Name: analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney
Uploaded: 2014-08-09T14:00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Bu çalışma aşağıdaki gelen RAW fon tarafından desteklenmiştir: Ulusal Sağlık Enstitüleri K01 DK083512, DP2&#39;deki OD008470, ve R01 DK100237 verir; Dimes Basil O&#39;Connor Başlatan Bilgin hibe # 5-FY12-75 Mart; Bilim ve Biyolojik Bilimler Bölümü Notre Dame Koleji Üniversitesi&#39;nden fon başlatmak; ve Gallagher Ailesi adına Elizabeth ve Michael Gallagher Notre Dame Üniversitesi cömert bir hediye kök hücre araştırmaları teşvik etmek. Maliyeciler çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayımlamak kararı, ya da yazının hazırlanmasında herhangi bir rolü vardı. Biz onların destek için Biyolojik Bilimler Bölümü kurmayları teşekkür ederiz ve bizim zebrabalıkları koloninin bakım ve refah onların üstün özveri için Notre Dame de Zebra Araştırma Merkezi. Son olarak, bu çalışma konusunda yorumlar, tartışmalar ve anlayışlar için bizim araştırma laboratuvarında üyelerine teşekkür ederim.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada, biz yetişkin zebrabalıkları nefron segmenti bileşenlerin görselleştirme izin yöntemler tarif etmişlerdir. Floresan dekstran konjügatların enjeksiyonu bu proksimal tübül hücrelerinin 30,38 endositik özellikleri nedeniyle tercihli PCT etiketleme sağlar. Bu yöntem, farklı floresan konjugatlarının bir kuş sürüsü ile elde edilebilir dekstranlar varlığından büyük bir esneklik ile yapılabilir. İkinci etiketleme işlemleri gerekli değildir Buna ek olarak, lizin tamir edilebilir dekstranlar kullanımı PCT kesimleri etiketlemek için özellikle uygun bir yoldur. Bu, nispeten basit bir sinyal tespit edilmesini sağlar ve diğer birçok floresan etiketler, immunolabeling ve raportör transgenik çizgiler kullanımı ile uyumludur. Alkalin fosfataz Etiket aynı zamanda, PST PCT güçlü reaktivite ve biraz daha zayıf bir reaktiviteye sahip, proksimal tübül işaretler. Son olarak, DBA boyama bir ch gösterilecek uzak tübül segmentlerinde, etiketleme sağlararacteristic morfolojisi dallıdır. Immün olmayan kökenli, şeker bağlayıcı proteinler olan çeşitli lektin molekülleri, memeli nefron kesimleri 47 ayırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. O memeli böbreklerde 47. toplama kanalları işaretlemek için kullanılır gibi zebrabalıkları DBA, distal tübül kesimleri ile korelasyon olması ilginçtir. Birlikte ele alındığında, bu yöntemler, böbrek bileşimi ve işlevini belge çeşitli kombinasyonlar halinde kullanılabilir. Bu yöntemlerin hepsi tüm böbrek hazırlıklar kullanılabilir beri, tamamen daha fazla zaman tüketen, sıkıcı yöntemlerle, örneğin, cryosection iş ve immunolabeling kullanımına dayanmadan organın her nefron yapısını ve fonksiyonunu değerlendirmek için araçlar sağlar. Bununla birlikte, bu yöntemler, makalede açıklanan lekeleri cryosection olarak geçerli değildir. Cryosection analizi immünohistokimyası belirli peptidleri algılamak için daha uygundur (bütün montaj kıyasla) örnekleri oluştururDES, ancak elbette bu tip analiz uygun bir birincil antikor kullanılmasını gerektirir. Ne yazık Zebrafish hayvan modeli ile çalışan bir büyük sınırlama antikorların düşük mevcudiyet kalır. Böylece WİSH yani, en yaygın olarak kullanılan kalır &#39;git, gen ekspresyonunun analizi için prosedür. Mor veya kırmızı çökeltileri üretmek için BCIP NBT ve / veya INT substrat reaksiyonlar kullanarak DİLERİZ cryosections floresan boyama ile uyumlu değildir. Bir seçenek floresan WİSH tespiti, zebra balığı embriyonik örnekler için optimize edilmiş olan ve yetişkin böbreğinin kullanım için uygun olabilir bir prosedürün kullanımı çağırmak olacaktır. Bu video makalede yöntemlerin açıklaması ayrı ayrı bölümler gibi eGFP veya mCherry gibi bir muhabir ile etiketlenmiş edildiği transgenik zebrafish hatları ile birlikte floresan, WISH gibi teknikler ile daha fazla deneyler için izin vermelidir. Alternatif olarak, yöntemler, burada tarif edilen edebildiğidiğer hayati boyalar, örneğin, diğer lektinlerin ile kombinasyon halinde test edilebilir d. Böylece, daha fazla uyum ve burada açıklanan yöntemlerin genişleme bütün montaj böbrek hazırlıkları ve analiz için araştırmacının ihtiyaçlarına göre çağırılacak. Bu durumda, bu yöntemler, devam eden yenileme çalışmaları için Zebrafish modeli ile birlikte uygulanması için ve genetik hastalığın modelleme geniş bir potansiyele sahiptir. Böbrek hatalarımız için yenilikçi araştırma ve tedaviler için acil bir ihtiyaç vardır. Milyonlarca insan, konjenital akut ve / veya kronik nedenlerden kaynaklanan her yıl böbrek hastalığı çeşit muzdarip. Ayrıca, böbrek hastalığı prevalansı bu hastalıkları küresel bir halk sağlığı sorunu 14,15 yaparak, dünya çapında yükselmeye devam ediyor. Harici bir diyaliz makinesi böbrekler bu rolü gerçekleştirmek mümkün değilse metabolik atıkların bir hastanın kanını kurtulmak için hizmet sayede örneğin hemodiyaliz gibi tedaviler mevcuttur. Ne yazık kiTedavisi devam eden yaşam için gerekli olduğu, bu müdahale, sınırlamaları vardır. Ayrıca, hastalar en sonunda hasta, bekleme üzerine yerleştirildiği zaman almak için yıllar alabilir bir böbrek nakli gerektirecektir. Hatta bir böbrek nakli aldıktan sonra, birçok hasta prosedürü sonucunda olumsuz etkileri acı ve hayatlarının geri kalanı için bu etkileri savaşmak zorundadır. Bu zorluklar, böbrek hastalığı önlemeye ya da belki de, doku rejenerasyonu 8,16,52,53 ek olarak bir yardımcı olmak için ya da yeni tedavilerin geliştirilmesi için ciddi bir ihtiyaç göstermektedir. Biyomedikal laboratuarlarda insan deneğin kullanımının bariz etik kısıtlamaları göz önüne alındığında, hayvan modeller, insan hastalığının patogenezinde çalışma için yeni tedavilerin testleri için gereklidir. Anatomik benzerlik ve evrimsel yakın bir sonucu olarak, fare, insan hastalıklarının 45 en yaygın olarak kullanılan model olmuştur. Ancak, bu hayvanın belirli sınırlamalar dahil olmak üzere, vardıryetersizlik ing in vivo ve büyük ölçekli genetik ekranlar tamamladıktan pratiklik organ gelişimini görselleştirmek için. Zebra balığı insan hastalığı 45,46 organ gelişimi ve modelleme çalışmaları için uygun bir ve faydalı model organizma vardır. Insan hastalığı ile ilgili olarak, zebrabalıkları fonksiyonel homologları ve insan genlerinin tüm 54,55 yaklaşık% 70 mevcuttur. Son çalışmalar böbrek araştırmalar 31,37,56 birçok alanları için zebrafish programını ortaya koymuştur. AKI sonra Zebrafish yenilenme ve onarım çalışmaları tübül epitel rejenerasyon ve neonephrogenesis oluşur ve 30,37 Timecourse rejenerasyon boyunca üst üste iki süreç olduğunu göstermektedir. Bir aminoglikozid antibiyotik olarak adlandırılan gentamisin kullanımı yetişkin zebrabalıkları 29,30,37 ABH sonuçlarını incelemek için aracılığıyla bir yaralanma paradigması olarak kullanılmıştır. Gentamisin bir yaklaşık olarak iki haftalık bir süre boyunca yaralanmayı takip eden, proksimal tubules yeniden, ve bu arada yeni nefron organı 29,30,37 boyunca oluştururlar. Genel olarak, epitel rejenerasyon düzenleyen mekanizmalar son derece tartışmalı kalır. Tamir işleminin bir önerilen mekanizmasında, lümenine ölü hücre dökülmesi ve ardından başlangıç ​​akut yaralanma olay vardır. Sonra, yeni hücreler ayırt sonra de-farklılaşma, çoğalma ve göç olayları bir dizi, yaralı bazal membran repopulating ve yaralı siteye işlevini geri vardır. Alternatif olarak, diğer çalışmalar yedek hücreler nefron tübüller içinde ikamet kök / progenitör hücrelerden kaynaklanan ileri sürmüşlerdir. Zebrabalıkları neonephrogenesis süreci ile ilgili olarak, hücre agregatları gentamisin enjeksiyon 29,30 tarafından aşağıdaki AKI gözlenmiştir. Bu agregalar sonra zaten mevcut olan tübüllerine 29,30 içine indiğimizde yeni nefron içine olgun. Nefron epitel rejenerasyonu ve neonephr birleştiren ortak konuogenesis onların sırf gizem faktörü: Şu anda bu rejeneratif kahramanlık geçerli anlayışlar vardır daha ortaya nasıl hakkında katlanarak daha sorular vardır. Ancak bugüne kadar, kanıt birkaç heyecan verici çizgileri zebrafish kullanarak böbrek yenilenmesi araştırması gerçekten de doğrudan öteleme potansiyel 56-58 olabilir insan AKI içine ilgili karşılaştırmalı bilgiler sağlayabilir olduğu fikrini desteklemektedir. Kimyasal tarama son histon deasetilaz inhibitörü metil-4-(feniltio) -butanoat (m4PTB) 56,57 tanımlanmasına yol açan zebrafish embriyo böbrek projenitör hücrelerin çoğalmasını arttırmak küçük molekülleri tanımlamak için. Gentamisin kaynaklı AKI ile zebra balığı larvalarına karşı Bu bileşimin uygulanmasıyla larva yaşama ve artmış renal tübüler çoğalması 56,58 gelişmiş olduğunu göstermektedir. Orta işemi ile uyarılan AKI ile farenin m4PTB ile muamele edildi, geri kazanımlarının Assoc hızlandırıldırenal tübüler hücrelerin 58 çoğalan hem tübüler atrofi ve hücre döngüsü tutuklama bir azalma ile iation. Bu bulgular, normal zebra balığı böbrek gelişimi ve / veya AKI rejeneratif tepki sorumlu yollar memelilerin 56 ile konserve olacağını göstermektedir. Böylece, ileri çalışmalar söz konusu sinyalizasyon yolları belirlemek ve bunların etkileşimleri-zebrabalıkları nefroloji alanında bu önemli hedef için bir umut cadde sağlar anlamak rejenerasyon-yani mekanizmalarını ayrı kızdırmak için gerekli iken. Bunlar da bu protokolde tarif nefron hücre etiket gibi araçlar, AKI modellerinde böbrek kompozisyon ve özelliğe değerlendirmek için kullanılabilir tahlillerin bir grubunu temsil eder. Dahası, böbrek hastalığı transjenik modelleri karakterize uygulanabilir ve böbrek baraj sonra nefron yapının restorasyon teşvik edebilen kimyasal terapötik durumların belirlenmesinin yol sağlayabiliryaş.

Böbrek vücutta fizyolojik fonksiyonları yerine getiren bir çok kompleks bir organdır. Böbreğin en önemli işlevi, metabolik atık atılımı olduğunu ve bu görevi yakından sıvı dengesinin korunması ile iç içedir. Böbrek eş zamanlı kan basıncı, elektrolit düzeyleri ve asit-baz dengesini düzenleyen ederken, kan filtreleme ve idrar oluşturarak bu işleri gerçekleştirir. Nefron denilen çok özel epitel tübülleri böbrek 1,2 temel fonksiyonel birim olarak hizmet vermektedir. Yetişkin omurgalılarda, nefron genellikle birçok tübülleri oldukça küçük organ haline paketi dolayısıyla izin veren bir merkezi drenaj sistemini çevreleyen sıkıca sarılmış bir düzende organize edilmektedir. Örneğin, her bir insan böbrek üstü 1.000.000 nefron 3 içerebilir. Fare gibi diğer memeliler böbrek başına 4 8-10 bin nefron sırasına sahip. Böbrek karmaşıklık derecesi, bu memeliler ve diğer vert arasındaki farklılıktoplam nefron sayısında varyasyonlar ve böbrek içindeki mimari düzeni nedeniyle ebrates. Pronephros, mezonefrostan ve metanephros: Omurgalı türlerin çok üç ardışık gelişim sırasında böbrek yapıları ve nefron bağış ve düzenleme ile ilgili artan karmaşıklık her bir form görüntüler oluştururlar. Muhafaza edilmesi son böbrek yapısı yetişkin böbreğinin organ tipik olarak bir ya da mesonephros metanephros 2 olarak hizmet vermektedir. Her bir böbrek şekilde, ancak, nefron bazlı kompozisyon 2&#39;ye sahiptir. Nefron böbrek beygir ve metaboliti salgısı ve reabsorption birlikte kan filtrasyon sorumludur. Nefron epitel hücrelerden oluşan basit tübüler yapılardır ve farklılaşmış epitellerinden ayrık, son derece uzmanlaşmış alanları belirli görevleri yerine hangi segmental bir örgüt daha var. Nefron boyunca süzülen madde akış için, tipik haliyle, üç büyük parçaları Compris ki oradaE her birim: (1) renal korpuskül, proksimal, orta ve distal segmentleri ile (2) bir borucuk, ve (3) bir toplama kanalı 1. Proksimal tübül organik çözücüler, özellikle glükoz ve amino asitlerin 1 geri emiliminin sorumludur. Ara tübül (veya Henle loop) tuz ve su Kural 1 önemli bir sitedir. Son olarak, tuz ve diğer iyonlarının ince ayar tübül içinde ve uzak toplama kanalında ortaya çıkar ve son derece endokrin sistemi 1 tarafından düzenlenir. Oradan, süzüntü sonuçta bir atık ürün 1 olarak vücuttan çıkan, üreter ve mesane üzerinden geçecek. Böbrek fonksiyon kaybı, normal nefron etkinliği önlemek nedenleri çok sayıda kaynaklanıyor olabilir. Bu nedenler böbrek gelişimi, örneğin, yaralanma farklı türde nefron 5 veya nedenleri sakat doğumlara yol konjenital defektler (genetik ve environme hem kaynaklanan sırasında oluşabilirntal kökenleri). Edinsel yaralanmalar geniş akut böbrek hasarı (ABH) veya kronik böbrek hasarı (KBH) olarak kategorize edilir. AKI genellikle iskemi veya toksin maruziyeti 6,7 kaynaklanan böbrek fonksiyonlarında ani bir kaybı içermektedir. Memelilerde, nefron epitel onarım tür yaralanmalarda 8 sonra mümkün olduğunu ve birçok kişi AKI sonra böbrek fonksiyonlarında tam restorasyon sergilerler. % 70 insidans aralığında 6,7 - Ancak, AKI geniş bir 30 arasında rapor edilmiştir, yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkilidir. CKD, aksine, tipik olarak 8,9 fibroz ile bağlantılı uzun süreli hasar yıl kaynaklanan böbrek fonksiyon kaybı ile ilişkilidir. Ya bir diğer 10-12 bireyin yatkınlık gibi ayrıca bir etkileşimi, AKI ve KBH arasında var. Örneğin, AKI muzdarip olanlar CKD ve hatta ölüme 13 daha duyarlıdırlar. Böbrek hastalığı görülme sıklığı, ABD&#39;de hem de dünya genelinde, epide ulaşmıştırmikrofon oranlarda ve yaşlı nüfus böbrek 14,15 için rejeneratif tıp müdahaleleri tanımlamak için artan bir ihtiyaç vardır-bu nedenle genişledikçe artacağı tahmin edilmektedir. AKI hasta kurtarabilirsiniz bu bilgiye rağmen, uzun böbrek doğuştan rejeneratif güçlerine olmayan bir organ olduğu düşünülmektedir. Bu geleneksel görünümünü büyük ölçüde son yıllarda 16 olarak revize edilmiştir. AKI sonra farelerde ve sıçanlarda böbrek hasarı araştıran bir çalışma nefron tübül epitel hücrelerinin çoğalmasını ve fonksiyonel nefron 17-20 yeniden göstermiştir. Memeliler nefron yenilemek için bu adaptif bir yeteneğe sahip olmasına rağmen, böbrek fibrozis ve KBH 21 yol tetiklenebilir önemli sınırlamalar ve uyumsuz tepkiler vardır. Örneğin, yeni bir çalışma kemirgen nefron tekrarlanan epitel hücre ablasyon azalmış rejenerasyon ve hav böbrek fibroz-düşündüren nefron ile ilişkili olduğunu göstermiştiradet rejenerasyon eşik 22 sınırlıdır. Yetişkin memeli böbrek, kayıp ya da hasarlı olanları yerine yeni nefron oluşturan dolayısıyla imha kalıcı bir nefron açığı 8,9 yol açtığına dair kanıt yoktur. İlginçtir, bazı omurgalılar nefron epitelyaya yenileyici tarafından ve aynı zamanda yeni nefron üreterek AKI cevap yok, bir süreç neonephrogenesis veya nefron neojenezi 23 olarak anılacaktır. Neonephrogenesis toksin maruziyeti veya kısmi rezeksiyon sonrası balık oluşur ve yaralanma modelleri tarihsel olarak daha yakın akvaryum balığı 24,25, tilapia 26, paten 27, Medaka&#39;nın 28, ve, Zebra balığı 29,30 dahil ettik. Bunlardan, Zebra balığı böbrek rejenerasyon sorumlu hücresel ve moleküler yollar keşfetmek için uygun bir genetik araştırma modeli sağlar. Bu video makalede, biz yetişkin zebrabalıkları nefron segmentleri etiketlemek nasıl gösterilmektedir. Nefron anatomi, moleküler özellikleri Bilgi,ve fonksiyonel özellikleri zebrafish kullanarak başarılı bir gelecek böbrek çalışmalar için gereklidir. Yetişkin zebrabalıkları böbrek mezonefron yapıdır ve yetişkin memelilerin, kuşlar, sürüngenler 31 bulunan metanephros yapıdan daha nefron sayısında ve organizasyon açısından doğası gereği daha az karmaşıktır. Bununla birlikte, zebra balığı nefron kademeli bir kurum memelilere benzerdir ve birinci gen ekspresyon çalışmaları 31-35 göre embriyonik böbrek belgelenmiştir. Zebra balığı embriyo nefron proksimal kıvrık tübül (PCT) dahil lineer borucuk kesimleri, proksimal düz tübül (PST), distal erken (DE), ve distal geç (DL) 31-35 (Şekil 1) içerir. Zebra balığı yetişkin nefron benzer tüp şeklindeki segmentleri 30,31,36,37 (Şekil 1) sahip. PCT ayrıca fonksiyonel bir fenotip ile tanımlanabilir: PCT epitel hücreleri içinde mevcut floresan etiketli dekstran bileşikleri (boyut olarak 10-70 kDa) bir araya getirecekembriyonik böbrek ve yetişkin zebrabalıkları iki kullanılmıştır dolaşımı, bu proksimal tübül hücreleri 38-41 (Şekil 1) endositik alımını değerlendirmek. Zebra balığı ve memeliler arasında nefron segmentlerinden biri fark Zebra balığı bir ara tubule veya Henle 30-37 döngü yoksun olduğunu; Memelilerde bu segment fonksiyonları su tasarrufu için, ve zebra balığı kendi idrarı konsantre bir aciliyet olmadan bir tatlı su türü olduğundan, bu zebra balığı Bu segmenti 32,33 yoksun olması şaşırtıcı değildir. Bu nedenle, genel olarak, büyük ölçüde bileşimin nefron zebrabalıkları ve memeli böbrek 32,33 arasında muhafaza edilir. Bu benzerlikler gelişimsel nefrogenezisi 32-35,42 sırasında renal ifade edilen genlerin fonksiyonlarını incelemek ve bu şekilde olabilir, insan koşullarının önemli listesine ilave sayısız böbrek hastalıkları 43,44 modellemek için kullanılan bir araştırma aracı olarak zebrafish sağlamıştır kullanılarak incelenmiştirZebra balığı 45,46. Bugün, yetişkin zebrabalıkları böbrek nedeniyle genetik tractability ve bu türün gen fonksiyonu ve sinyal yolları sorgulamak için kullanılabilir teknolojik kaynakların genişleyen damak böbrek rejenerasyon karşılaştırmalı çalışmalar için cazip bir modeldir. Çeşitli çalışmalar AKI 29,30,37 sonra rejenerasyon mekanizmalarının araştırılması için Zebrafish mesonephrosun kullandık. Yetişkin zebrabalıkları böbrek kullanmaya devam AKI araştırma için, nefron işlevselliği ankete farklı nefron bölgeleri ve yöntemleri etiketlemek zarif yöntemler olması esastır. Yetişkin böbrek analizi için çeşitli yöntemler embriyonik böbrek protokollerden adapte edilmiştir. Yetişkin Zebrafish floresan işaretli dekstran enjekte edilmesi, zebra balığı embriyolarının 38-41 (Şekil 1) deki gibi, endositoz yoluyla 30 mezonefron nefron olarak PCT epitel etiketler. Bu yöntem, visualiz için kullanılmıştırproksimal tübüller restore fizyolojik fonksiyonu 30 (Şekil 1) bir değerlendirilmesini sağlar AKI, sonrasında kendi reabsorbing mülkünü geri e. Nefron proksimal tübül bir başka özelliği, bu alandaki epitel hücreleri, endojen alkalin fosfataz faaliyetinin yüksek seviyelerini gösteren bir fırça sınır 37 sahip olmasıdır. Bu nedenle, yakın epitel cin çarpmış (Enzimle İşaretlenmiş Floresans) olarak bilinen bir floresan-dayalı bir teknik kullanılarak 47 -97 yetişkin zebrabalıkları böbrekte görsel olarak tespit edilebilir. Burada, biz proksimal tübül fonksiyonel değerlendirmesini almak ve bu tübül segment boyutu ve konturları harita şekilde, yetişkin zebrabalıkları böbrekte floresan dekstran alımı tayinidir 30,48 gerçekleştirmek için nasıl açıklar. Sonra, fluoresan bir etiket alkalin fosfataz ile erişkin nefron proksimal tübül bölgelerini etiketlemek için teknikleri açıklar. Üçüncü olarak, ilk kez rhod gösterecekamin-etiketli lektin Dolichos memeli böbrek 49 toplama kanalları genel bir işaretleyici olarak kullanılmaktadır aglutinini (DBA), biflorus, yetişkin zebrabalıkları böbrek uzak tübül işaretler. DBA alkalin fosfataz boyama dışlayan olduğu gibi, bu etiketler geniş yetişkin zebrabalıkları nefronun pan-uzak menziller karşı pan-proksimal ayırt etmek için bir yol sağlar. Bütün montaj ve Kriyostaz histolojik bölümlerde hem de bu floresan lekeleri uygulanması boyunca, benzersiz her nefron segmenti tespit çözünen taşıyıcı genlerin ekspresyon alanları ile bu etiketleri ilişkilidir. Bu nedenle bu protokol de bizim embriyo DİLERİZ protokol 50 dayanan in situ hibridizasyon (DİLERİZ) analizlerinde yetişkin doku bütün montaj için modifiye doku işleme prosedürleri için bir rehber içerir. Bu prosedürler, O morfolojik ve fonksiyonel özelliklerini belge çeşitli kombinasyonlarda (Şekil 2) kullanılabilirf yetişkin zebrabalıkları böbrek nefron. Böylece, bu protokol yenileme çalışmaları, diğer renal hastalık modelleri içinde fenotipik karakterizasyonu uygulanabilir ve hatta yetişkin böbreğinin oluşumunu çalışmak için kullanılır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

Zebra balığı modeli böbrek geliştirme, yenilenme ve hastalığı incelemek için ilgili sistem olarak ortaya çıkmıştır. Hem embriyonik ve yetişkin zebrabalıkları böbrekler yüksek omurgalıların memeliler dahil olmak üzere diğer ile muhafaza edilmektedir nefron olarak bilinen bir işlevsel birimler oluşmaktadır. Zebra balığı Araştırma zamanlarda yetişkin nefron hasar meydana sonra iki farklı fenomen sızmak olduğunu göstermiştir: Birincisi, tahrip tübül epitel hücreleri yerine mevcut nefron içinde sağlam yenilenmesi vardır; ikinci olarak, tamamen yeni nefron neonephrogenesis olarak bilinen bir süreç böbrek öncü hücrelerden üretilmektedir. Bunun aksine, insan ve diğer memeliler nefron epitelyal rejenerasyon için sadece sınırlı bir yeteneği var gibi görünmektedir. Bugüne kadar, bu böbrek rejenerasyon olayların sorumlu mekanizmalar anladım kötü kalır. Yetişkin zebrabalıkları böbrekler hem nefron epitel rejenerasyonu ve neonephrogenesis uğradığından, onlar olağanüstü bir deneysel bıraktı sağlamakBu olayları incelemek digm. Ayrıca, böbrek rejenerasyon düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmaları tanımlamak için kullanılabilir Zebra balığı modelinde mevcut genetik ve farmakolojik araçlar geniş bir yelpazesi var. Bu tür bir araştırma önemli yönü nefron yapısı ve fonksiyonu değerlendirilmesidir. Bu protokol, yetişkin zebrabalıkları böbrek, böbrek ve test bileşimi nefron özelliğe ölçmek için kullanılabilir etiketleme teknikleri yer verilmiştir. Bu durumda, bu yöntemler arasında, ancak bunlarla kısıtlı değildir yetişkin zebrabalıkları böbrek yetmezliği paradigmaların, nephrotoxicant maruz rejimler veya nitroredüktaz aracılı hücre ablasyon tekniği olarak hedef hücre ölümü genetik yöntemler ileride fenotipik nitelendirilmesi için geniş çapta uygulanabilir. Dahası, bu yöntemler, yetişkin böbrek oluşumunda genetik pertübasyonları incelemek için kullanılabilir ve aynı zamanda kronik hastalık modelleme boyunca renal durumunu değerlendirmek için uygulanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Yetişkin Zebra balığı Böbrek Nefron Kompozisyon ve Fonksiyon Analizi

Zebra balığı yetişkin böbrek böbrek yenilenmesi ve hastalık çalışmalar için mükemmel bir sistemdir. Böyle bir araştırmanın önemli bir yönü nefron yapısı ve fonksiyonu değerlendirmesidir. Bu protokol nefron borucuk kompozisyonunun ve böbrek geri emiliminin değerlendirilmesi için uygulanabilecek çeşitli yöntemler anlatılmaktadır.

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Yetişkin Zebra balığı Tüm Böbrek İliği Nakli

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Yetişkin Zebra balığı Organları diseksiyonu

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Yetişkin Zebra balığı içine intraperitoneal enjeksiyon

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Doğrudan Yetişkin Zebra balığı Böbrek Hücre Nakli

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Yetişkin Zebra balığı Böbrek diseksiyonu

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Yenileyici Yetişkin Zebra balığı Tail Fin içine Morpholinos in vivo olarak Elektroporasyon

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

Yetişkin Zebra balığı Biyokimyasal Analiz için Kan Alma

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

Yetişkin Zebra balığı Gavaging

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Bir Floresan Gümrükleme Testi kullanarak Zebra balığı Böbrek Fonksiyon Değerlendirilmesi

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...