Name: static adhesion assay for the study of integrin activation in t lymphocytes
Uploaded: 2014-06-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes at JoVE.com

Hirschil Trust, Michael Saperstein Medical Scholars forskningsmedel, och NYU Whitehead gemenskap stött detta arbete.

1. Beläggning brunnarna Obs: Målet med detta steg är att belägga polystyrenytor med ICAM-1 för att fungera som ligander för T-cell LFA-1. <ol><li> Bered följande lösningar: <ol><li> Förbered beläggningslösningen genom återsuspendering rekombinant ICAM-1 med fosfatbuffrad salin (PBS)-lösning (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) berikat med kalcium (1 mM CaCl 2) och magnesium (2 nM MgCl2)....

<ol>
	<li>Dustin, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling.">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling.">GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li><li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration.">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li><li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-triggered+leukocyte+arrest:+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts.">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li><li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cells+in+motion:+migrating+toward+improved+therapies.">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+and+actin+cytoskeleton+at+immune+synapses+and+kinapses.">Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).</li><li>Springer, T. A., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inside-out+signaling+and+the+immunological+synapse.">Integrin inside-out signaling and the immunological synapse.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1+regulates+lymphocyte+adhesion+via+upregulation+of+Rap1+at+the+plasma+membrane.">D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane.</a> Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).</li><li>Bivona, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+up-regulation+and+activation+on+plasma+membrane+regulates+T+cell+adhesion.">Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion.</a> J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).</li><li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+of+CD4++T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin.">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li><li>Bhattacharyya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+adhesion+to+immobilized+vitronectin+and+Fc+epsilon+RI+cross-linking+cause+enhanced+focal+adhesion+kinase+phosphorylation+in+murine+mast+cells.">Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells.</a> Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse.">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li></ol>

Det finns flera analyser för att studera signaler till LFA-1-aktivering och T-cell-adhesion 12. Flödescytometri används för att mäta LFA-1-affinitetstillstånd i levande celler med användning av monoklonala antikroppar som binder selektivt till antingen böjda eller förlängas LFA-1. En av begränsningarna med denna metod är att den inte tar hänsyn till grin &quot;aviditet. Migration analyser är användbara verktyg, men de mäter migration, och inte ynka vidhäftning vid en viss tidpunkt. Musmodelle...

T-lymfocyter vidhäftning är en grundläggande process i immunsvaret 1. Det krävs för cellinteraktion T med endotelceller dekorera kapillärväggarna, för skanning antigenpresenterande celler (APC) i lymfkörtlar och för bildandet av immunologiska synapser (IS) med målceller 2. Dessa krav är funktionellt och kinetiskt distinkt. Processen av lymfocyter extravasering består av kemoattraktion, rullande, fast adhesion och transmigration. Övergången från att rulla på fast vidhäftning kräver T-celler att svara på en G-proteinkopplad receptor-signal snabbt. Detta ger en grin ligand växelverkan som bromsar och arresteringar av rullande cellen 3. En omedelbar förändring av grin aviditet förmedlar denna process. Migration kräver dynamiska interaktioner betweenTcells och endotelceller med bildningen av adhesioner vid &quot;frontänden&quot; och sönderbrytning av adhesioner vid &quot;bakre änden&quot;med ett intervall på omkring en minut mellan formning och bryta 4. IS bildar inminutes, men måste förbli intakt i timmar 6. Intressant, en adhesionsmolekyl grinfamiljemedlem lymfocytfunktionen antigen (LFA) - är 1, viktigt för alla dessa processer 5. LFA-1 medierar adhesion genom interaktioner med flera medlemmar av immunoglobulinsuperfamiljen. Den mest omfattande studerat liganden med den högsta affiniteten till LFA-1 är den intercellulära adhesionsmolekylen (ICAM) -1. Icke-aktiverade cirkulerande lymfocyter uttrycker låg affinitet LFA-1 på cellytan, och därför är oförmögna att vidhäfta till ICAM-1-belagda ytor. LFA-1 affinitet varierar och regleras av ett flertal signal evenemang såsom G-proteinkopplade receptoraktivering, cytokinstimulering och signaler som förmedlas av T-cellsreceptorer (TCR). Den resulterande hög affinitet form av LFA-1 förmedlar intracellulär aktivering till det extracellulära rummet through interaktion med ICAM-1. Denna väg kallas ut och in signalering 7. Likaså signalering genom LFA-1 från det extracellulära utrymmet kallas utanför-i signalering. Den intracellulära signaleringskaskader som deltar i inifrån och ut och utifrån och in signalering är ett stort fokus på aktuell forskning. Den lilla GTPase Rap1 har nyligen dykt upp som en viktig del av inifrån-ut signalerar som är gemensam för både TCR ligation och cytokin signalering 8. Den kritiska rollen för Rap1 i grinaktivering markeras genom upptäckten att överuttryck av Rap1 stimulerar grin-beroende adhesion av T-celler, under det att T-cellvidhäftning är blockerad av uttryck av dominant negativ Rap1 9. Dessa framsteg i vår förståelse av grin reglering genom Rap1 har åstadkommits med hjälp av in vitro-verktyg. Bland dem är den statiska vidhäftningen analysen beskriven här. Det övergripande målet med denna metod är att studera Tcell vidhäftning till ICAM-1 belagda ytor. Mer specifikt är det som används för att objektivt mäta och kvantifiera LFA-1 affinitet mot sin disk ligander i levande celler i realtid, under olika förhållanden. Denna teknik använder polystyrenbrunnar belagda med ICAM-1 för att efterlikna de cellulära ytor att de T-celler interagera med. Många tidigare beskrivna statiska T celladhesionsanalyser var experimentellt komplex. Dessa analyser ofta som krävs för T-celler att märkas radioaktivt, utnyttjad odlade bovina korneala celler för att skapa en extracellulär matris som substrat för T-cell-adhesion, eller kallas för icke-fysiologiska T-cellstimulering under en förlängd varaktighet för att främja T-cellvidhäftning 10. Användningen av fluorometrisk mätning för att kvantifiera T-celler efter vidhäftning inkubation är en mer känslig och exakt metod för kvantifiering jämfört med flödescytometri och mikroskopi, som utnyttjas i många andra analyssystem 11. Dessutom enda cell microscopIC-analys av grin lokalisering tillåter inte den breda, befolkningsbaserad analys på samma sätt som den fluorometriska mätningen. Medan aktiveringstillstånd-specifika antikroppar LFA-1 är kommersiellt tillgängliga, är dessa antikroppar har låg känslighet i förhållande till den metod som beskrivs här. Den huvudsakliga fördelen över alternativa tekniker är dess enkelhet och möjlighet att undersöka flera experimentella betingelser samtidigt. När man överväger denna metod för ett visst program, bör man ta hänsyn till att T-celler bör negativt väljs, nyligen isolerade, och märkt med en fluorescerande markör.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="828">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Plate reader</td>
			<td style="width:160px;">BioTek&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Synergy H1 Hybrid</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:160px;">Fisher</td>
			<td style="width:136px;">21-377-829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">96-well microplate with optical bottom</td>
			<td style="width:160px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:136px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Recombinant ICAM-1</td>
			<td style="width:160px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:136px;">ADP4-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Anti-CD3 antibodies</td>
			<td style="width:160px;">Ancell</td>
			<td style="width:136px;">144-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">PMA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">79346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">BSA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">CFSE</td>
			<td style="width:160px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:136px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">RPMI</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">DPBS containing calcium and magnesium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Peripheral lymphocytes</td>
			<td style="width:160px;">e.g. mouse or human</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>499609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Open Gen 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Version 2.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>71-7167-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 and 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>352099, 352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 culture flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-754-1366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RosetteSep T cell enricment kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>15061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

static adhesion assay for the study of integrin activation in t lymphocytes

T-lymfocyt adhesion krävs för flera T-cellfunktioner, inklusive migrering till ställen för inflammation och bildning av immunologiska synapser med antigenpresenterande celler. T-celler åstadkomma reglerad vidhäftning genom att styra de vidhäftande egenskaperna hos integriner, en klass av celladhesionsmolekyler består av heterodimera par av transmembranproteiner som interagerar med målmolekyler på partner celler eller extracellulära matrix. De mest framträdande T-cell grin är lymfocytfunktionen antigen (LFA) -1, som består av subenheter αL och β2, vars mål är den intracellulära adhesionsmolekylen (ICAM) -1. Förmågan hos en T-cell för att styra vidhäftningen härrör från förmågan att reglera affinitetstillstånd enskilda integriner. Inifrån-ut signalering beskriver den process där signaler inuti en cell orsaka yttre domäner integriner att anta ett aktiverat tillstånd. Mycket av vår kunskap om dessa komplexa fenomen bygger på mekanistiskstudier som utförts i förenklad i modell vitro-system. Den lymfocytadhesion analysen T beskrivs här är ett utmärkt verktyg som gör att T-celler att hålla sig till målmolekyler under statiska förhållanden, och sedan använder en fluorescerande plattläsare att kvantifiera vidhäftningsförmågan. Denna analys har varit till nytta i att definiera vidhäftnings-stimulerande eller hämmande substanser som verkar på lymfocyter, samt karakterisera de signaleringshändelser inblandade. Fastän beskriven här för LFA-1 - ICAM-1 förmedlad adhesion; denna analys kan lätt anpassas för att möjliggöra för studier av andra adhesiva interaktioner (t.ex. VLA-4 - fibronektin).

Nedan är ett exempel på vidhäftningsanalys med användning av primära T-celler stimulerade med olika koncentrationer av anti-CD3-antikroppar. Det är bra att känna till fluorescens av otvättade celler (dvs. total belastning). Ostimulerade celler tjänar som en negativ kontroll och PMA-behandlade celler är de positiv kontroll för anti-CD3-antikroppar. Celler pläterade i obelagda brunnar fungera som en kontroll för ICAM-1. Vid ett typiskt försök den procentuella andelen av adherenta PMA-behandlade cel...

Watch this Scientific Journal Video about Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes at JoVE.com

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Statisk vidhäftningsanalys är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att modellera interaktionerna mellan T-lymfocyter och andra celltyper. Interaktioner alstras genom insprutning av märkta T-celler till brunnar belagda med vidhäftningsmolekyler, medan ett plattläsare användes för att kvantifiera antalet vidhäftande celler efter serietvättar.

Statisk vidhäftning analys för studier av Grin Aktivering i T-lymfocyter

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell-Matrix Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Metoder för att bedöma Beta Medierad Celldöd genom Cytotoxiska T-lymfocyter

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In vitro-analys av bakteriell vidhäftning på däggdjur epitelceller

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Riktad Differentiering av inducerade pluripotenta stamceller mot T-lymfocyter

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analys för att mäta neutrofilvidhäftning till Aktiverade primära humana mikrovaskulära endotelceller under statiska förhållanden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

Isolering och Th17 differentiering för naiv CD4 T-lymfocyter

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

En Flow Vidhäftning analys för att studera Leucocyte Rekrytering till Human lever Sinus Endothelium under förhållanden av skjuvspänning

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Humant neutrofilt flöde kammare Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro och in vivo modell för att studera bakteriell vidhäftning till kärlväggen Under Flow Villkor

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Effektiv Isolation Protokoll för B- och T-lymfocyter från Human Palatine tonsiller

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...