Name: identification of protein interaction partners in mammalian cells using silac-immunoprecipitation quantitative proteomics
Uploaded: 2014-07-06T14:00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics at JoVE.com

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من ويلكوم ترست وBBSRC لIG. IG هو زميل أقدم يلكوم.

<ol>
	<li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions.">Protein-protein interactions.</a> Biochem Soc Trans. 38, 875-878 (2010).</li><li>Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+interacting+partners+using+tandem+affinity+purification.">Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+protein+interactions+and+complexes+by+affinity+purification+followed+by+label-based+quantitative+mass+spectrometry.">Resolving protein interactions and complexes by affinity purification followed by label-based quantitative mass spectrometry.</a> Proteomics. 12, 1623-1638 (2012).</li><li>Emmott, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+interactome+of+the+coronavirus+infectious+bronchitis+virus+nucleocapsid+protein+and+functional+implications+for+virus+biology.">The cellular interactome of the coronavirus infectious bronchitis virus nucleocapsid protein and functional implications for virus biology.</a> J Virol. 87, 9486-9500 (2013).</li><li>Li, W., Belsham, G. J., Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+initiation+factors+4A+(eIF4A)+and+4G+(eIF4G)+mutually+interact+in+a+1:1+ratio+in+vivo.">Eukaryotic initiation factors 4A (eIF4A) and 4G (eIF4G) mutually interact in a 1:1 ratio in vivo.</a> J Biol Chem. 276, 29111-29115 (2001).</li><li>Nielsen, P. J., Trachsel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+protein+synthesis+initiation+factor+4A+gene+family+includes+two+related+functional+genes+which+are+differentially+expressed.">The mouse protein synthesis initiation factor 4A gene family includes two related functional genes which are differentially expressed.</a> EMBO J. 7, 2097-2105 (1988).</li><li>Galicia-Vazquez, G., Cencic, R., Robert, F., Agenor, A. Q., Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+response+linking+eIF4AI+activity+to+eIF4AII+transcription.">A cellular response linking eIF4AI activity to eIF4AII transcription.</a> RNA. 18, 1373-1384 (2012).</li><li>Zakowicz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+the+DEAD-box+RNA+helicase+eIF4AII+characterizes+its+interaction+with+transformation+suppressor+Pdcd4+and+eIF4GI.">Mutational analysis of the DEAD-box RNA helicase eIF4AII characterizes its interaction with transformation suppressor Pdcd4 and eIF4GI.</a> RNA. 11, 261-274 (2005).</li><li>Rothbauer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+nanotrap+for+biochemical+and+functional+studies+with+fluorescent+fusion+proteins.">A versatile nanotrap for biochemical and functional studies with fluorescent fusion proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 282-289 (2008).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes.">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li><li>Dobreva, I., Fielding, A., Foster, L. J., Dedhar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+integrin-linked+kinase+interactome+using+SILAC.">Mapping the integrin-linked kinase interactome using SILAC.</a> J Proteome Res. 7, 1740-1749 (2008).</li><li>Mittler, G., Butter, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SILAC-based+DNA+protein+interaction+screen+that+identifies+candidate+binding+proteins+to+functional+DNA+elements.">A SILAC-based DNA protein interaction screen that identifies candidate binding proteins to functional DNA elements.</a> Genome research. 19, 284-293 (2009).</li><li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+QUICK.">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li><li>Boulon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+protein+frequency+library+and+its+application+in+the+reliable+identification+of+specific+protein+interaction+partners.">Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 861-879 (2010).</li><li>Wang, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+dynamic+interactors+of+protein+complexes+by+quantitative+mass+spectrometry.">Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 46-57 (2008).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+COP9+signalosome+complex+using+affinity+purification+and+mass+spectrometry.">Characterization of the human COP9 signalosome complex using affinity purification and mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 7, 4914-4925 (2008).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

استراتيجية المنسدلة SILAC الموصوفة هنا تمثل وسيلة حساسة للغاية وقوية للكشف عن البروتين الرواية: تفاعلات البروتين، ويسمح علاوة على التمييز السريع والبسيط لأنماط ملزمة تغير بين العينات ترتبط ارتباطا وثيقا من الفائدة. في هذا المثال تم استخدام هذه التقنية لتحقيق البروتين: تفاعلات البروتين من eIF4AI وeIF4AII البروتينات 6. لمعرفة صاحب البلاغ، وهذا هو أول دراسة في الأدب استغلال فائدة البروتينات SILAC للتحقيق في interactome الخلوية من هذه الأشكال الإسوية اثنين من eIF4A. النهج كما هو موضح أعلاه يستخدم GFP علامة ومكافحة GFP الخرز 9، 10، وبالتالي قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات تمكين هذا النهج لاستخدامها لبروتين معين من الفائدة، على سبيل المثال ما إذا كان يتم وضع علامة على N-أو C-محطة من البروتين. حيثما أمكن، البقع الغربية أو المقايسات الفنية ينبغيأن يؤديها للكشف ملزمة للبروتين شريك التفاعل معروفة. يجب بروتين لن تتسامح مع الانصهار مع علامة GFP، علامات أخرى أو استراتيجيات المنسدلة تم تطبيقها على pulldowns SILAC باستخدام كل العلامات الأخرى (FLAG 11، بيوتين 12، بكتيريا (البيانات الخاصة، غير منشورة))، أو باستخدام الأجسام المضادة الأولية ضد بروتين من الفائدة حيث سيرنا ضربة قاضية للبروتين الهدف يوفر العينة الضابطة 13. وقد وصفت هذه التجارب في أماكن أخرى من الأدب، ولكن باختصار، الخطوة 1 والخطوات 5،4-8 ستطبق على النحو الوارد أعلاه، مع الخطوات 2-5،3 تعديل بما يتناسب مع نظام التعبير / المنسدلة من خيار استخدام مدخلات البروتين متساوية كما هو موضح في الخطوات 2.4-2.5. كما تسمح المراحل الكمي البروتينات غير محددة وملزمة لإزالتها على مستوى التحليل، فمن المستحسن لحذف ما قبل الحضانة مع حبات السيطرة، أو يغسل عالية من الملح من أجل الحفاظ على البروتين منخفضة تقارب: تفاعلات البروتين مع بروتين من الفائدة . أماه نوكليازذ إدراجها أو حذفها من هذا البروتوكول وفقا لخصوصيات تجربة معينة. على سبيل المثال: مثل البروتينات المستخدمة في هذه الطريقة هي helicases الحمض النووي الريبي، أدرج ريبونوكلياز كوكتيل في بروتوكول لإزالة التفاعلات غير المباشرة بوساطة عبر الحمض النووي الريبي (الخطوة 3.2). في بعض الحالات ومع ذلك، يمكن أن يكون هناك استفادة من تجارب تشغيل بالتوازي مع وبدون نوكلياز لتحديد الحمض النووي تعتمد التفاعلات. في هذا البروتوكول، وأوصى التحول من &#39;متوسطة&#39; وعينات &#39;الثقيلة&#39; في التجارب تكرار للسيطرة على الاختلاف الذي عرضته الاختلافات في وسائل الإعلام أو SILAC نمو الخلايا. ينطوي على المكافحة البديلة التبديل التتابعي من كل ثلاثة (&#39;ضوء&#39;، &#39;المتوسط&#39;، و &#39;الثقيلة&#39;) وسائل الاعلام في التجارب متماثلة. بينما هذا النهج هو يحتمل أن تكون أكثر صرامة، فإنه يزيد من تعقيد التحليل، كما هو الحال في تكرار واحد على الأقل، وهو بروتين من الفائدة ثسوء يتم إنتاجها في &quot;خفيف&quot; الخلايا المسمى ولذا فمن الضروري التمييز بين البروتينات التي تم تحديدها في عينات باستمرار &quot;خفيف&quot; (الملوثات البيئية مثل keratins)، وتلك التي هي المخصب فقط في عينات &#39;النور&#39; عندما منضما إلى البروتين الفائدة. في حين أن استخدام البيانات الكمي يسمح التمييز محددة من التفاعلات غير محددة من خلال استخدام عتبة، حتما قد يتم تجاهل بعض التفاعلات حقيقية. النهج المذكور أعلاه هو نهج بسيطة وسريعة لتحديد البروتين: البروتين التفاعلات التي يمكن أن تكون محاولة من قبل الباحثين بسهولة مع عدم وجود خبرة سابقة مع مطياف الكتلة، أو تحليل البروتين كبيرة: البروتين مجموعات البيانات التفاعل. بالنسبة لمعظم الاستخدامات وهذا هو أكثر من كافية لتحديد البروتينات الرواية المثيرة للاهتمام. موصوفة تعديلات إضافية على هذا النهج للمساعدة في تقليل هذه الخسارة البيانات في أي مكان آخر في الأدب وتشمل استخدام العلاقات العامةمكتبة تردد otein حيث يعرف البروتينات الملوثة لمجموعة محددة من المعلمات التجريبية (خط الخلية، وحبة مصفوفة، وظروف العازلة) يجوز استبعاد 10، 14. ومع ذلك، اعتمادا على المعلمات التجريبية معينة قد يكون من الضروري لتشغيل عدد من التجارب تحكم لتوليد بروتيوم حبة، وبالتالي يمكن زيادة كل هذا على حساب وتعقيد التجربة. مزيد من المعلومات عن هذه التقنية هو متاح من موقع www.peptracker.co.uk 14. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن البروتوكول هو موضح أعلاه ينطوي خلط العينات وصفت بشكل مختلف في نهاية عملية مناعي (وهو ما يسمى في خلط بعد تنقية - التجربة SILAC MAP). يتم ذلك كما البروتين: تحدث تفاعلات البروتين في توازن معين 15. تجدر الإشارة إلى أن مجموعات أخرى تضافرت هذا النهج MAP SILAC الموصوفة في هذا البروتوكول مع الحضانة من العيناتقبل المنسدلة (تنقية بعد خلط - حزب الأصالة والمعاصرة SILAC) لفترات مختلفة من الزمن (وقد استخدمت 20 دقيقة إلى 2 ساعة في الأدب) 15، 16. على أساس مدى سرعة انخفاض نسبة البروتين نحو 1:1، فمن الممكن للتحقيق نوعيا الانتماءات الملزمة وتحديد البروتينات بأنها مستقرة أو ديناميكية التفاعل البروتينات 15. باختصار، تمثل pulldowns SILAC وسيلة قوية للغاية لتحديد البروتينات التفاعل مع بروتين معين من الفائدة، في جو من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة. تقنية يمكن تكييفها بسهولة للغاية لعدد من الاستراتيجيات تنقية مختلفة، مما يسمح تطبيقه على أي بروتين معين من الفائدة. الكمي لنتائج يبسط إلى حد كبير تحديد التفاعلات حقيقية، ويسمح تخفيف الشروط الصارمة العازلة المستخدمة لإزالة المجلدات غير محددة، وبالتالي يحافظ على انخفاض التفاعلات تقارب. ما يصل الى ثلاث عينات يمكن مقارنة في أعلاهاستراتيجية وتقنية لديه نقاط قوة واضحة في المقارنة بين الاختلافات في بروتين ملزمة بين الأشكال الإسوية مختلفة من البروتين والبروتينات متحولة، أو تأثير مثبطات الدوائية. كما يتم تحليل شرائح هلام كله بدلا من العصابات الفردية التي وصمة عار بواسطة Coomassie، فإن أعداد البروتينات التي تم تحديدها في ثقة عالية وعادة ما تكون أعلى من تلك المحددة في معيار ضريبة المبيعات / TAP-المنسدلة، والمجرب التحيز في اختيار البروتينات ذات الاهتمام تتم إزالة. ولذلك فإن تقنية يقارن ايجابيا جدا مع التقنيات الأخرى المستخدمة استخداما في تحديد رواية البروتين التفاعلات (الخميرة 2 الهجين، ضريبة المبيعات / صاحب أو TAP Pulldowns).

خطوة أساسية في فهم وظيفة البروتين هو تحديد البروتينات المتفاعلة ذات الصلة. حيث مثل البروتينات غير معروفة وهناك عدد من التقنيات المتاحة، ولكل منها مزاياها وسلبياتها. وتشمل هذه الخميرة نظام هجين اثنين، المقايسات المنسدلة باستخدام البروتين المؤتلف، وكذلك تنقية تقارب جنبا إلى جنب أو TAP الجغرافية 1، 2. وبالإضافة إلى ذلك أكثر حداثة لهذه التقنيات هو مزيج من تنقية تقارب من البروتين من الفائدة من خط خلايا الثدييات ذات الصلة، تليها الكمي باستخدام مطياف الكتلة وضع العلامات النظائر مستقرة من الأحماض الأمينية في الثقافة الخلية (SILAC) 3. هذا لم يتم مضطرب المزايا على نهج الخميرة اثنين الهجين في ذلك توطين الخلية والتعديلات بعد متعدية، فضلا عن المزايا أكثر من التقليدية في أنه هو النهج الكمي النوعي بدلا من السماح للمستخدم الجرمية الجغرافية TAP<html> تميز dily غير وجه التحديد التفاعل البروتينات والملوثات، من العوامل المضيفة التي تربط على وجه التحديد. كذلك، عادة ما يتم تحليل عينة ككل، بدلا من العصابات البروتين الفردية، لا يتم ملثمين البروتينات من الفائدة عن طريق ترحيل بالمثل البروتينات على هلام، كما أنها لا تحتاج عادة ليكون حاضرا في مستويات كافية لتكون واضحة بعد تلطيخ، مما يؤدي إلى الأعداد المتزايدة من البروتينات التي تم تحديدها بثقة 4. لإثبات هذه التقنية، اندماج GFP من حقيقية النواة عامل بدء ترجمة وثيقة الصلة وتم التحقيق eIF4AI وeIF4AII أن حصة أكثر من 90٪ من الأحماض الأمينية التي كتبها الهوية SILAC مناعي البروتينات الكمي. تم استنساخ eIF4AI الإنسان والثاني في pEGFP-C1 لتشكيل البروتين الانصهار حيث تنصهر GFP إلى N-محطة من eIF4A. لتجنب الحاجة لتوليد خطوط الخلايا مستقرة استخدمت ترنسفكأيشن عابرة لتقديم هذه التركيبات إلى النظائر الخلايا 293T المسمى مستقرة. &quot;jove_content&quot;&gt; وصفت الخلايا الأولى لمدة أسبوعين في SILAC سائل الإعلام والثقافة الخلية، تليها ترنسفكأيشن من الحمض النووي البلازميد ترميز البروتين من الفائدة. وبعد ذلك هي lysed الخلايا، وتركيز البروتين تطبيع، وكميات متساوية من المحللة تقارب تنقيته على الاغاروز مكافحة GFP. كميات متساوية من شطافة ثم تم الجمع بين وقدم لتحليل LC-MS/MS. ثم تتم معالجة نتائج هذا التحليل إلى تحديد البروتين ثقة عالية: تفاعلات البروتين (الشكل 1). SILAC مناعي يمكن تحديد ليس فقط التفاعلات المباشرة ولكن أيضا منخفضة تقارب أو التفاعلات غير المباشرة مع المجمعات البروتين 4. باستخدام هذا النظام، والثاني eIF4AI immunoprecipitations يسمح تحديد استنساخه واثقة من الشريك الأساسي ملزمة eIF4G (الأشكال الإسوية I / II و III) 5، وكذلك التفاعلات غير المباشرة مع eIF4E، ومكونات عديدة من مجمع eIF3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium &#160;(DMEM)</td>
			<td style="width:87px;">Dundee Cell Products</td>
			<td style="width:88px;">LM010</td>
			<td style="width:745px;">DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:271px;">Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml</td>
			<td rowspan="2" style="width:87px;">Dundee Cell Products</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">DS1003</td>
			<td rowspan="2" style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Arginine (R0) 25g</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">A8094</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Arginine (R6) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CLM-2265</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Arginine (R10) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CNLM-539</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Lysine (K0) 25g</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">L8662</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Lysine (K4) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">DLM-2640</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Lysine (K8) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CNLM-291</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml</td>
			<td style="width:87px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">15140-122</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:88px;">11668-027</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">GFP-trap Agarose (500&#956;l resin)</td>
			<td style="width:87px;">Chromotek</td>
			<td style="width:88px;">gta-20</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">5x SDS Sample loading buffer</td>
			<td style="width:87px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">PN39000</td>
			<td style="width:745px;">The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td style="width:87px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:88px;">539134</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">1.7ml&#160; prelubricated tubes</td>
			<td style="width:87px;">Costar</td>
			<td style="width:88px;">3207</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">BCA protein assay kit (1L)</td>
			<td style="width:87px;">Pierce</td>
			<td style="width:88px;">23225</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Tris (Trizma)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Rnase cocktail</td>
			<td style="width:87px;">Ambion</td>
			<td>AM2286&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">NP-40 alternative</td>
			<td style="width:87px;">Millipore</td>
			<td align="right">492016</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of protein interaction partners in mammalian cells using silac-immunoprecipitation quantitative proteomics

البروتيوميات الكمية جنبا إلى جنب مع تنقية المناعية تقارب، SILAC مناعي، تمثل وسيلة قوية لاكتشاف البروتين الرواية: تفاعلات البروتين. من خلال السماح للالكمي النسبي دقيقة من وفرة البروتين في كل من السيطرة واختبار العينات، والتفاعلات الحقيقية يمكن تمييزها بسهولة من الملوثات التجريبية. يمكن الحفاظ على التفاعلات تقارب منخفضة من خلال استخدام الظروف العازلة أقل صرامة ويبقى التعرف عليه بسهولة. يناقش هذا البروتوكول بوضع العلامات على الخلايا زراعة الأنسجة مع النظائر مستقرة الأحماض الأمينية المسمى، وترنسفكأيشن مناعي لتقارب الموسومة البروتين من الفائدة، تليها تمهيدا لرفعها إلى مرفق مطياف الكتلة. ثم يناقش هذا البروتوكول كيفية تحليل وتفسير البيانات التي تم إرجاعها من مطياف الكتلة من أجل تحديد الشركاء الخلوية التفاعل مع بروتين من الفائدة. كمثال يتم تطبيق هذه التقنية لالاتساعtify البروتينات ملزمة للعوامل ترجمة حقيقية النواة بدء: eIF4AI وeIF4AII.

في تجربة نموذجية SILAC المنسدلة، فإن الغالبية العظمى من البروتينات المحددة (&gt; 90٪) وتمثل الملوثات فضلا عن البروتينات غير الملزم خصيصا لمصفوفة تقارب وهذا موضح في الشكل 2B، حتى عندما إزالة البروتوكولات الغسيل غالبية الملوثات حشوية مثل GAPDH (الشكل 2A). ومع ذلك، فإن تجميع غير الملزمة تحديدا البروتينات في التوزيع الطبيعي يسمح البروتينات التي تربط خصيصا لبروتين من الفائدة لتمييزها حيث أن هذه العينة لديهم أعلى / نسب وهمية من الخلفية. في حين أن الكتلة الملوثات نظريا حول نسبة SILAC سجل 2 0، وهذا ليس بالضرورة، وتعطى مثالا على هذا في الشكل 3. الأسباب المحتملة لهذا تشمل وضع العلامات SILAC الكمال من الخلايا، وتحميل كميات غير متكافئة أو تركيزات المحللة على حبات مكافحة GFP، فقدانها من خلال تنقية الخرز أو مزيج غير متكافئة<html> جي العينات في نهاية الإجراء تنقية 3. ومع ذلك، يتم تحليل البيانات على أساس افتراض انحراف عتبة قياسية من المتوسط ​​من الملوثات توزع عادة، يجب أن التحولات الطفيفة في توسيط البيانات لن يؤثر على نوعية النتائج. عند مقارنة الاختلافات في تفاعلات البروتين بين اثنين من البروتينات ذات الصلة، قد تحدث حالة مماثلة حيث يتم إنتاج بروتين واحد من الفائدة إلى مستويات أعلى داخل الخلايا من ثانية (إما بسبب الاختلاف في كفاءة ترنسفكأيشن، أو خاصية جوهرية من البروتين أو مرنا) . بعض الاختلاف في التعبير (على سبيل المثال، الشكل 2A) يمكن تصحيحها عن طريق تحليل نسبة SILAC لهذه العينتين. في هذا المثال ستكون هذه العينات GFP-eIF4AI وGFP-eIF4AII. من خلال تحليل نسبة 4AI/4AII SILAC كما نوقش في الباب 7، فمن الممكن لتحديد البروتينات التي يختلف اختلافا كبيرا بين الأشكال الإسوية ملزمة. <html> الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; في الشكل 4، يظهر تمثيل البروتينات ملزمة eIF4A المحددة في واحدة من التجارب التي أجريت طبق الاصل يدل على تغطية عامل معقدة بدء هذا البروتوكول تحقيقها. وقد لوحظت أعلى النسب عادة مع eIF4G، الذي يربط مباشرة إلى eIF4A، مع نسب أقل للeIF4E، الذي يربط eIF4G في موقع بعيدا عن موقع ملزم eIF4A. وقد لوحظت نسب أقل لأعضاء المجمع eIF3. ومع ذلك، وهذا يوضح بجلاء أن التجربة التي تم تحديدها بصورة مرضية الشركاء ملزمة المباشرة وغير المباشرة من eIF4AI والثاني. كما يمكن أن يتوقع من الهوية تسلسل العالية 6، بروتين: ظهرت تفاعلات البروتين الحفظ إلى حد كبير بين الأشكال الإسوية اثنين في هذا النظام التجريبي 7، 8. يتم إعطاء مجموعة مختارة من بعض البروتينات المتفاعلة في الجدول 2، مما يدل على تنسيق البيانات. <table border="0" cellpadding="0" cellsp</html style=";text-align:right;direction:rtl">التفوق = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> عنوان العمود </td><td> وصف </td></tr><tr><td> الانضمام </td><td> يعرض عدد الانضمام لتسلسل </td></tr><tr><td> تغطية </td><td> نسبة تسلسل البروتين من الببتيدات التي تم تحديدها غطت </td></tr><tr><td> ♯ PSM </td><td> الببتيد مباراة الطيفية </td></tr><tr><td> ♯ الببتيدات </td><td> إجمالي عدد الببتيدات فريدة من نوعها التي تم تحديدها لبروتين </td></tr><tr><td> ♯ العاص </td><td> طول البروتين في الأحماض الأمينية </td></tr><tr><td> MW (دا) </td><td> الوزن الجزيئي للبروتين في دالتون. يستبعد التعديلات </td></tr><tr><td> أحسب. PI </td><td> نقطة تساوي الكهربية النظرية من البروتين </td></tr><tr><td> نتيجة </td><td> الدرجة الكلية من البروتين (والذي يمثل مجموع فرديعشرات الببتيد idual). والنتيجة الدقيقة اللازمة لأهمية تختلف بين التجارب. وهناك منشأة MS عادة تطبيق 5٪ معدل اكتشاف كاذبة قطع. </td></tr><tr><td> تسلسل </td><td> تسلسل الأحماض الأمينية المكونة للبروتين </td></tr><tr><td> نسبة </td><td> كثافة نسبية من الببتيدات في عينة المسمى اسمه، مقارنة على عينة المسمى الثاني </td></tr><tr><td> نسبة عدد </td><td> عدد نسب الببتيد التي كانت تستخدم لحساب نسبة بروتين معين </td></tr><tr><td> تقلب نسبة (٪) </td><td> تباين نسب الببتيد الفردية المستخدمة لحساب نسبة بروتين معين </td></tr><tr><td> وصف </td><td> اسم البروتين </td></tr></tbody></table> الجدول 1. عناوين الأعمدة قياسي من تقرير بروتيوم مكتشف.في حين يمكن الحصول على معلومات مفيدة من جميع هذه الأعمدة، وأولئك الذين ينتقدون لهذا التحليل تظهر في جريئة. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1057" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الانضمام </td><td> الببتيدات </td><td> 4AI/Mock </td><td> 4AII/Mock </td><td> اسم </td><td> تحليل SILAC </td></tr><tr><td> A8K7F6 </td><td> 21 </td><td> 100 </td><td> 1 </td><td> eIF4AI </td><td rowspan="2"> البروتين &#39;بيت&#39; </td></tr><tr><td> Q14240 </td><td> 22 </td><td> 0.01 </td><td> 90.855 </td><td> eIF4AII </td></tr><tr><td> G5E9S1 </td><td> 25 </td><td> 47.575 </td><td> 30.53 </td><td> eIF4GI </td><td rowspan="3"> التفاعل البروتينات </td></tr><tr><td> Q59GJ0 </td><td> 5 </td><td> 11.778 </td><td> 10.619 </td><td> eIF4GII60؛ </td></tr><tr><td> P06730 </td><td> 3 </td><td> 7.22 </td><td> 7.57 </td><td> eIF4E </td></tr><tr><td> Q5T6W5 </td><td> 4 </td><td> 0.685 </td><td> 0.646 </td><td> hnRNPK </td><td rowspan="2"> الملوثات غير الملزم على وجه التحديد </td></tr><tr><td> P62805 </td><td> 1 </td><td> 0.531 </td><td> 0.498 </td><td> هيستون H4 </td></tr><tr><td> H6VRG2 </td><td> 18 </td><td> - </td><td> - </td><td> الكيراتين-1 </td><td rowspan="2"> الملوثات البيئية </td></tr><tr><td> P35527 </td><td> 11 </td><td> 0.01 </td><td> 0.01 </td><td> الكيراتين-1 هيكل الخلية 9 </td></tr></tbody></table> الجدول 2. بيانات نموذجية من تجربة SILAC مناعي. إعطاء بيانات المثال لبروتين من الفائدة / الطعم (الببتيدات عالية، ونسبة عالية)، والبروتينات التي تتفاعل مع بروتين من الفائدة (عالية / منخفضة الببتيدات، ونسبة عالية)، غير ملزمة على وجه التحديد البروتينات (عالية / منخفضة peptايديس، تقع نسبة أدناه قطع - في هذه التجربة 0.96)، والملوثات البيئية (غالبا ما الببتيدات عالية، نسبة سلبية / تحت عتبة). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig1.jpg" /> الشكل 1. خطة التجريبية. أولا وتزرع الخلايا في وسائل الإعلام التي تفتقر إلى أرجينين ويسين واستبداله مع النظائر مستقرة المسمى أرجينين ويسين لمدة 2 أسابيع (1). (2) وخلايا المصنف إلى 10 سم 2 أطباق وعابر مع البلازميدات ترميز GFP (وهمية) أو البروتينات الانصهار GFP (عينات). (3) والخلايا هي lysed وimmunoprecipitated GFP أو GFP الانصهار البروتينات من الخلية لست]. (4) يتم الجمع بين عينات في نسبة 1:1، وقدم للتحليل LC-MS/MS. ثم يتم تحليل البيانات لإزالة منخفض البروتين الثقة الايدنتifications وتحديد مستوى تخصيب البروتين الموافق البروتينات التفاعل حقيقية. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig2.jpg" /> الشكل 2. تأكيد الشروط مناعي مناسب. أ) تحليل لطخة غربية من الخلية لست]، وكذلك الكسور غير منضم والمنضم من مناعي يؤكد التعبير ومناعي للبروتين من الفائدة. لطخة غربية ضد GAPDH يؤكد استنزاف غير التفاعل البروتينات وزيادة وصمة عار الغربية شريكا التفاعل المعروفة من eIF4A يؤكد مناعي ناجح من البروتينات ملزمة للبروتين من الفائدة. ب) أين ليست معروفة شركاء التفاعل من البروتين من الفائدة، هلام الملطخة الفضة قد يؤكد مناعي للبروتينات التفاعل. على هذا الفضة وصمة عار<html> العصابات هلام إد لGFP وGFP-eIF4AI/II واضحة، وفرقة المهاجرة في الحجم الصحيح لeIF4G موجود فقط في الممرات GFP-4AI/II-bound وليس في حارة السيطرة GFP. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig3.jpg" /> الرقم 3. ممثل النتائج. الرسم البياني تبين توزيع نسب البروتين من تكرار واحد من (A) GFP-eIF4AI أو (B) GFP eIF4AII المنسدلة. تم وضع علامة على 1.96 الانحراف المعياري قطع مع خط متقطع. البروتينات المتفاعلة التي تقع خارج الملوثات توزع عادة هي واضح من ~ 0.25 و 1 في (أ)، و~ 0،3-1،5 في (B). les/ftp_upload/51656/51656fig4.jpg &quot;/&gt; الشكل 4. تحديد أعضاء اتحاد الصناعات المعقدة من نسخة متماثلة واحدة على التجربة SILAC IP. باللون الأخضر والبروتينات البروتين من الفائدة المستخدم لالمنسدلة التفاعل البروتينات مظللة من الأحمر بإعطاء الأبيض لتسجيل نسبة 2 SILAC في SILAC IP مع الأحمر كونها البروتين الأكثر وفرة في التحليل، والأبيض كونه قطع 1.96 SD. لم يتم تحديد البروتينات المظللة باللون الرمادي في هذا التحليل.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics at JoVE.com

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

تمثل التجارب SILAC مناعي وسيلة قوية لاكتشاف البروتين الرواية: تفاعلات البروتين. من خلال السماح للالكمي النسبي دقيقة من وفرة البروتين في كل من السيطرة واختبار العينات، والتفاعلات الحقيقية يمكن تمييزها بسهولة من الملوثات التجريبية، وانخفاض التفاعلات تقارب الحفاظ من خلال استخدام الظروف العازلة أقل صرامة.

تحديد الشركاء التفاعل البروتين في خلايا الثدييات عن طريق SILAC مناعي الكمي البروتيوميات

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

تحديد بروتين المجمعات مع كمية البروتينات في البيرة س.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

تحديد الشركاء البروتين عن طريق التفاعل جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

تدفق تحليل Cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء: عالية الإنتاجية الأسلوب الكمي لدراسة التفاعل البروتين البروتين

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

تحديد مواقع التفاعل البروتين البروتين عن طريق الببتيد صفائف

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

البروتين التسليم المباشر للخلايا الثدييات عن طريق خلية قابلة للاختراق السيستئين<sub&gt; 2</sub&gt; العاهل<sub&gt; 2</sub&gt; مجالات الزنك الاصبع

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

تحديد بين الخلايا اشارة الأحداث المستحثة في خلايا قابلة للحياة من خلال التفاعل مع المجاورة الخلايا التي تمر أفكارك موت الخلية

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...