Name: analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney
Uploaded: 2014-08-09T14:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Detta arbete stöddes av finansiering till RAW något av följande: National Institutes of Health ger K01 DK083512, DP2 OD008470 och R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor Startat Scholar beviljande av bidrag nr 5-FY12-75; starta medel från University of Notre Dame College of Science och Institutionen för Biological Sciences; och en generös gåva till University of Notre Dame från Elizabeth och Michael Gallagher på uppdrag av Gallagher familj att främja stamcellsforskning. De finansiärer hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet. Vi tackar de stavar av Institutionen för Biological Sciences för deras stöd, och Centrum för Zebrafish forskning vid Notre Dame för deras enastående engagemang i vård och omsorg i vår zebrafisk koloni. Slutligen tackar vi medlemmarna i vår forskningslabb för sina kommentarer, diskussioner och insikter om det arbetet.

Författarna har ingenting att lämna ut.

Här har vi beskrivit metoder som möjliggör visualisering av komponenter nephron segment i den vuxna zebrafisk. Injektion av fluorescerande dextran konjugat möjliggör förmånliga PCT märkning grund de endocytiska egenskaperna hos dessa proximala tubuli celler 30,38. Denna metod kan utföras med stor flexibilitet på grund av förekomsten av dextraner som kan erhållas med en uppsjö av olika fluorescerande konjugat. Dessutom är användningen av lysin-fixerbar dextraner ett särskilt bekvämt sätt att märka PCT segment, som sekundära förfaranden för märkning inte krävs. Detta möjliggör relativt enkelt signaldetektering och är kompatibel med många andra fluorescerande markörer, immunomärkning och användning av transgena reporter linjer. Alkaliskt fosfatas märkning markerar också den proximala tubuli, med stark reaktivitet i PCT och något svagare reaktivitet i PST. Slutligen möjliggör märkning av distala tubuli segment, som visar en ch DBA färgningaracteristic grenad morfologi. Olika lektinmolekyler, som är sockerbindande proteiner av icke-immunt ursprung, har använts i stor utsträckning för att skilja däggdjur Nephron segment 47. Det är intressant att DBA i zebrafisk korrelerar med distala tubuli segment, eftersom det används för att markera samlingsrör i däggdjursnjurarna 47. Tillsammans kan dessa metoder utnyttjas i olika kombinationer för att dokumentera njur sammansättning och funktion. Eftersom alla dessa metoder kan användas i hela njurpreparat ger de verktyg för att utvärdera nephron struktur och funktion genom hela orgeln utan att helt förlita sig på användningen av mer tidskrävande, tråkiga metoder, till exempel, kryosektion arbete och immunomärkning. Men fläckarna som beskrivs i denna metoder artikeln är livskraftiga i kryosektion. Kryosektion analys genererar prover (jämfört med hela berget) som är bättre lämpade för immunohistokemi för att påvisa specifika peptides, men naturligtvis denna typ av analys kräver tillgång till lämpliga primära antikroppar. Tyvärr en stor begränsning i att arbeta med zebrafisk djurmodell fortfarande den dåliga tillgången på antikroppar. Således WISH fortfarande den mest använda, det vill säga, &quot;gå till&quot; förfarande för analys av genuttryck. ÖNSKAR använder BCIP, NBT, och / eller INT substratreaktioner för att producera lila eller röda fällningar inte är förenlig med fluorescerande färgning på kryosnitt. Ett alternativ skulle vara att åberopa användningen av fluorescerande WISH upptäckt, ett förfarande som har optimerats för zebrafisk embryonala prover och kan skräddarsys för användning med den vuxna njuren. Beskrivningen av de metoder som i denna video artikeln bör möjliggöra ytterligare experiment med tekniker som fluorescerande WISH i kombination med transgena zebrafisk linjer där enskilda segmenten är märkta med en reporter som EGFP eller mCherry. Alternativt kan de metoder som beskrivs här Could testas i kombination med andra vitala färgämnen, till exempel, andra lektiner. Således kan ytterligare anpassning och utbyggnad av de metoder som beskrivs här åberopas för att passa forskarens behov av hela monteringsnjur förberedelser och analys. Som sådana dessa metoder har en bred potential för genomförande med zebrafisk modell för pågående förnyelse studier och även i genetisk modellering sjukdom. Det finns ett stort behov av innovativ forskning och behandlingar för njur lidanden. Miljontals människor lider av någon form av njursjukdom varje år som beror på medfödda, akuta och / eller kroniska orsaker. Vidare, förekomsten av njursjukdom fortsätter att stiga i hela världen, vilket gör dessa sjukdomar en global folkhälsofråga 14,15. Behandlingar såsom hemodialys finns varvid en extern dialysmaskin tjänar till att befria en patients blod av metabolisk avfall om deras njurar inte kan utföra denna uppgift. Tyvärr, Har detta ingripande begränsningar, eftersom pågående behandling är nödvändig för överlevnad. Dessutom kommer patienter till slut att kräva en njurtransplantation, vilket kan ta år att få en gång en patient placeras på en väntelista. Även efter att få en njurtransplantation, många patienter drabbas av negativa effekter till följd av förfarandet och måste kämpa dessa effekter för resten av deras liv. Dessa svårigheter visar på allvarliga behov av att utveckla nya behandlingar för att antingen hjälpa till att förebygga njursjukdom eller att kanske öka vävnadsregenerering 8,16,52,53. Med tanke på de uppenbara etiska begränsningarna i användningen av mänskliga försökspersoner i biomedicinska laboratorier, djurmodeller är viktiga för studiet av mänskliga sjukdomar patogenes och för testning av nya behandlingar. Som ett resultat av dess anatomiska likheter och evolutions närhet, har musen blivit den mest använda modellen för mänskliga sjukdomar 45. Det finns emellertid vissa begränsningar med detta djur, including oförmåga att visualisera organutveckling in vivo och praktiska slutföra storskaliga genetiska skärmar. Zebrafisk är en relevant och användbar modellorganism för att studera organutveckling och modellering av mänskliga sjukdomar 45,46. När det gäller mänskliga sjukdomar, funktionella homologer i zebrafisk finnas för nästan 70% av alla mänskliga gener 54,55. Senaste arbete har visat på nyttan av zebrafisk för många områden av njurforskning 31,37,56. Studier av förnyelse och reparation i zebrafisk efter AKI tyder på att tubuli epiteliala förnyelse och neonephrogenesis är två processer som sker och överlappar hela regenere tidsförloppet 30,37. Användningen av ett aminoglykosidantibiotikum kallas gentamicin har använts som en skade paradigm genom att studera resultaten av AKI i vuxen zebrafisk 29,30,37. Under en cirka två veckor efter skada från gentamicin, den proximala tubules regenerera, och under tiden nya nefroner bildas hela orgeln 29,30,37. I allmänhet är de mekanismer som reglerar epiteliala förnyelse är fortfarande mycket kontroversiell. I en föreslagen mekanism för reparationen, det är den initiala akut skada händelse följs av en sårskorpa av döda celler in i lumen. Därefter finns det en rad de-differentiering, proliferation och migrationshändelser, varefter nya celler differentierar, återinplantering den skadade basalmembranet och återställa funktionen i skadade platsen. Alternativt har andra studier tyder på att ersättningsceller uppstår stam / progenitorceller som bor inom Nephron tubuli. När det gäller processen för neonephrogenesis i zebrafisk har cellulära aggregat observerats följande AKI med gentamicin injektion 29,30. Dessa aggregat senare mogna till nya nefroner som Plumb i redan existerande tubuli 29,30. Den röda tråden som förenar nephron epiteliala förnyelse och neonephrogenesis är deras blotta mysterium Faktor: för närvarande finns exponentiellt fler frågor om hur dessa regenerativa bedrifter inträffar än det finns tillgängliga insikter. Men hittills, flera spännande bevislinjer stödjer uppfattningen att njurregenere forskning med zebrafisk faktiskt kan ge relevanta jämförelse insikter i mänskligt AKI som också kan ha direkt translationell potential 56-58. Kemisk screening för att identifiera små molekyler som ökar proliferationen av renala progenitorceller i den zebrafisk embryot nyligen lett till identifiering av histondeacetylasinhibitorn metyl-4-(fenyltio) butanoat (m4PTB) 56,57. Administration av denna förening till zebrafisk larver med gentamicin-inducerad AKI visade att larver överlevnad ökat och att renal tubulär proliferation förstärktes 56,58. När möss med måttlig ischemiinducerad AKI behandlades med m4PTB, var deras återhämtning påskyndas i intressebolagiation med en minskning av både tubulär atrofi och cellcykelstopp av prolifererande njur tubulära celler 58. Dessa resultat tyder på att de vägar som ansvarar för normal zebrafisk njurutveckling och / eller den regenerativa svar på AKI kommer att bevaras med däggdjur 56. Medan ytterligare studier behövs för att retas isär mekanismerna för förnyelse-nämligen att identifiera de signalvägar som är involverade och förstå deras interaktion-zebrafisk ger ett lovande sätt att fullfölja detta viktiga mål inom nefrologi fältet. Verktyg såsom nefronet celletiketter som beskrivs i detta protokoll utgör en grupp av analyser som kan användas för att utvärdera njur sammansättning och funktion i AKI-modeller. Vidare kan de användas för att karaktärisera transgena modeller av njursjukdom och kan ge sätt att identifiera kemiska läkemedel med förmåga att främja återställande av nefronet struktur efter njur dammenålder.

Njuren är ett komplext organ som uppfyller en mängd olika fysiologiska funktioner i kroppen. Den främsta funktionen av njuren är metaboliskt avfall utsöndring, och denna uppgift är tätt sammanflätad med underhåll av vätska homeostas. Njuren utför dessa jobb genom att filtrera blodet och bildar urin, medan samtidigt reglera blodtrycket, elektrolytnivåer och syra-bas balansen. Mycket specialiserade epitelceller tubuli kallas nefroner fungera som den grundläggande funktionell enhet i njuren 1,2. Hos vuxna ryggradsdjur är nephrons vanligtvis organiserade i en tätt lindad arrangemang kring ett centraliserat avloppssystem, vilket möjliggör många tubuli att packa in i ganska liten orgel. Till exempel kan varje mänsklig njure innehålla över en miljon nefroner 3. Andra däggdjur som musen har i storleksordningen 8-10.000 nephrons per njure 4. Graden av njur komplexitet skiljer mellan dessa däggdjur och andra vertebrates på grund av variationer i totalt nefronet nummer och deras arkitektoniska utformning i njuren. Ryggradsdjur bildar så många som tre på varandra följande njurstrukturer under utveckling, och var och en för visas ökande komplexiteten när det gäller nefronet kapitalförsäkring och arrangemang: de pronephros, mesonephros och metanefros. Den sista njur struktur som ska behållas fungerar som den vuxna njurorgan vanligtvis ett mesonephros eller metanefros 2. Varje njure formen har emellertid en nefronet baserad komposition 2. Nefronet är arbetshästen i njuren och ansvarar för blodfiltrering tillsammans med metabolit sekretion och reabsorption. Nephrons är enkla rörformiga strukturer som består av epitelceller och har en segmentell organisation, där diskreta, mycket specialiserade områden av differentierade epitel utföra specifika uppgifter. I storleksordningen filtratflödet genom nefronet, det finns typiskt tre huvuddelar som comprise varje enhet: (1) njurblodkropp, (2) en tubuli med proximal, mellanliggande och distala segment och (3) en samlingskanal 1. Den proximala tubulus är ansvariga för resorptionen av organiska lösta ämnen, notably glukos och aminosyror 1. Mellan tubuli (eller Henles slynga) är en viktig plats för salt och vattenreglering 1. Slutligen finjustering av salt och andra joner förekommer i distala tubuli och samla kanal och är starkt reglerad av det endokrina systemet 1. Därifrån färdas filtratet genom urinledaren och urinblåsan, i sista hand ut ur kroppen som en avfallsprodukt 1. Förlusten av njurfunktion kan bero på en mängd orsaker som hindrar normal nefronet aktivitet. Dessa orsaker kan förekomma under njurutveckling, t.ex. medfödda defekter som leder till missbildning av nefroner 5, eller orsaker från olika typer av skador (till följd av både genetiska och environmental ursprung). Förvärvade skador är i stort sett kategoriseras som akut njurskada (AKI) eller kronisk njurskada (CKD). AKI innebär en plötslig förlust av njurfunktion, ofta till följd av ischemi eller toxinexponering 6,7. Hos däggdjur är nephron epitel reparation möjligt efter sådana skador åtta, och många människor uppvisar fullständigt återupprättande av njurfunktionen efter AKI. Dock är AKI också förknippad med hög morbiditet och mortalitet som har rapporterats på bred 30-70% förekomst Område 6,7. CKD däremot förknippas med progressiv förlust av njurfunktion som är resultatet av år av långvarig skada, vanligtvis förknippas med fibros 8,9. Vidare föreligger ett samspel mellan AKI och CKD, som endera kan predisponera en person till den andra 10-12. Till exempel de som har drabbats av AKI är mer mottagliga för CKD och med död 13. Incidensen av njursjukdom, både i USA och i hela världen, har nått epidemic proportioner och spås stiga som den åldrade befolkningen expanderar-därför finns det ett växande behov av att identifiera regenerativ medicin interventioner för njuren 14,15. Trots kunskapen om att AKI patienter kan återhämta sig, har det länge varit tänkt att njuren är ett organ utan medfödda regenerativ befogenheter. Denna traditionella uppfattning har dramatiskt reviderats under de senaste åren 16. Studier som undersöker njurskador hos möss och råttor efter AKI har visat att nefronet tubuli epitelceller kan föröka sig och bygga funktionella nephrons 17-20. Även däggdjur besitter denna adaptiva förmåga att regenerera nefroner, det finns anmärkningsvärda begränsningar och maladaptiv reaktioner kan utlösas som leder till renal fibros och CKD 21. Till exempel visade en färsk undersökning att upprepade epitelceller ablation i murina nefroner var associerad med minskad förnyelse och njur fibros-tyder nephrons HAVea begränsad regeneretröskel 22. Det finns inga belägg för att den vuxna däggdjurs njuren bildar nya nephrons att ersätta förlorade eller skadade sådana, alltså deras undergång leder till en permanent 8,9 nefronet underskott. Intressant nog har vissa ryggradsdjur svarar på AKI genom att regenerera nephron epitel och även producera nya nefroner, avses en process för att så neonephrogenesis eller nephron neogenesis 23. Neonephrogenesis förekommer i fisk efter toxinexponering eller partiell resektion, och skademodeller har historiskt inkluderat guldfisk 24,25, tilapia 26, skridsko 27 medaka 28, och på senare tid, zebrafisk 29,30. Av dessa zebrafisk ger en livskraftig genetisk forskning modell för att upptäcka de cellulära och molekylära vägar som ansvarar för njur förnyelse. I denna video artikeln visar vi hur man kan märka Nephron segment vuxna zebrafisk. Kunskap om nefronet anatomi, molekylära egenskaper,och funktionella egenskaper är väsentliga för framgångsrika framtida njur studier med zebrafisk. Den vuxna zebrafisk njuren är en mesonephros struktur och sin natur är mindre komplex när det gäller nefronet nummer och organisation än den metanefros struktur som finns i vuxna däggdjur, fåglar och reptiler 31. Dock är zebrafisk organisation nephron segment analogt med däggdjur, och dokumenterades först i embryonala njur baserad på genuttryck studier 31-35. Zebrafisk embryo nephrons innehåller linjära tubuli segment som inkluderar proximala tubuli (PCT), proximala tubuli raka (PST), distal tidigt (DE) och distal sent (DL) 31-35 (Figur 1). Zebrafisk vuxna nephrons besitter liknande rörformiga segmenten 30,31,36,37 (Figur 1). PCT kan också identifieras genom en funktionell fenotyp: epitelceller i PCT kommer att innehålla fluorescerande dextran föreningar (10-70 kDa i storlek) som finns icirkulation, som har använts i både embryonala och vuxna zebrafisk njure att bedöma endocytiska upptagningen av dessa proximala tubuliceller 38-41 (Figur 1). En skillnad i Nephron segment mellan zebrafisk och däggdjur är att zebrafisk saknar en mellan tubuli eller Henles slynga 30-37; eftersom detta segment fungerar hos däggdjur för att spara vatten, och zebrafisk är en sötvattensarter utan en brådskande att koncentrera sin urin, är det inte förvånande att zebrafisk saknar detta segment 32,33. Således är den totala nefronet sammansättningen i stort sett bevarad mellan zebrafisk och däggdjur njure 32,33. Dessa likheter har aktiverat zebrafisk sig vara ett effektivt sökverktyg för att undersöka funktioner njur-uttryckta gener under utvecklings nephrogenesis 32-35,42 och att modellera många njursjukdomar 43,44 och därmed lägga till den omfattande förteckning över mänskliga förhållanden som kan vara undersöktes med användning avzebrafisk 45,46. Idag är den vuxna zebrafisk njuren en attraktiv modell för jämförande studier av njur förnyelse på grund av sin genetiska spårbarhet och växande gommen av tekniska resurser tillgängliga för att förhöra geners funktion och signalvägar i denna art. Flera studier har använt de zebrafisk mesonephros att undersöka mekanismerna för förnyelse efter AKI 29,30,37. För fortsatt AKI forskning med den vuxna zebrafisk njuren, är det viktigt att ha utsökta metoder för att märka olika Nephron regioner och metoder för att kartlägga nefronet funktionalitet. Flera metoder för vuxna njuranalys har anpassats efter embryonala njurprotokoll. Intraperitoneal injektion av fluorescensmärkt dextran i den vuxna zebrafisk etiketter PCT epitelet i mesonephros nefroner via endocytos 30, såsom i zebrafiskembryon 38-41 (Figur 1). Denna metod har använts för att visualize när proximala tubuli återfå sin reabsorbing egendom efter AKI, vilket möjliggör en bedömning av restaurerade fysiologisk funktion 30 (Figur 1). En annan funktion i nefronet proximala tubulus är att epitelcellerna i detta segment har en borste kant 37 som visar höga nivåer av endogen alkaliskt fosfatas-aktivitet. Sålunda kan den proximala epitel lokaliseras visuellt i den vuxna zebrafisk njure med användning av en fluorescens-baserad teknik som kallas ELF- (enzymmärkt Fluorescens) -97 47. Här beskriver vi hur du utför fluorescerande dextran upptagsanalyser 30,48 i den vuxna zebrafisk njuren, för att erhålla en funktionell bedömning av den proximala tubuli och kart storleken och konturerna av denna tubuli segment. Därefter beskriver vi metoder för att märka de proximala tubuli regioner i vuxen nephron med den fluorescerande märkningen alkaliskt fosfatas. För det tredje visar vi för första gången som rhodamin-märkta lektinet Dolichos biflorus agglutinin (DBA), som har använts som en allmän markör för uppsamlingskanalerna i däggdjursnjur 49, markerar de distala tubuli i den vuxna zebrafisk njure. Som DBA är ömsesidigt uteslutande till alkaliskt fosfatas färgning, dessa etiketter ger ett sätt att i stort sett skilja pan-proximala kontra pan-distala delarna av den vuxna zebrafisk nefronet. Under hela genomförandet av dessa fluorescerande fläckar i både hela berget och kryostat histologiska snitt, vi korrelerar dessa etiketter med uttrycks domäner av löst ämne transportörgener som unikt identifierar varje nefronet segment. Därför är detta protokoll innehåller också en guide till de ändrade förfarandena vävnads bearbetning för vuxen vävnad hela montera in situ hybridisering (WISH) analys, baserade på vår embryo WISH protokoll 50. Dessa procedurer kan användas i olika kombinationer (figur 2) för att dokumentera morfologiska och funktionella attribut of vuxna zebrafisk njure nefroner. Sålunda kan dessa protokoll appliceras på regenereringsstudier, den fenotypiska karaktäriseringen av andra modeller med njursjukdom, och även användas för att studera bildningen av den vuxna njuren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

Den zebrafisk modellen har vuxit fram som ett relevant system för att studera njurutveckling, förnyelse och sjukdom. Både de embryonala och vuxna zebrafisk njurar består av funktionella enheter som kallas nefroner, som är mycket konserverade med andra ryggradsdjur, inklusive däggdjur. Forskning inom zebrafisk har nyligen visat att två distinkta fenomen genomsyra efter vuxna nefroner medföra skador: först, det är robust förnyelse inom befintliga nefroner som ersätter de förstörda tubuli epitelceller; andra är helt nya nefroner framställts av njur stamceller i en process som kallas neonephrogenesis. Däremot människor och andra däggdjur verkar ha en begränsad förmåga till nefronet epiteliala förnyelse. Hittills har de mekanismer som ansvarar för dessa njurregenere fenomen förblir dåligt kända. Eftersom vuxna zebrafisk njure genomgår både nefronet epiteliala förnyelse och neonephrogenesis, de ger en enastående experimentellt paraparadigmet för att studera dessa händelser. Vidare finns det ett brett utbud av genetiska och farmakologiska verktyg som finns i zebrafisk modell som kan användas för att avgränsa de cellulära och molekylära mekanismer som reglerar njur förnyelse. En viktig aspekt av denna forskning är utvärderingen av nefronet struktur och funktion. Detta protokoll beskriver en uppsättning av märkningstekniker som kan användas för att mäta njur sammansättning och prov nefronet funktionalitet i den vuxna zebrafisk njure. Således är dessa metoder är allmänt gäller för den framtida fenotypisk karaktärisering av vuxna zebrafisk njurskada paradigm, som inkluderar, men är inte begränsade till, nephrotoxicant exponerings regimer eller genetiska metoder för riktade celldöd såsom nitroreduktas medierad cell ablation teknik. Vidare kan dessa metoder användas för att studera genetiska störningar i vuxennjurbildningen och kan också användas för att bedöma njurstatus vid kronisk sjukdom modellering.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Analys av Nephron sammansättning och funktion i vuxen Zebrafish Kidney

Den zebrafisk vuxna njuren är ett utmärkt system för njur förnyelse och sjukdomsstudier. En viktig aspekt av denna forskning är bedömningen av nefronet struktur och funktion. Detta protokoll beskriver flera metoder som kan genomföras för att bedöma nephron tubuli sammansättning och för att utvärdera njur reabsorption.

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Transplantation av hela Njure Marrow i vuxen Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissektion av organ från vuxna Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Intraperitoneal injektion i vuxen Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Transplantation av celler direkt in i njuren för vuxna Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Dissekering av vuxna Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo elektroporering av Morpholinos i Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Elektroporering av Morpholinos i Regenerating Adult Zebrafish stjärtfenan

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Blodinsamling för biokemisk analys i vuxen Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging vuxna zebrafisk

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Utvärdering av Zebrafish njurfunktion med hjälp av en fluorescerande Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...