Name: analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney
Uploaded: 2014-08-09T14:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por fondos de RAW de las siguientes opciones: Institutos Nacionales de Salud subvenciones K01 DK083512, DP2 OD008470, y R01 DK100237; March of Dimes Basilio O&#39;Connor arranque Académico concesión de una subvención # 5 FY12-75; poner en marcha los fondos de la Universidad de Notre Dame College de Ciencia y el Departamento de Ciencias Biológicas; y un regalo generoso de la Universidad de Notre Dame de Elizabeth y Michael Gallagher, en nombre de la familia Gallagher para fomentar investigación con células madre. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Damos las gracias a los funcionarios del Departamento de Ciencias Biológicas por su apoyo, y el Centro de Investigación de Pez Cebra en Notre Dame por su dedicación excepcional en el cuidado y el bienestar de nuestra colonia pez cebra. Por último, agradecemos a los miembros de nuestro laboratorio de investigación para sus comentarios, discusiones y puntos de vista sobre este trabajo.

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, hemos descrito los métodos que permiten la visualización de los componentes del segmento de nefronas en el pez cebra adulto. La inyección de conjugados de dextrano fluorescentes permite etiquetado PCT preferencial debido a las propiedades endocíticas de estas células del túbulo proximal 30,38. Este método se puede realizar con gran flexibilidad debido a la existencia de dextranos que se puede obtener con un grupo de diferentes conjugados fluorescentes. Además, el uso de dextranos-lisina fijable es una forma especialmente conveniente para etiquetar PCT segmentos, ya que no se requieren procedimientos de etiquetado secundarias. Esto permite la detección de señal relativamente sencillo y es compatible con muchos otros marcadores fluorescentes, immunolabeling, y el uso de líneas transgénicas reportero. Etiquetado de fosfatasa alcalina también marca el túbulo proximal, con una fuerte reactividad en el PCT y reactividad ligeramente más débil en el PST. Finalmente, la tinción DBA permite el etiquetado de los segmentos tubulares distales, que muestran un characteristic ramificado morfología. Varias moléculas de lectina, que son proteínas de unión a azúcar de origen no inmune, se han utilizado ampliamente para distinguir segmentos de nefrones de mamíferos 47. Es interesante que DBA en el pez cebra se correlaciona con segmentos del túbulo distal, ya que se utiliza para marcar los conductos colectores en los riñones de mamíferos 47. Tomados en conjunto, estos métodos pueden ser utilizados en diversas combinaciones para documentar la composición y la función renal. Puesto que todos estos métodos se pueden utilizar en las preparaciones de riñón enteros, proporcionan herramientas para evaluar la estructura y la función de nefronas en todo el órgano, sin depender enteramente en el uso de más tiempo, los métodos tediosos, por ejemplo, el trabajo cryosection y immunolabeling. Sin embargo, las manchas descritas en este artículo son métodos viables en sección criogénica. Análisis criosección genera muestras (en comparación con todo el montaje) que son más adecuados para la inmunohistoquímica para detectar Pepti específicosdes, aunque, por supuesto, este tipo de análisis requiere la disponibilidad de anticuerpos primarios adecuados. Lamentablemente, uno de las principales limitaciones en el trabajo con el modelo animal pez cebra sigue siendo la escasa disponibilidad de anticuerpos. Así DESEO sigue siendo el más utilizado, es decir, &#39;go-to &quot;, procedimiento para el análisis de la expresión génica. DESEO utilizando reacciones de sustrato BCIP, NBT, y / o INT para producir precipitados morados o rojos no es compatible con la tinción fluorescente en cryosections. Una opción sería para invocar el uso de la detección de WISH fluorescente, un procedimiento que ha sido optimizado para muestras de embriones de pez cebra y podría ser adaptado para su uso con el riñón adulto. La descripción de los métodos en este artículo de vídeo debería permitir una mayor experimentación con técnicas como DESEOS fluorescente en combinación con las líneas de pez cebra transgénico en el que los segmentos individuales están etiquetados con un reportero como eGFP o mCherry. Alternativamente, los métodos descritos aquí COULd ser probado en combinación con otros colorantes vitales, por ejemplo, otras lectinas. De esta manera, una mayor adaptación y ampliación de los métodos descritos aquí se pueden invocar para satisfacer las necesidades del investigador para preparaciones enteras renales montaje y análisis. Como tales, estos métodos tienen un amplio potencial para la aplicación con el modelo de pez cebra para los estudios de regeneración en curso y también en el modelado de la enfermedad genética. Hay una necesidad apremiante para la investigación y los tratamientos innovadores para las aflicciones renales. Millones de personas sufren de algún tipo de enfermedad renal cada año que resulta de causas congénitas, agudos y / o crónicos. Además, la prevalencia de la enfermedad renal sigue aumentando en todo el mundo, por lo que estas enfermedades un problema de salud pública mundial 14,15. Tratamientos como la hemodiálisis están disponibles mediante el cual una máquina de diálisis externa sirve para extraer la sangre de los desechos metabólicos del paciente si sus riñones no son capaces de realizar este papel. Desafortunadamente, Esta intervención tiene limitaciones, como el tratamiento continuo es necesario para la supervivencia. Por otra parte, los pacientes necesitaran un trasplante de riñón, que puede tomar años para recibir una vez que un paciente se coloca en una lista de espera. Incluso después de la obtención de un trasplante de riñón, muchos pacientes sufren efectos adversos como resultado del procedimiento y deben luchar contra estos efectos para el resto de sus vidas. Estas dificultades ponen de manifiesto la necesidad seria para el desarrollo de nuevos tratamientos para ayudar a prevenir ya sea enfermedad del riñón o tal vez para aumentar la regeneración de tejidos 8,16,52,53. Dadas las limitaciones éticas evidentes del uso de sujetos de prueba humanos en laboratorios biomédicos, los modelos animales son esenciales para el estudio de la patogénesis de la enfermedad humana y para la prueba de nuevos tratamientos. Como resultado de su similitud y proximidad anatómica evolutiva, el ratón se ha convertido en el modelo más ampliamente utilizado de la enfermedad humana 45. Sin embargo, hay ciertas limitaciones con este animal, incluído,ing incapacidad para visualizar el desarrollo de órganos in vivo y la practicidad de completar pantallas genéticos a gran escala. El pez cebra es un organismo relevante y útil modelo para el estudio del desarrollo de órganos y el modelado de la enfermedad humana 45,46. En lo que respecta a las enfermedades humanas, existen homólogos funcionales en el pez cebra para casi el 70% de todos los genes humanos 54,55. Trabajos recientes han puesto de manifiesto la utilidad de pez cebra para muchas áreas de la investigación renal 31,37,56. Los estudios de regeneración y reparación en el pez cebra después de AKI sugieren que la regeneración del epitelio del túbulo y neonephrogenesis son dos procesos que se producen y se superponen a lo largo de la regeneración timecourse 30,37. El uso de un llamado gentamicina antibiótico aminoglucósido se ha utilizado como un paradigma de lesión a través del cual para estudiar los resultados de AKI en 29,30,37 adultos de pez cebra. Durante un período de dos semanas después de una lesión de aproximadamente de gentamicina, el Tubul proximales regeneran, y mientras tanto nuevas nefronas se forman a lo largo del órgano 29,30,37. En general, los mecanismos que regulan la regeneración epitelial siguen siendo muy controvertidos. En un mecanismo propuesto del proceso de reparación, no es el evento inicial de lesión aguda seguida de un desprendimiento de las células muertas en el lumen. A continuación, hay una serie de de-diferenciación, proliferación, y eventos de migración, después de lo cual las nuevas células se diferencian, repoblación de la membrana basal heridos y restaurar la función a la zona lesionada. Por otra parte, otros estudios han sugerido que las células de reemplazo se derivan de células madre / progenitoras que residen dentro de los túbulos nefrona. En cuanto al proceso de neonephrogenesis en el pez cebra, los agregados celulares se han observado siguiente AKI por inyección de gentamicina 29,30. Estos agregados posteriormente maduran hasta convertirse en nuevas nefronas que sondean en los túbulos ya existentes 29,30. El hilo común que une nefrona regeneración epitelial y neonephrogenesis es su factor de misterio enorme: en la actualidad no son exponencialmente más preguntas acerca de cómo se producen estas hazañas regenerativas que existen puntos de vista disponibles. Hasta la fecha, sin embargo, varias líneas interesantes de evidencia apoyan la noción de que la investigación de regeneración renal utilizando el pez cebra puede de hecho brindar conocimientos comparativos pertinentes en AKI humano que también puede tener directa traslacional potencial 56-58. Química de detección para identificar pequeñas moléculas que aumentan la proliferación de células progenitoras renales en el embrión de pez cebra recientemente llevado a la identificación de la -butanoato inhibidor de histona desacetilasa metil-4-(feniltio) (m4PTB) 56,57. La administración de este compuesto para las larvas de pez cebra con inducida por gentamicina-AKI reveló que la supervivencia larval aumenta y que la proliferación tubular renal se mejoró 56,58. Cuando los ratones con lesión renal aguda inducida por isquemia moderada fueron tratados con m4PTB, su recuperación se aceleró en asociation con una reducción tanto en la atrofia y el ciclo celular tubular detención de la proliferación de las células tubulares renales 58. Estos hallazgos sugieren que las vías responsables para el desarrollo normal del pez cebra renal y / o la respuesta regenerativa a AKI se conservarán con los mamíferos 56. Así, mientras que se necesitan más estudios para desmenuzar los mecanismos de regeneración-es decir, para identificar las vías de señalización que intervienen y comprender su interacción-el pez cebra proporciona una vía prometedora para perseguir esta meta importante en el campo de la nefrología. Herramientas tales como las etiquetas de células nefrona descritos en este protocolo representan un grupo de ensayos que pueden ser utilizados para evaluar la composición y la funcionalidad renal en modelos AKI. Además, se pueden aplicar para caracterizar modelos transgénicos de la enfermedad renal y pueden proporcionar maneras de identificar agentes terapéuticos químicos capaces de promover la restauración de la estructura después de la presa nefrona renalla edad.

El riñón es un órgano complejo que cumple con una multitud de funciones fisiológicas en el cuerpo. La función principal del riñón es la excreción de desechos metabólicos, y esta tarea está estrechamente entrelazada con el mantenimiento de la homeostasis de fluidos. El riñón realiza estos trabajos mediante el filtrado de la sangre y la formación de la orina, mientras que concomitantemente regulación de la presión arterial, los niveles de electrolitos y el equilibrio ácido-base. Túbulos epiteliales altamente especializadas, llamadas nefronas sirven como unidad funcional básica del riñón 1,2. En los vertebrados adultos, nefronas se organizan típicamente en una disposición en espiral que rodea herméticamente un sistema de drenaje centralizada, permitiendo así que para muchos túbulos tapen la bastante pequeño órgano. Por ejemplo, cada riñón humano puede contener más de 1 millón de nefronas 3. Otros mamíferos como el ratón son en el orden de 8 a 10.000 nefronas por riñón 4. El grado de complejidad renal difiere entre estos mamíferos y otros vertbrados debido a las variaciones en el número total de nefronas y su diseño arquitectónico dentro del riñón. Especies de vertebrados forman hasta tres estructuras renales sucesivas durante el desarrollo, y cada formulario muestra el aumento de la complejidad en lo que respecta a la dotación de nefronas y disposición: los pronefros, mesonefros y metanefros. La última estructura renal que deben conservarse sirve como el riñón adulto órgano-típicamente un mesonefros o un metanefros 2. Cada forma de riñón, sin embargo, tiene una composición basada en nefrona 2. La nefrona es el caballo de batalla de los riñones y es responsable de la filtración de la sangre junto con la secreción y reabsorción de metabolitos. Las nefronas son estructuras tubulares simples compuestas de células epiteliales y tienen una organización segmentaria, en el que los dominios discretos, altamente especializadas de los epitelios diferenciados realizar tareas específicas. En el orden del flujo de filtrado a través de las nefronas, normalmente hay tres partes principales que comprise cada unidad: (1) el corpúsculo renal, (2) un túbulo con proximal, intermedio y segmentos distales, y (3) un conducto colector 1. El túbulo proximal es responsable de la reabsorción de solutos orgánicos, principalmente glucosa y los aminoácidos 1. El túbulo intermedio (o asa de Henle) es un importante sitio de la sal y el agua la regla 1. Finalmente, ajuste fino de la sal y otros iones produce en el túbulo distal y el conducto colector y está muy regulada por el sistema endocrino 1. A partir de ahí, el filtrado viaja a través del uréter y de la vejiga, en última instancia, saliendo el cuerpo como un producto de desecho 1. La pérdida de la función renal puede deberse a multitud de causas que impiden la actividad normal de nefronas. Estas causas pueden ocurrir durante el desarrollo del riñón, por ejemplo, defectos congénitos que llevan a la malformación de nefronas 5 o causas de los diferentes tipos de lesiones (derivada de tanto genéticos como environmeorígenes NTAL). Lesiones adquiridas son una categoría como la lesión renal aguda (IRA) o insuficiencia renal crónica (ERC). AKI implica una pérdida abrupta de la función renal, a menudo como resultado de la isquemia o la toxina de exposición 6,7. En los mamíferos, la reparación del epitelio nefrona es posible después de este tipo de lesiones 8, y muchas personas presentan la restauración completa de la función renal después de AKI. Sin embargo, AKI también se asocia con una alta morbilidad y mortalidad que se han reportado en un amplio 30 - rango de incidencia del 70% 6,7. ERC, en cambio, está asociada con la pérdida progresiva de la función renal que resulta de años de daño prolongado, típicamente asociado con la fibrosis 8,9. Además, existe una interacción entre la IRA y ERC, como cualquiera puede predisponer a un individuo a otro 10-12. Por ejemplo, aquellos que han sufrido de AKI son más susceptibles a la enfermedad renal crónica e incluso la muerte 13. La incidencia de la enfermedad renal, tanto en los EE.UU. y en todo el mundo, ha alcanzado epideproporciones de micrófono y se prevé que aumentará a medida que la población de edad se amplía-por lo tanto hay una necesidad creciente de identificar intervenciones de medicina regenerativa para el riñón 14,15. A pesar del conocimiento de que los pacientes con LRA pueden recuperar, por mucho tiempo se ha pensado que el riñón es un órgano sin poderes regenerativos innatas. Esta visión tradicional ha sido revisado de manera espectacular en los últimos años 16. Los estudios que investigan el daño renal en ratones y ratas después de la IRA han demostrado que las células epiteliales de los túbulos nefrona pueden proliferar y reconstruir nefronas funcionales 17-20. Aunque los mamíferos poseen esta capacidad de adaptación para regenerar nefronas, existen limitaciones notables y las respuestas de mala adaptación puede ser desencadenados que conducen a la fibrosis renal y ERC 21. Por ejemplo, un estudio reciente demostró que la ablación repetida de células epiteliales en nefronas murinos se asoció con la regeneración disminuida y fibrosis nefronas renales HAV-sugiriendoea limita umbral de regeneración 22. No hay evidencia de que el riñón de mamíferos adultos forma nuevas nefronas para reemplazar los perdidos o dañados, por lo tanto su destrucción conduce a un déficit de 8,9 nefrona permanente. Curiosamente, algunos vertebrados responden a AKI por la regeneración de los epitelios de nefronas y también la producción de nuevas nefronas, un proceso conocido como neonephrogenesis o nefrona neogénesis 23. Neonephrogenesis ocurre en los peces después de la exposición a tóxicos o resección parcial y modelos de lesión históricamente han incluido los peces de colores 24,25, tilapia 26, patín 27, medaka 28, y más recientemente, el pez cebra 29,30. De éstos, el pez cebra proporcionar un modelo de investigación genética viable para descubrir las vías celulares y moleculares responsables de la regeneración renal. En este artículo de vídeo, nos demuestran cómo etiquetar los segmentos de la nefrona en el pez cebra adulto. El conocimiento de la anatomía de nefronas, las características moleculares,y las características funcionales son esenciales para los estudios renales futuros exitosos utilizando el pez cebra. El riñón adultos de pez cebra es una estructura mesonefros y es inherentemente menos complejo en cuanto a número de nefronas y organización de la estructura metanefros se encuentra en los mamíferos adultos, aves y reptiles 31. Sin embargo, la organización del segmento de nefronas pez cebra es análogo a los mamíferos, y se documentó por primera vez en el riñón de embriones en base a estudios de expresión génica 31-35. Nefronas embrión de pez cebra contienen segmentos lineales tubulares que incluyen el túbulo contorneado proximal (PCT), túbulo proximal recto (PST), distal temprana (DE), y distal tardía (DL) 31-35 (Figura 1). Nefronas adultos de pez cebra poseen segmentos tubulares similares 30,31,36,37 (Figura 1). El PCT también se puede identificar por un fenotipo funcional: las células epiteliales en la PCT incorporarán compuestos de dextrano marcados con fluorescencia (10-70 kDa en tamaño) presentes en elcirculación, que se ha utilizado tanto en el pez cebra riñón embrionarias y adultas para evaluar la captación endocítica por estas células del túbulo proximal 38-41 (Figura 1). Una de las diferencias en los segmentos de la nefrona entre el pez cebra y mamíferos es que el pez cebra carecen de un túbulo intermedio o asa de Henle 30-37; ya que este segmento funciones en los mamíferos para conservar el agua, y el pez cebra son una especie de agua dulce, sin la urgencia de concentrar la orina, no es de extrañar que el pez cebra carecen de este segmento de 32,33. Así, la composición global nefrona se conserva en gran medida entre el pez cebra y el riñón de los mamíferos 32,33. Estas similitudes han permitido pez cebra a ser una herramienta de investigación eficaz para investigar las funciones de los genes renales-expresado durante nefrogénesis desarrollo 32-35,42 y modelar numerosas enfermedades renales 43,44, lo que añade a la lista sustancial de las condiciones humanas que pueden ser investigado utilizandopez cebra 45,46. Hoy en día, el riñón adultos de pez cebra es un modelo atractivo para los estudios comparativos de la regeneración renal debido a su maleabilidad genética y el paladar expansión de los recursos tecnológicos disponibles para interrogar a la función de genes y vías de señalización en esta especie. Varios estudios han utilizado el mesonefros pez cebra para investigar los mecanismos de regeneración después de AKI 29,30,37. Para continuar la investigación AKI usando el riñón adultos de pez cebra, es esencial disponer de métodos exquisitos para etiquetar las diferentes regiones y métodos nefrona para estudiar la funcionalidad de nefronas. Existen varios métodos para el análisis de riñón adulto han sido adaptados de los protocolos de riñón embrionario. La inyección intraperitoneal de dextrano marcado con fluorescencia en el pez cebra adultos etiqueta el epitelio PCT en mesonefros nefronas a través de endocitosis 30, como en embriones de pez cebra 38-41 (Figura 1). Este método ha sido utilizado para visualize cuando los túbulos proximales a recuperar su propiedad reabsorbiendo siguiente AKI, que permite una evaluación de la función fisiológica restaurado 30 (Figura 1). Otra característica de la nefrona túbulo proximal es que las células epiteliales en este segmento poseen un borde en cepillo 37 que muestra altos niveles de actividad de la fosfatasa alcalina endógena. Por lo tanto, el epitelio proximal puede ser localizada visualmente en el riñón pez cebra adultos usando una técnica basada en la fluorescencia conocido como elfo (marcado con enzima-Fluorescencia) -97 47. Aquí se describe cómo llevar a cabo ensayos de absorción de dextrano fluorescentes 30,48 en el riñón adultos de pez cebra, a fin de obtener una evaluación funcional del túbulo proximal y mapear el tamaño y los contornos de este segmento tubular. A continuación, se describen las técnicas para etiquetar las regiones del túbulo proximal de la nefrona adulto con la etiqueta fluorescente fosfatasa alcalina. En tercer lugar, se muestra por primera vez que el rodioamina marcada con lectina aglutinina Dolichos biflorus (DBA), que se ha utilizado como un marcador general de los conductos colectores en el riñón de los mamíferos 49, marca los túbulos distales del riñón adultos de pez cebra. Como DBA es mutuamente exclusivo a la tinción de fosfatasa alcalina, estas etiquetas proporcionan una manera de distinguir ampliamente pan-proximal frente tramos pan-distales de la nefrona adultos de pez cebra. A lo largo de la ejecución de estas manchas fluorescentes en toda ambas montura y secciones histológicas de criostato, relacionamos estas etiquetas con dominios de expresión de genes transportadores de soluto que identifican de forma única cada segmento de la nefrona. Por lo tanto, este protocolo también contiene una guía de los procedimientos de procesamiento de tejidos modificados para tejido adulto todo el montaje hibridación in situ (DESEO) el análisis basado en el protocolo DESEO embrión 50. Estos procedimientos se pueden utilizar en diversas combinaciones (Figura 2) para documentar atributos morfológicos y funcionales of adultos nefronas renales pez cebra. Por lo tanto, estos protocolos se pueden aplicar a estudios de regeneración, la caracterización fenotípica de otros modelos de enfermedades renales, e incluso utilizarse para estudiar la formación del riñón adulto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

El modelo de pez cebra se ha convertido en un sistema relevante para estudiar el desarrollo del riñón, la regeneración y la enfermedad. Tanto los riñones de pez cebra embrionarias y adultas se componen de unidades funcionales conocidas como nefronas, que son altamente conservadas con otros vertebrados, incluyendo mamíferos. Investigación en el pez cebra se ha demostrado recientemente que los dos fenómenos distintivos transpiran después de nefronas adultos incurren en daños: en primer lugar, hay una regeneración robusta dentro de las nefronas existentes que reemplaza las células epiteliales del túbulo destruidas; segundo, totalmente nuevas nefronas se producen a partir de progenitores renales en un proceso conocido como neonephrogenesis. En contraste, los seres humanos y otros mamíferos parecen tener sólo una capacidad limitada para la regeneración epitelial nefrona. Hasta la fecha, los mecanismos responsables de estos fenómenos de regeneración renal siguen siendo poco conocidos. Desde riñones pez cebra adultos sufren tanto nefrona regeneración epitelial y neonephrogenesis, proporcionan un párrafo experimental excepcionalparadigma para estudiar estos eventos. Además, existe una amplia gama de herramientas genéticas y farmacológicas disponibles en el modelo de pez cebra que se pueden utilizar para delinear los mecanismos celulares y moleculares que regulan la regeneración renal. Un aspecto esencial de este tipo de investigación es la evaluación de la estructura y función de nefronas. Este protocolo describe un conjunto de técnicas de etiquetado que se pueden utilizar para medir la composición y la funcionalidad renal nefrona prueba en el riñón adultos de pez cebra. Por lo tanto, estos métodos son ampliamente aplicables para el futuro caracterización fenotípica de los paradigmas de pez cebra adultos lesión renal, que incluyen pero no se limitan a, los regímenes de exposición nephrotoxicant o métodos genéticos de la muerte celular específica, tales como la técnica de ablación celular mediada por nitrorreductasa. Además, estos métodos pueden ser utilizados para estudiar la formación de perturbaciones genéticas en riñón adulto y también podrían aplicarse para evaluar el estado renal durante el modelado de la enfermedad crónica.

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Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Análisis de Composición Nephron y función en el riñón adultos de pez cebra

El riñón adultos de pez cebra es un sistema excelente para estudios de regeneración y enfermedad renal. Un aspecto esencial de este tipo de investigación es la evaluación de la estructura y función de nefronas. Este protocolo describe varios métodos que se pueden aplicar para evaluar la composición de túbulos nefrona y para evaluar la reabsorción renal.

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

El trasplante de médula del riñón entero en adultos de pez cebra

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Investigación

Biología

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

La disección de los órganos del pez cebra adultos

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

El trasplante de células directamente en el riñón de adultos de pez cebra

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

La disección del riñón adultos de pez cebra

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

En electroporación in vivo de Morpholinos en la regeneración de adultos de pez cebra Aleta de cola

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Extracción de sangre para análisis bioquímicos en adultos de pez cebra

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavage adultos de pez cebra

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Evaluación del pez cebra función renal mediante un ensayo de Liquidación fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...