Name: using fluorescent proteins to monitor glycosome dynamics in the african trypanosome
Uploaded: 2014-08-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome at JoVE.com

This work was funded by the Creative Inquiry Program for Undergraduate Research and the Calhoun Honors College at Clemson University.

1 Общие трипаносом Husbandry <ol><li> Взвесьте твердые для SDM79 подготовки медиа (Таблица 1). </li><li> Хранить при 4 ° С в 50 мл коническую или Ziploc мешок. ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты стабильны в течение не менее 6 месяцев. </li><li> Оттепели фетальной бычьей сыворотки (FBS), в 37 ° C водяной бане, и перемешивают...

<ol>
	<li>Stuart, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetoplastids:+related+protozoan+pathogens,+different+diseases.">Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases.</a> J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).</li><li>Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+glycosomes+during+life-cycle+differentiation+of+Trypanosoma+brucei.">Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei.</a> Autophagy. 4, 294-308 (2008).</li><li>Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+related+processes+in+trypanosomatids:+insights+from+genomic+and+bioinformatic+analyses.">Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses.</a> Autophagy. 2, 107-118 (2006).</li><li>Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+functions+of+glycosomes+in+trypanosomatids.">Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids.</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).</li><li>Michels, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomes,+glyoxysomes+and+glycosomes+(review).">Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review).</a> Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).</li><li>Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+peroxisomes+and+glycosomes:+trypanosomatid+glycosome+assembly+is+a+promising+new+drug+target.">Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).</li><li>Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+function+of+peroxisomes+and+glycosomes.">Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes.</a> Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).</li><li>Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosomes:+parasites+and+the+divergence+of+peroxisomal+purpose.">Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose.</a> Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).</li><li>Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+aspects+of+glycosomes+in+trypanosomatidae+-+new+data+and+views.">Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views.</a> Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).</li><li>Michels, P. A., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+kinetoplastid+glycosomes.">The evolution of kinetoplastid glycosomes.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).</li><li>Hannaert, V., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+function,+and+biogenesis+of+glycosomes+in+kinetoplastida.">Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).</li><li>Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmentally+regulated+glycosome+protein+composition+in+the+african+trypanosome.">Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome.</a> Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).</li><li>Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomics+of+glycosomes+from+bloodstream+form+and+procyclic+culture+form+Trypanosoma+brucei+brucei.">Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei.</a> Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).</li><li>Opperdoes, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentation+of+carbohydrate+metabolism+in+trypanosomes.">Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).</li><li>Kessler, P. S., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+role+of+compartmentation+of+glycolysis+in+procyclic+form+Trypanosoma+brucei:+RNA+interference+studies+of+PEX14,+hexokinase,+and+phosphofructokinase.">Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).</li><li>Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+trypanosomatids:+adaptation+to+available+carbon+sources.">Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources.</a> Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).</li><li>Coustou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-induced+remodeling+of+intermediary+and+energy+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei.">Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei.</a> The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).</li><li>Lamour, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei+is+down-regulated+in+the+presence+of+glucose.">Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).</li><li>Vertommen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+glycosomal+and+mitochondrial+proteins+in+the+two+major+life-cycle+stages+of+Trypanosoma+brucei.">Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei.</a> Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).</li><li>Vickerman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+cycles+and+biology+of+pathogenic+trypanosomes.">Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes.</a> British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).</li><li>Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongation+and+clustering+of+glycosomes+in+Trypanosoma+brucei+overexpressing+the+glycosomal+Pex11p.">Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p.</a> The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).</li><li>Saveria, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+PEX19-binding+motifs+required+for+protein+targeting+to+mammalian+peroxisomal+and+trypanosome+glycosomal+membranes.">Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes.</a> Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).</li><li>Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+trypanosomatid+PEX19:+functional+characterization+reveals+impact+on+cell+growth+and+glycosome+size+and+number.">Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number.</a> Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).</li><li>Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+Trypanosoma+cruzi's+glycosomal+adenylate+kinase+containing+a+peroxisomal+targeting+signal.">Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal.</a> Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).</li><li>Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+peroxisomal+compartment+in+living+mammalian+cells:+dynamic+behavior+and+association+with+microtubules.">Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules.</a> The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).</li><li>Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER.">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).</li><li>Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+endoplasmic+reticulum+to+peroxisome+formation.">Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation.</a> Cell. 122, 85-95 (2005).</li><li>Furuya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+is+toxic+to+glycosome-deficient+trypanosomes.">Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).</li></ol>

Glycosomes являются важными, динамические, паразит-специфический органеллы. Процессы, которые регулируют биогенеза, техническое обслуживание, пролиферацию и ремоделирование этих органелл, вероятно, включать лекарственных целей, которые могли бы быть использованы в терапевтических целях....

Trypanosoma brucei вызывает африканскую сонную болезнь у человека и изнуряющая болезнь, Нагана, у крупного рогатого скота. Препараты, применяемые при лечении этих заболеваний являются устарелыми и чрезвычайно токсичны, вакцины отсутствуют, и потенциал для развития лекарственной устойчивости к необходимости поиска новых лекарственных препаратов 1. Во время его жизненного цикла, Т. brucei, чередует вектор насекомых и млекопитающему; два компьютера, которые представляют очень разные условия, в которых паразит должен выжить. Ряд метаболических и морфологических изменений произойти паразит подвергается различным условиям окружающей среды. Некоторые из самых драматических изменений наблюдаются в одной мембраной ограничена паразитов конкретных микротел, называется glycosomes 13. Уровни глюкозы являются относительно высокими (~ 5 мм) в крови и кровотока паразиты (BSF) генерации АТФ исключительно через гликолиза WHИль митохондриальная метаболизм репрессированных 14. В отличие от других эукариот, в котором гликолиза происходит в цитоплазме, T. brucei compartmentalizes большинство ферментов гликолиза в glycosomes 14,15. Паразиты будут взяты мухой цеце во время bloodmeal и испытать падение глюкозы, которая падает до неопределяемых уровней в течение 15 мин, чтобы быть заглатывании лету. Метаболизм насекомых, проциклической форма (PCF), паразиты является более гибким и глюкозы, а также аминокислоты, такие как пролин, могут быть использованы в синтезе АТФ 16-18. Сравнительные протеомные исследования показывают жизненного цикла зависимые изменения в glycosomal и митохондриальные белки с гликолиза белков повышенные в кровоток паразитов и митохондриальные белки, участвующие в цикле ТСА и дыхательной цепи 13,19. Хотя многие исследования были сосредоточены на различиях между ЧФ и ФКП glycosomes, мало известно об изменениях в ФКП glycosomes, которые происходят в ответ на окрironmental изменения. В кишке лету, уровень глюкозы низкий с временными увеличивается во время кормления 20. В большинстве в пробирке исследования, ПКФ паразиты выращивают в среде, содержащей глюкозу. Тем не менее, недавние исследования показали, что изменения ФКП метаболизм значительно в ответ на глюкозу доступность 17. В отсутствие глюкозы, поглощение пролина и пролина увеличение активности дегидрогеназы 18. Это изменение метаболизма митохондрий, вероятно, сопровождается изменением состава и морфологии glycosome, однако, это не было непосредственно оценивать. Электрон и флуоресцентной микроскопии являются общие методы используются для изучения динамики glycosome в Т. brucei 2,21-24. Эти протоколы времени и труда, дорого, и трудно адаптироваться в режиме реального времени исследований и протоколов с высокой пропускной. Чтобы преодолеть это ограничение, репортер система люминесцентная-органеллы USED для изучения органелл в млекопитающих и дрожжей систем была изменена для использования в T. brucei 12. Репортер системы Люминесцентная-органелл широко используются в высших эукариот, таких как дрожжи, растений и клеток млекопитающих 25-27. В таких системах, флуоресцентный белок слит с аминокислотной последовательностью, которая направлена ​​белка в определенных органелл. Разложение или синтез целевых белков измеряется с помощью флуоресценции и изменения в составе органелл, отраженных от изменения флуоресценции клеток. Когда открытая рамка считывания повышенной желтого флуоресцентного белка (EYFP) сливают с Тип II пероксисомальной последовательности целевых ориентиров (PtS2) 12, белок PTS2eYFP импортируется в зрелых, импортных-компетентный glycosomes и флуоресценции можно контролировать с помощью проточной цитометрии. Вариации в glycosome композиции, отраженных от изменений в клеточной флуоресценции. Эта система может помочь в резолВинг механизмы, которые регулируют экологически индуцированных изменений в glycosome состава. Эта рукопись описывает генерацию системы glycosome репортера в ФКП паразитов в сочетании с проточной цитометрии для мониторинга динамики glycosome в режиме реального времени в живых паразитов и приводит пример, как он был использован, чтобы следить за изменениями в glycosome состава в ответ на различных средах. Таким образом, glycosome состав зависит от внеклеточных концентраций глюкозы и прохождения лог-фазовых культур в свежую среду вызывает изменения во glycosome состава. Эта система может быть изменен, чтобы изучить динамическое поведение других органеллах в трипаносом и других паразитов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1257">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">Adenosine</td>
			<td style="width:425px;">Avocado Research Chemicals Ltd</td>
			<td style="width:180px;">A10781</td>
			<td style="width:256px;">SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Alanine</td>
			<td>Avocado Research Chemicals Ltd</td>
			<td>A15804</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-arginine</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>1820</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-aminobenzoic acid</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>102569</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6891</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP232-1</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH0224</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Cytomix ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZNA Gel Extraction kit</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>D2500-01</td>
			<td>DNA purifiation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Research grade Serum</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-600-511</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Folic acid</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>101725</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucosamine HCl</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>194671</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15023-021</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>3520</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>Ac15892-0010</td>
			<td>Freezing media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Graces insect cell media powder</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11300-043</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194025</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanosine</td>
			<td>Avocado Research Chemicals Ltd</td>
			<td>A11328</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194025</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td>Cytomix ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-methionine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP388-100</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Amino Acids (50X)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-030-CI</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEAA Mixture (100X)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>13-114E</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimal Essential Medium (1X) with L-glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-010-CM</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOPS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Biocarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-phenylalanine</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>102623</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Cytomix ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisheer</td>
			<td>P290-212</td>
			<td>Cytomix ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-proline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP392-100</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-serine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>56-45-1</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyruvic acid, sodium salt</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>113-24-6</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-taurine</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>A0295</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-threonine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>72-19-5</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-tyrosine</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>103183</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E.Z.N.A.Cycle Pure kit</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>D6492-02</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binding buffer</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>PDR041</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPW wash buffer&#160;</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>PDR045</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gene Pulser Xcell&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2660</td>
			<td>Trypanosome transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 mm electroporation cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Trypanosome transformation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using fluorescent proteins to monitor glycosome dynamics in the african trypanosome

Trypanosoma brucei является kinetoplastid Паразит, вызывающий африканским трипаносомозом человека (HAT), или сонная болезнь, и изнуряющая болезнь, Нагана, у крупного рогатого скота 1. Паразит чередует кровоток хозяина млекопитающих и мухи вектора лету. Состав многих клеточных органелл изменяет в ответ на эти различные внеклеточных условиях 2-5. Glycosomes являются узкоспециализированными пероксисомы, в котором многие из ферментов, участвующих в гликолиза являются разобщенным. Glycosome состав изменяется в развития и экологически регулируемым образом 4-11. В настоящее время наиболее общие методы, используемые для изучения glycosome динамику являются электрон и флуоресцентной микроскопии; методы, которые стоят дорого, времени и труда, а не легко адаптировать к высокой пропускной анализов. Чтобы преодолеть эти ограничения, репортер систему люминесцентная-glycosome вкоторой повышена желтый флуоресцентный белок (EYFP) слита с последовательностью ориентации пероксисом (PTS2), который направляет слитый белок по glycosomes 12, было установлено. При импорте слитого белка PTS2eYFP, glycosomes стать люминесцентные. Деградации органелл и результаты переработки в потере флуоресценции, которые могут быть измерены с помощью проточной цитометрии. Большое количество клеток (5000 клеток / сек) могут быть проанализированы в реальном времени без обширного пробоподготовки, например, фиксации и монтажа. Этот метод предлагает быстрый способ обнаружения изменений в органелл состава в ответ на колебания условий окружающей среды.

В этой системе, наблюдалось изменение уровня глюкозы в зависимости от glycosome в композиции. Когда клетки выращивают в глюкозы, содержащего СМИ, наблюдаются две популяции; одна яркая и одна тусклый (2А). Dim клетки укрывает незрелые glycosomes, которые не импортировали PTS2eYFP а яркие клетки...

Watch this Scientific Journal Video about Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome at JoVE.com

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Использование флуоресцентных белков для мониторинга Glycosome Динамика в африканском трипаносомы

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

Использование карбоксифлуоресцеина диацетат сукцинимидил Эстер (CFSE) для контроля пролиферации лимфоцитов

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Визуальный анализов для мониторинга T6SS-опосредованной Бактериальные конкурса

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Использование<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Изображений для мониторинга прогрессирования Экспериментальная цитомегаловирусной инфекции у новорожденных мыши

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Мониторинг изменения мембранного полярность, мембраны целостности и внутриклеточных концентрации ионов в<em&gt; Пневмококк</em&gt; Использование флуоресцентных красителей

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Использование флуоресцентных белков для визуализации и количественной<em&gt; Хламидиоз</em&gt; Вакуоли Динамика роста в живых клетках

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Mesenteric лимфатический проток канюлированного крысиной модели: Приложение к оценке кишечных лимфатической транспорта лекарства

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Биолюминесценции визуализации для обнаружения поздней стадии инфекции африканского трипаносомоза

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

&quot;Фагосоме Закрытие Анализ&quot; для визуализации фагосоме Формирование в трех измерениях с помощью полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Разработка системы Вирус Reporter гепатита B для мониторинга на ранних стадиях цикла репликации

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Сверхэкспрессия и очищение человека<em&gt; Cis</em&gt; -пренилтрансфераза в<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...