkludert hansker og labfrakk. I tillegg bør PFA pulver håndteres med forsiktighet når gjør stamløsning. </li><li> Fyll en disseksjon brett med nok fiksativ løsning å senke hele dyret. </li><li> Avlive og montere den valgte sebrafisk i fikseringsløsning (se trinn 02.02 til 02.06). Merk: Den valgte fisk kan være en ubehandlet sebrafisk nyre prøven, eller en nyre isolert fra en sebrafisk som tidligere har mottatt en intraperitoneal dekstran injeksjon (del 1). </li><li> Fix prøven O / N (12 - 16 timer) ved 4 o C. </li><li> Dagen etter, bruker fine tang til omsorgfullt løsne nyre fra rygg kroppen veggen og plassere orgelet i et hetteglass ved hjelp av en overføring pipette. Merk: Alternativt kan en 12-brønn eller 24-brønners dyrkningsskål benyttes. Mens en plast mikrosentrifugerør kunne brukes, kan den standard størrelse rørene (1,5 ml) begrenser vasking. </li><li> Vask den dissekerte nyre 3 ganger med 3-5 ml 1X PBS med 0,05% Tween i 5 min hver. </li><li> Fjern 1X PBS med 0,05% Tween og skyll nyren med 3 ml av en 5% sukroseløsning (i 1X PBS) i 30 min. </li><li> Sett med 3 ml 30% sukrose-løsning (i 1X PBS) og lagre O / N (12 - 16 timer) ved 4 ° C. Merk: sukrose-løsninger permeabilize de cellulære membranene, slik at etterfølgende spesifikk merking av reagenser som de trenger inn i vevet. </li><li> Den følgende dag, fjerner 30% sukrose-løsning og vaske nyrene to ganger med 5 ml 1X PBS med 0,05% Tween i 5 min hver. </li><li> Sett på 1X PBS med 0,05% Tween med 3 -5 ml blekeløsning for å fjerne melanocytter pigmentering tilstede på nyrene organ. </li><li> Plasser hetteglass på en rotator og se nøye som pigmentering forsvinner. Merk: Depigmentering tar vanligvis ca 20 min når utført etter sukrose behandling, men noen ganger kan ta så lenge som 60 min. Hvis blekeløsningen er igjen på nyren for lenge, kan oppløsningen av det organ oppstå; det anbefales å overvåke prøven hvert 10-15 minutt for å sjekke vev integritet. </li><li> Når pigmentering har blitt fjernet fra nyrene, vaskes to ganger med 3-5 ml 1X PBS med 0,05% Tween. </li><li> Sett på 1X PBS med 0,05% Tween med 3 - 5 ml av 4% PFA-løsning i 1 time ved RT. </li><li> Fjern 4% PFA løsningen og vask nyrene 3 ganger med 3-5 ml 1X PBS med 0,05% Tween i 5 min hver. Merk: Når fiksering er fullført, nyrene også kan være montert på et objektglass og undersøkt for dekstran opptaks sans melanocytter pigmning, ved å utføre trinn 02.08 til 02.12. </li><li> Fjern 1X PBS med 0,05% Tween og erstatte med 3 - 5 ml blokkeringsløsning, og deretter inkuberes nyrene ved RT i blokken i 2 timer. </li><li> Når blokkeringen er fullført, går direkte til det valgte fargings protokollen. Merk: Nyrene kan nå bli behandlet gjennom en eller flere andre prosedyrer for å gjennomføre merking studier med ulike reagenser. For hele fjellet merking av proksimale tubuli med bare alkalisk fosfatase, fortsett til punkt 4. For hele fjellet merking av bare distale tubuli gå § 5. Alternativt kan § 4 og § 5 skal utføres i lineær rekkefølge for dual påvisning i hele fjellet . </li></ol> 4. merking Adult Nyre proksimale tubuli segmenter med alkalisk fosfatase Detection <ol><li> Fjern blokken og vaske nyrene 3 ganger med 3-5 ml 1X PBS med 0,05% Tween i 5 minutter hver, og deretter erstatte 1X PBS med 0,05% Tween med 3 - 5 ml1X PBS. La nyrene ligge i minst 10 min. Merk: I løpet av denne tiden, overfører nyren til en 12-brønn eller 24-brønners dyrkningsskål hvis vevet er blitt holdt i en glassflaske for tidligere behandlingstrinn. </li><li> Sett på 1X PBS med tilstrekkelig arbeids alkalisk fosfatase substratoppløsning (Se deteksjon kit ligger i Table of Materials) for å dekke prøven, og deretter plassere prøven på en rotator i 30 min ved RT. Hold prøven beskyttes mot lys. </li><li> Stopp reaksjonen ved å vaske nyrene hos alkalisk fosfatase vaskebufferløsning. </li><li> Skyll nyre med tre forandringer av vaskebufferløsning over 10 - 15 min. Merk: Etter dette trinnet, gå direkte til del 5, Step 5.1 (altså midlertidig å utelate trinn 04.05 til 04.06) dersom merking med DBA er også ønskelig. Valgfritt trinn: å merke og visualisere cellekjerner i orgelet, suge nyrene hos propidium iodide løsning. Forbered en propidium iodide lager ved å løse opp pulveret på en konsentrasjosjon av 1 mg / ml (1,5 mm) i destillert vann. Fortynn lager til 500 nM i 2X SSC og inkuber nyrene i denne løsningen i 30 min. Skyll med 1X PBS og fortsett til trinn 4.5. </li><li> Fjern vaskebufferløsning og monter nyre på et rent glass lysbilde i fosfatase monteringsmedium inkludert i merking kit (Se trinn 02.09 til 02.12). Merk: monteringsmedium har erstattet 1X PBS fra trinn 2.9. </li><li> Visualisere alkalisk fosfatase farget nyre ved hjelp av en stereomikroskop eller sammensatt mikroskop med Hoechst / DAPI filter sett. Merk: Valgfritt trinn: Visualiser propidium iodide ved hjelp av en tetra-rodamin (TRITC) eller Texas rødt filter. </li></ol> 5. demarcating Adult Nyre distale tubuli segmenter med Rhodamine DBA <ol><li> Tilbered en 200 mL arbeids DBA-løsning ved fortynning av DBA (2 mg / ml) 1: 100 i 1X PBS. </li><li> Sett på 1X PBS med 0,05% Tween-løsning med 200 pl DBA løsning. </li><li> Plasser på rotator for1 t ved RT. </li><li> Fjern DBA løsningen og vask nyrene 3 ganger med 3-5 ml 1X PBS i 5 min hver. Merk: Valgfritt trinn: å merke og visualisere cellekjerner i orgelet sammen med DBA etiketten, suge nyrene i DAPI løsning å oppdage med en Hoechst / DAPI filter (rodamin DBA flekken kan oppdages med en TRITC eller Texas rødt filter). Tilbered en DAPI lager ved oppløsning av pulver i en konsentrasjon på 5 mg / ml (14,3 mM). Fortynn lager til 300 nM i 2X SSC og inkuber nyrene i denne løsningen i 20 min. Skyll med 1X PBS og fortsett til trinn 5.5. Hvis Part 4-prosessering er utført, husk at DAPI og alkalisk fosfatase er begge registrert med en Hoechst / DAPI filter. </li><li> Fjern 1X PBS og montere nyre på et rent glass slide (se trinn 02.09 til 02.12). </li><li> Visualisere DBA-farget distale segmenter av nyre ved hjelp av en standard TRITC eller Texas rødt filter satt på en fluorescerende stereo eller sammensatt mikroskop. Merk: Tilleggs step: Visualiser DAPI bruker en Hoechst / DAPI filter. </li></ol> 6. Inkludering, Cryosectioning og farging (Vital Fargestoffer og Immunohistokjemi merking) av Adult Sebrafisk nyrevevet <ol><li> Velg fisk for analyse, deretter avlive, fikse og permeabilize som beskrevet (trinn 3.2 til 3.8). Merk: Fix voksen fisk i 9: 1 etanol: formaldehyd / 0,1% DMSO i stedet for 4% paraformaldehyde / 1X PBS / 0,1% DMSO for cryosection prosedyre for å produsere deler for dekstran, alkalisk fosfatase, og DBA visualisering. Men husk at Paraformaldehyde baserte bindinger kan være kompatibel for noen immunhistokjemi prosedyrer. Videre er bleking av den voksne nyre ikke nødvendig for cryosection analyse, fordi melanocytter er overfladisk og påvirker ikke visualisering av nevronet celler som utgjør den &quot;innsiden&quot; av nyre organ. </li><li> Dagen etter, fjerne 30% sukroseløsning og erstatte med 1: 1 vev frysing medium: 30% sucrose i 4 timer ved RT. </li><li> Fjern det 1: 1 løsning og legge nyreprøver i 100% vev iskaldt medium i cryomolds og sted ved -80 ° C i minst 1 time. </li><li> Transversalt kuttet seriesnitt, omtrent 12 mikrometer tykke, gjennom hele den voksne nyre. </li><li> Monter frosne cryosections på selvklebende objektglass og la det lufttørke i 1 time ved 50 o C. </li><li> Butikken lysbilder ved -80 o C før bruk. </li><li> Når cryosections er klar til å merkes, fjerne objektglass fra -80 o C og legg på lysbildet varmere ved 50 o C i 45 min. </li><li> Ved hjelp av en flytende blocker penn, tegne en sirkel rundt cryosections og la tørke i 15 min på lysbildet varmere ved 50 o C. </li><li> Fjern lysbilder fra raset varmere og plassere flat i en luftfuktighet kammer ved RT. </li><li> Rehydrere cryosections ved tilsetning 1X PBS med 0,05% Tween til den omsluttede del av lysbildene i 20 min. Merk: Omtrent 200-300 &amp;# 956; l er nødvendig for å dekke hver omkranset del på et lysbilde. </li><li> Sett på 1X PBS med 0,05% Tween-løsning med frisk 1X PBS og inkuberes i 10 min. </li><li> Fjern 1X PBS og inkuberes cryosections i en blokkeringsløsning i 2 timer. Merk: For en 10 ml blokkering løsning, kombinere 8 ml 1X PBS med 0,05% Tween, 2 ml føtalt kalveserum og 150 pl DMSO. For å utføre immunhistokjemi etter blokkeringstrinn, Inkuber objektglasset med det ønskede primære antistoff fortynnet i friskt blokk O / N ved 4 ° C, vaskes en gang ved hjelp av 1X PBS med 0,05% Tween, inkuberes i 2 timer ved RT med sekundært antistoff fortynnet i 1X PBS med 0,05% Tween, vaske en gang ved hjelp av 1X PBS med 0,05% Tween, og montere et dekkglass på lysbildet med monteringsmedium. De nødvendige antistoff-fortynninger vil variere og forsøk bør utføres for å velge de optimale fortynninger. Antigen henting kan også legge til rette immunolabeling, og utføres før blokkering. Umiddelbart etter lysbildene er tint ved 50 o C(Trinn 6.8) inkuber cryosections mellom 95 ° C-100 ° C i 40 min i forvarmet 10 mM natrium-citratbuffer. Kule lysbildene i 30 min, deretter vask to ganger i 1X PBS med 0,05% Tween, og gå videre til trinn 6.11. </li><li> Fjern blokkeringsløsningen og vask cryosections 3 ganger med 1X PBS i 5 min hver. </li><li> Bytt 1X PBS med DBA flekker løsning og inkuberes i 1 time. Merk: Fortynn 1 pl DBA i 99 mL av 1X PBS for å lage en 100 pl flekker løsning. </li><li> Fjern DBA farging løsningen og vask cryosections 3 ganger med 1X PBS i 5 min hver. </li><li> Påfør alkalisk fosfatase etiketten og ruge på cryosections for 10 min. </li><li> Vask alkalisk fosfatase ved de cryosections med en serie av tre vaskinger med vaskebuffer i 10 minutter hver. Merk: I en 100 ml løsning av vaskebuffer, kombiner 5 ml av 0,5 M EDTA og 120 mg av levamisol i 95 ml 1X PBS. Slik merker kjerner, ruge seksjoner med propidium iodide eller DAPI på dinologi tidligere nevnt (trinn 4.4, 5.4, henholdsvis) i 30 min ved RT. Velg en kjernefysisk flekken kompatibel med kombinasjonen av andre fluorescerende flekker som har blitt valgt. </li><li> Fjern all væske fra cryosections og plassere 2 dråper montering medium på objektglass. </li><li> Plassere mikro dekkglass forsiktig inn på objektglass. Cryosections er nå klar til bilde med det riktige filter (e). </li></ol> 7. WISH Processing for Adult sebrafisk Nyre Samples <ol><li> Velg de ønskede sebrafisk prøven (e), avlive, fikse og dissekere nyrene som beskrevet (trinn 3.1 til 3.5). Merk: Det er viktig å bruke en fiksativ løsning på 4% Paraformaldehyde (PFA) / 1X PBS med 0,1% DMSO å permeabilize nyrene. Plasser nyre inn et hetteglass for enkel visualisering under påfølgende behandlingstrinn. </li><li> Fjern fiksativ og vaske nyrene to ganger med 5 ml 1X PBST. </li><li> Fjern 1X PBS og vaskes to ganger nyre with 100% metanol, og deretter inkubere nyrene ved -20 ° C i minst 20 min for å permeabilize. Note: dissekert nyrer kan lagres på ubestemt tid -20 o C. </li><li> Rehydrere nyrene ved å utføre en serie av 5 min vasker med 3 - 5 ml 50% metanol / 1X PBST, 30% metanol / 1X PBST, og to ganger med PBST 1X. </li><li> Bleach nyrene å fjerne pigmentering som beskrevet (Steps 03.10 til 03.14). </li><li> Unn nyrene med 10 ug / ml proteinase K / 1X PBST med 0,1% DMSO i 20 min, deretter spyles to ganger med PBST 1X og post-fix i 4% PFA / 1X PBST i 20 min i O / N. Merk: alltid klar proteinase K arbeidsløsning umiddelbart før prøven fordøyelse ved å kombinere 50 pl nylig tint proteinase K lager (10 mg / ml), 50 ml PBST 1X, og 50 ul DMSO. </li><li> Behandle nyre for enkel eller dobbel WISH følge trinnene for riboprobe syntese, prehybridization, hybridisering, anti-digoxygenin / anti-fluoroscein antistoff inkubasjon og Detecsjon som nylig beskrevet 49. Merk: Antall montere avbildning av nyre flekker skal utføres i løpet av flere dager etter utføring fargingsreaksjonen. Nephron flekker tendens til å falme svært raskt, spesielt røde underlaget etiketter. For nevronet fotografering, flat feste nyreprøve som beskrevet ovenfor i trinn 2,10 til 2,12, og med bruk av en stereo- eller sammensatt mikroskop. Differensial interferens kontrast filtre kan brukes til å bedre visualisere de cellulære konturene av nephrons å forenkle analysen. </li></ol>

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Her har vi beskrevet metoder som muliggjør visualisering av nevronet segment komponenter i den voksne sebrafisk. Injeksjon av fluorescerende dekstran konjugater gjør fortrinnsrett PCT merking grunn de endocytiske egenskapene til disse proksimale tubulære celler 30,38. Denne metoden kan utføres med stor fleksibilitet på grunn av eksistensen av dekstraner som kan oppnås med en flokk av ulike fluorescerende konjugater. I tillegg er bruk av lysin-festbar dekstraner en spesielt fordelaktig måte å merke PCT-segmenter, som sekundære merkingsfremgangsmåter ikke er nødvendige. Dette gjør relativt grei signal deteksjon og er kompatibel med mange andre fluorescerende etiketter, immunolabeling, og bruk av transgene reporter linjer. Alkalisk fosfatase merking markerer også proksimale tubuli, med sterk reaktivitet i PCT og litt svakere reaktivitet i PST. Til slutt, gjør at DBA farging merking av distale tubuli segmenter, som viser en lmaracteristic forgrenet morfologi. Ulike lectinet molekyler, som er sukker-bindende proteiner av immune opprinnelse, har vært brukt mye til å skille pattedyr Nephron segmenter 47. Det er interessant at DBA i sebrafisk korrelerer med distale tubuli segmenter, slik det er brukt til å markere samlekanaler i pattedyrnyre 47. Tatt sammen, kan disse metodene bli anvendt i forskjellige kombinasjoner for å dokumentere nedsatt sammensetning og funksjon. Siden alle disse metodene kan brukes i hele nyre preparater, gir de verktøy for å evaluere nevronet struktur og funksjon i hele organet uten helt å stole på bruken av mer tidkrevende og omstendelige metoder, f.eks cryosection arbeid og immunolabeling. Men flekkene er beskrevet i dette metoder artikkelen er levedyktige i cryosection. Cryosection analyse genererer prøver (sammenlignet med hele fjellet) som er bedre egnet for immunhistokjemi for å påvise spesifikke peptides, skjønt naturligvis denne type analyser krever tilgjengelighet av egnede primære antistoffer. Dessverre en stor begrensning i arbeidet med sebrafisk dyremodell forblir dårlig tilgjengelighet av antistoffer. Dermed ønsker fortsatt den mest brukte, det vil si, &#39;gå til&#39; prosedyre for analyse av genuttrykk. ØNSKER å bruke BCIP, NBT, og / eller INT substrat reaksjoner å produsere lilla eller rødt bunnfall er ikke kompatibel med fluorescerende flekker på cryosections. Ett alternativ ville være å påberope seg bruk av fluorescerende WISH deteksjon, en prosedyre som er optimalisert for sebrafisk embryonale prøver og kan bli skreddersydd for bruk med den voksne nyre. Beskrivelsen av metodene i denne videoen artikkelen bør gi rom for videre eksperimentering med teknikker som fluorescerende WISH i kombinasjon med transgene sebrafisk linjer der enkelte segmenter er merket med en reporter som EGFP eller mCherry. Alternativt metodene beskrevet her could bli testet i kombinasjon med andre vitale fargestoffer, for eksempel, andre lektiner. Dermed kan ytterligere tilpasning og utvidelse av metodene beskrevet her påberopes som passer forskerens behov for hele fjellet nyre forberedelser og analyser. Som sådan, disse metodene har bred potensial for gjennomføring med sebrafisk-modellen for pågående regenerering studier og også i genetisk sykdom modellering. Det er et stort behov for innovative forskning og behandling for nyre lidelser. Millioner av mennesker lider av noen form for nyresykdom hvert år at resultatene fra medfødte, akutte og / eller kroniske årsaker. Videre fortsetter forekomsten av nyresykdom å stige over hele verden, noe som gjør disse sykdommene et globalt folkehelseproblem 14,15. Behandlinger som hemodialyse er tilgjengelig der en ekstern dialysemaskinen tjener til å kvitte pasientens blod av metabolske avfall hvis nyrene ikke er i stand til å utføre denne rollen. Dessverre, Har dette inngrep begrensninger, som løpende behandling er nødvendig for å overleve. Videre vil pasientene til slutt krever en nyretransplantasjon, som kan ta mange år for å motta når en pasient ligger på en venteliste. Selv etter å ha innhentet en nyretransplantasjon, mange pasienter lider bivirkninger som følge av inngrepet, og må kjempe slike effekter for resten av livet. Disse vanskelighetene demonstrere alvorlig behov for utvikling av nye behandlinger for å enten forhindre nyresykdom eller kanskje forsterke vev gjenfødelse 8,16,52,53. Gitt de åpenbare etiske begrensninger i bruk av menneskelige forsøkskaniner i biomedisinske laboratorier, dyremodeller er avgjørende for studiet av menneskelig sykdom patogenesen og for testing av nye behandlinger. Som et resultat av dens anatomiske likhet og evolusjonære nærhet, har mus blitt den mest utbredte modell av human sykdom 45. Det er imidlertid visse begrensninger med dette dyret, inkluing manglende evne til å visualisere organutvikling in vivo og praktiske med å fullføre store genetiske skjermer. Sebrafisk er en relevant og nyttig modellorganisme for studier av organutvikling og modellering av menneskelig sykdom 45,46. I forhold til sykdom hos mennesker, funksjonelle homologer i sebrafisk finnes for nesten 70% av alle menneskelige gener 54,55. Nyere arbeider har fremhevet nytten av sebrafisk for mange områder av nyre forskning 31,37,56. Studier av regenerering og reparasjon i sebrafisk etter AKI tyder på at tubule epithelial regenerering og neonephrogenesis er to prosesser som skjer og overlapper gjennom regenerering tidsforløpet 30,37. Bruken av et aminoglykosid antibiotika kalt gentamicin har blitt brukt som en skade paradigme gjennom å studere resultatene av AKI i voksen sebrafisk 29,30,37. Over en ca to-ukers periode etter skade fra gentamicin, den proksimale rørformedees regenerere, og i mellomtiden nye nephrons danne hele orgelet 29,30,37. Generelt, de mekanismene som regulerer epithelial regenerering er fortsatt svært kontroversielt. I en foreslått mekanisme for reparasjonsprosessen, er den innledende akutt skade hendelse, etterfulgt av en sloughing av døde celler inn i hulrommet. Deretter er det en rekke de-differensiering, spredning, og migrasjonshendelser, etter som nye celler skille, repopulating skadet basalmembran og gjenopprette funksjonen til den skadde området. Alternativt, har andre studier antydet at erstatningsceller oppstår fra stammen / stamceller som bor innenfor Nephron tubuli. Når det gjelder prosessen med neonephrogenesis i sebrafisk, har cellulære aggregater blitt observert følgende AKI av gentamicin injeksjon 29,30. Disse aggregatene senere modne til nye nephrons som lodd i allerede eksisterende tubuli 29,30. Den røde tråden som forener nevronet epithelial regenerering og neonephrogenesis er deres ren mysterium faktor: i dag er det eksponentielt flere spørsmål om hvordan disse regenerative bragder oppstå enn det er ledige innsikt. Til dags dato, men flere spennende linjer av bevis støtter forestillingen om at nedsatt regenerering forskning ved hjelp av sebrafisk kan faktisk gi relevante komparative innsikt i menneskelig AKI som også kan ha direkte translasjonell potensial 56-58. Kjemisk screening for å identifisere små molekyler som øker proliferasjonen av nyre progenitor-celler i sebrafisk embryoet har nylig ført til identifiseringen av histon-deacetylase inhibitor metyl-4-(fenyltio) butanoat (m4PTB) 56,57. Administrasjon av denne forbindelsen til sebrafisk larver med gentamicin-indusert AKI avdekket at larve overlevelse økt og at nyretubulær spredning ble forbedret 56,58. Når mus med moderat iskemi-indusert AKI ble behandlet med m4PTB, ble deres utvinning akselerert i association med en reduksjon i både tubulær atrofi og cellesyklus arrest av voksende tubulære celler 58. Disse funnene tyder på at de veier som er ansvarlige for normal sebrafisk nedsatt utvikling og / eller regenerativ respons til AKI vil bli konservert med pattedyr 56. Således, mens ytterligere studier er nødvendig for å erte hverandre mekanismene for regenerering-nemlig å identifisere signalveier som er involvert og forstå deres interaksjoner-sebrafisk gir en lovende avenue å forfølge dette viktige målet i nefrologi feltet. Verktøy som de nevronet celle etiketter som er beskrevet i denne protokollen representerer en gruppe av analyser som kan benyttes for å evaluere renal sammensetning og funksjonalitet i AKI-modeller. Videre kan de bli anvendt for å karakterisere transgene modeller av nyresykdom og kan gi måter å identifisere kjemiske terapeutiske midler som er i stand til å fremme gjenoppretting av nevronet struktur etter renal damalder.

Nyrene er et komplekst organ, som oppfyller en rekke fysiologiske funksjoner i kroppen. Den fremste funksjon av nyrene er metabolsk avfall utskillelse, og denne oppgave er nært knyttet til opprettholdelse av væske homeostase. Nyrene utfører disse stillinger ved å filtrere blod og urin forming, mens samtidig å regulere blodtrykk, elektrolyttnivå, og syre-base-balanse. Høyt spesialiserte epitelceller tubuli kalt nephrons tjene som den grunnleggende funksjonell enhet av nyre 1,2. Hos voksne virveldyr, er nephrons vanligvis organisert i en tett kveilet arrangement rundt en sentralisert dreneringssystemet, og dermed gir for mange tubuli å pakke inn i den ganske lite orgel. For eksempel kan hver menneskelig nyre inneholde over 1 million nefroner tre. Andre pattedyr som mus har i størrelsesorden 8-10000 nephrons per nyre fire. Graden av nedsatt kompleksitet skiller mellom disse pattedyr og andre vertebrates på grunn av variasjoner i nevronet totale antall og deres arkitektoniske utformingen i nyrene. Arter virveldyr danne så mange som tre påfølgende nyre strukturer under utvikling, og hvert skjema viser økende kompleksitet med hensyn til nevronet begavelse og arrangement: de pronephros, mesonephros, og metanephros. Den siste nedsatt struktur beholdes tjener som den voksne nyre-organ typisk en mesonephros eller et metanephros 2. Hver nyre-form, men har en nevronet baserte preparat 2. Den nevronet er arbeidshesten i nyrene og er ansvarlig for blodfiltrering sammen med metabolitt sekresjon og reabsorpsjon. Nephrons er enkle rørformede strukturer består av epitelceller og har en sekvensiell organisering, der diskrete, høyt spesialiserte domener av differensiert epitel utføre bestemte oppgaver. I den rekkefølge av filtratstrømmen gjennom nevronet, er det vanligvis tre hoveddeler som Comprise hver enhet: (1) den renale blodlegeme, (2) en tubuli med proksimal, mellomliggende, og distale segmenter, og (3) en samlekanal 1.. Proksimale tubuli er ansvarlig for reabsorpsjon av organiske solutes, særlig glukose og aminosyrer en. Det mellomliggende tubuli (eller løkke av Henle) er et stort område av salt og vann regulering 1. Endelig skjer finjustering av salt og andre ioner i distale tubuli og samle duct og er sterkt regulert av det endokrine systemet en. Derfra reiser filtratet gjennom ureter og blære, til slutt avslutter kroppen som et avfallsprodukt ett. Tapet av nyrefunksjonen kan stamme fra en rekke årsaker som hindrer normal nevronet aktivitet. Disse årsakene kan oppstå under nyre utvikling, for eksempel, medfødte defekter som fører til misdannelse i nephrons 5, eller årsaker fra forskjellige typer skader (som stammer fra både genetisk og environmental opprinnelse). Kjøpte skader er grovt kategoriseres som akutt nyreskade (AKI) eller kronisk nyreskade (CKD). AKI innebærer en brå tap av nyrefunksjon, ofte som følge av iskemi eller toksin eksponering 6,7. I pattedyr, er nevronet epithelial reparasjon mulig etter slike skader åtte, og mange mennesker viser full restaurering av nyrefunksjonen etter AKI. Imidlertid er AKI også forbundet med høy morbiditet og mortalitet som er rapportert over et bredt 30 - 70% forekomst område 6,7. CKD, i kontrast, er assosiert med progressiv tap av nyrefunksjon som resultat av år med langvarig skade, vanligvis assosiert med fibrose 8,9. Videre finnes et samspill mellom AKI og CKD, som begge kan disponere en person til den andre 10-12. For eksempel de som har lidd fra AKI er mer utsatt for CKD og død 13. Forekomsten av nyresykdom, både i USA og på verdensbasis, har nådd epidemic proporsjoner og er spådd å stige etter hvert som alderen befolkningen utvider-og dermed er det et økende behov for å identifisere regenerativ medisin intervensjoner for nyrene 14,15. Til tross for vissheten om at AKI pasienter kan komme seg, har det lenge vært antatt at nyrene er et organ uten medfødte regenererende krefter. Dette tradisjonelle synet har blitt dramatisk endret de siste årene 16. Studier som undersøker nyreskade hos mus og rotter etter AKI har vist at nevronet tubul epitelceller kan spre seg og gjenoppbygge funksjonelle nephrons 17-20. Selv om pattedyr har denne adaptive evne til å regenerere nephrons, er det bemerkelsesverdige begrensninger og maladaptive reaksjoner kan utløses som fører til nedsatt fibrose og CKD 21. For eksempel, en fersk studie viste at gjentatte epitelcelle ablasjon i murine nephrons var assosiert med redusert regenerering og nyre fibrose-tyder nephrons HAVea begrenset regenerering terskel 22. Det er ingen bevis for at den voksne pattedyr nyre danner nye nephrons å erstatte tapt eller skadet seg, og dermed deres ødeleggelse fører til en permanent nevronet underskudd 8,9. Interessant er det noen virveldyr svare på AKI ved å gjenoppfriske nevronet epitel og ved også å produsere nye nephrons, referert en prosess til som neonephrogenesis eller nevronet -celleregenerering 23. Neonephrogenesis oppstår i fisk etter toksin eksponering eller delvis reseksjon, og skademodeller har historisk tatt gullfisk 24,25, tilapia 26, skate 27, medaka 28, og mer nylig, sebrafisk 29,30. Av disse sebrafisk gi en levedyktig genetisk forskning modell for å oppdage de cellulære og molekylære stier ansvarlige for nedsatt regenerering. I denne videoen artikkelen viser vi hvordan å merke Nephron segmenter i voksen sebrafisk. Kunnskap om nevronet anatomi, molekylære funksjoner,og funksjonelle egenskaper er avgjørende for vellykket fremtid nyre studier med sebrafisk. Den voksne sebrafisk nyre er en mesonephros struktur og er iboende mindre kompleks i form av nevronet nummer og organisasjon enn metanephros strukturen funnet hos voksne pattedyr, avians og krypdyr 31. Imidlertid er sebrafisk nevronet segment organisasjon analogt til pattedyr, og ble først dokumentert i den embryonale nyre basert på genuttrykk studier 31-35. Sebrafisk embryo nephrons inneholde lineære tubulære segmenter som inkluderer den proksimale del av nyretubuli (PCT), proksimale rett tubulære (PST), distal tidlig (DE), og distal sent (DL) 31-35 (figur 1). Sebrafisk voksne nephrons har lignende rørsegmentene 30,31,36,37 (figur 1). PCT kan også bli identifisert ved en funksjonell fenotype: epitelceller i PCT vil innlemme fluorescensmerkede dekstran forbindelser (10-70 kD i størrelse) som er tilstede isirkulasjon, noe som har vært brukt i både embryonisk og voksen nyre sebrafisk for å vurdere endocytic opptak av disse proksimale tubul-celler 38 til 41 (figur 1). En forskjell i nevronet segmenter mellom sebrafisk og pattedyr er at sebrafisk mangler en mellom tubule, eller sløyfe av Henle 30-37; siden dette segmentet funksjoner hos pattedyr å spare vann, og sebrafisk er en ferskvannsarter uten en trang til å konsentrere urinen, er det ikke overraskende at sebrafisk mangler dette segmentet 32,33. Dermed er den samlede nevronet sammensetning i stor grad bevart mellom sebrafisk og pattedyr nyre 32,33. Disse likheter har aktivert sebrafisk for å være et effektivt verktøy for forskning for å undersøke funksjonene til renal-uttrykte gener under utviklings nephrogenesis 32-35,42 og å modellere flere nyresykdommer 43,44, for derved å legge til den betydelig liste av humane tilstander som kan bli undersøkt ved hjelpsebrafisk 45,46. I dag er den voksne sebrafisk nyre en attraktiv modell for komparative studier av nedsatt regenerering på grunn av sin genetiske tractability og ekspanderende gane av teknologiske ressurser tilgjengelig for å avhøre gen-funksjon og signalveier i denne arten. Flere studier har brukt sebrafisk mesonephros å undersøke mekanismene for regenerering etter AKI 29,30,37. For fortsatt AKI forskning ved hjelp av den voksne sebrafisk nyre, er det viktig å ha utsøkt metoder å merke ulike Nephron regioner og metoder for å kartlegge nevronet funksjonalitet. Flere metoder for voksen nyre analyse har blitt tilpasset fra embryonale nyre protokoller. Intraperitoneal injeksjon av fluorescensmerkede dekstran i den voksne sebrafisk etiketter PCT epitel i mesonephros nephrons via endocytose 30, som i sebrafisk embryo 38-41 (figur 1). Denne metoden har blitt brukt til visualize når proksimale tubuli gjenvinne sin reabsorbing eiendom etter AKI, som gjør det mulig vurdering av restaurerte fysiologiske funksjon 30 (figur 1). Et annet trekk ved nevronet proksimale tubuli er at epitelcellene i dette segmentet har en børste kant 37 som viser høye nivåer av endogen alkalisk fosfatase-aktivitet. Således kan den proksimale epitel lokaliseres visuelt i den voksne sebrafisk nyre ved hjelp av en fluorescens-basert teknikk kjent som ELF- (Enzyme-Labeled Fluorescence) -97 47. Her beskriver vi hvordan man utfører fluorescerende dekstran opptaks assays 30,48 i den voksne sebrafisk nyre, for derved å oppnå en funksjonell vurdering av de proksimale tubuli og kartlegge størrelsen og konturene av denne tubuli segmentet. Deretter beskrives teknikker for å merke de proksimale tubuli regioner av voksen nevronet med den fluorescerende markør alkalisk fosfatase. For det tredje viser vi for første gang at Rhodamin-merket lektin Dolichos biflorus agglutinin (DBA), som har vært brukt som en generell markør av oppsamlingskanalene i pattedyrnyre 49, markerer de distale tubuli av den voksne sebrafisk nyre. Som DBA er gjensidig utelukkende til alkalisk fosfatase flekker, disse etikettene gir en måte å grovt skille pan-proksimale versus pan-distale strekninger av den voksne sebrafisk nevronet. Gjennom implementeringen av disse fluorescerende flekker i både hele fjellet og Kryostat histologiske snitt, korrelerer vi disse etikettene med Expression domener av oppløst stoff transporter gener som unikt identifiserer hver nevronet segment. Derfor denne protokollen inneholder også en guide til de modifiserte vev saksbehandlingsregler for voksent vev hele fjellet i situ hybridisering (WISH) analyse basert på vår embryo WISH protokoll 50. Disse fremgangsmåtene kan brukes i forskjellige kombinasjoner (figur 2) for å dokumentere morfologiske og funksjonelle egenskaper of voksen sebrafisk nyre nephrons. Således kan disse protokoller påføres restitusjon studier, den fenotypiske karakteriseringen av andre renale sykdomsmodeller, og til og med anvendes for å studere dannelsen av den voksne nyre.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

Sebrafisk-modellen har dukket opp som et relevant system for å studere nyre utvikling, regenerering og sykdom. Både de embryonale og voksne sebrafisk nyrer er sammensatt av funksjonelle enheter som kalles nefroner, som er høyt konservert med andre virveldyr, inkludert pattedyr. Forskning i sebrafisk har nylig vist at to karakteristiske fenomener svette etter voksne nephrons medføre skade: For det første, det er robust regenerering innenfor eksisterende nephrons som erstatter de ødelagte tubulære epitelceller; andre, er helt nye nephrons produsert fra nyrestamfedre i en prosess som kalles neonephrogenesis. I kontrast til mennesker og andre pattedyr synes å ha bare en begrenset mulighet for nevronet epithelial regenerering. Til dags dato, de mekanismene som er ansvarlig for disse nyre regenerering fenomener forblir dårlig forstått. Siden voksen sebrafisk nyrer gjennomgå både nevronet epithelial regenerering og neonephrogenesis, gir de en enestående eksperimentell paraparadigme å studere disse hendelsene. Videre er det et bredt spekter av genetiske og farmakologiske verktøy tilgjengelig i sebrafisk modell som kan brukes for å avgrense de cellulære og molekylære mekanismene som regulerer nedsatt regenerering. En vesentlig del av slik forskning er evalueringen av nevronet struktur og funksjon. Denne protokollen beskriver et sett av merkingsteknikker som kan brukes for å måle nedsatt sammensetning og prøve nevronet funksjonalitet i den voksne sebrafisk nyre. Således er disse metodene er allment til den fremtidige fenotypisk karakteriseringen av voksne sebrafisk nyreskade paradigmer, som inkluderer, men er ikke begrenset til, nephrotoxicant eksponerings regimer eller genetiske metoder for målrettet celledød som nitroreductase mediert celle ablasjon teknikk. Videre kan disse fremgangsmåter benyttes til å studere genetiske forstyrrelser i voksen nyre dannelse, og kunne også bli anvendt for å vurdere statusen nedsatt under kronisk sykdom modellering.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Analyse av Nephron sammensetning og funksjon i voksen Sebrafisk Nyre

Sebrafisk voksen nyre er et utmerket system for nyre regenerering og sykdomsstudier. Et vesentlig aspekt ved slik forskning er vurderingen av nevronet struktur og funksjon. Denne protokollen beskriver flere metoder som kan iverksettes for å vurdere nevronet tubule sammensetning og å vurdere nedsatt reabsorpsjon.

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo electroporation av Morpholinos til Adult sebrafisk Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo electroporation av Morpholinos i Regenerating Adult sebrafisk Halefinner

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Blood Collection for biokjemisk analyse i Voksen sebrafisk

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Adult Sebrafisk

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Evaluering av Sebrafisk Nyre funksjon med en Fluorescent Lagersalg Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...