Name: identification of protein interaction partners in mammalian cells using silac-immunoprecipitation quantitative proteomics
Uploaded: 2014-07-06T14:00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן Wellcome וBBSRC לIG. IG הוא Wellcome עמית בכיר.

<ol>
	<li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions.">Protein-protein interactions.</a> Biochem Soc Trans. 38, 875-878 (2010).</li><li>Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+interacting+partners+using+tandem+affinity+purification.">Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+protein+interactions+and+complexes+by+affinity+purification+followed+by+label-based+quantitative+mass+spectrometry.">Resolving protein interactions and complexes by affinity purification followed by label-based quantitative mass spectrometry.</a> Proteomics. 12, 1623-1638 (2012).</li><li>Emmott, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+interactome+of+the+coronavirus+infectious+bronchitis+virus+nucleocapsid+protein+and+functional+implications+for+virus+biology.">The cellular interactome of the coronavirus infectious bronchitis virus nucleocapsid protein and functional implications for virus biology.</a> J Virol. 87, 9486-9500 (2013).</li><li>Li, W., Belsham, G. J., Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+initiation+factors+4A+(eIF4A)+and+4G+(eIF4G)+mutually+interact+in+a+1:1+ratio+in+vivo.">Eukaryotic initiation factors 4A (eIF4A) and 4G (eIF4G) mutually interact in a 1:1 ratio in vivo.</a> J Biol Chem. 276, 29111-29115 (2001).</li><li>Nielsen, P. J., Trachsel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+protein+synthesis+initiation+factor+4A+gene+family+includes+two+related+functional+genes+which+are+differentially+expressed.">The mouse protein synthesis initiation factor 4A gene family includes two related functional genes which are differentially expressed.</a> EMBO J. 7, 2097-2105 (1988).</li><li>Galicia-Vazquez, G., Cencic, R., Robert, F., Agenor, A. Q., Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+response+linking+eIF4AI+activity+to+eIF4AII+transcription.">A cellular response linking eIF4AI activity to eIF4AII transcription.</a> RNA. 18, 1373-1384 (2012).</li><li>Zakowicz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+the+DEAD-box+RNA+helicase+eIF4AII+characterizes+its+interaction+with+transformation+suppressor+Pdcd4+and+eIF4GI.">Mutational analysis of the DEAD-box RNA helicase eIF4AII characterizes its interaction with transformation suppressor Pdcd4 and eIF4GI.</a> RNA. 11, 261-274 (2005).</li><li>Rothbauer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+nanotrap+for+biochemical+and+functional+studies+with+fluorescent+fusion+proteins.">A versatile nanotrap for biochemical and functional studies with fluorescent fusion proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 282-289 (2008).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes.">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li><li>Dobreva, I., Fielding, A., Foster, L. J., Dedhar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+integrin-linked+kinase+interactome+using+SILAC.">Mapping the integrin-linked kinase interactome using SILAC.</a> J Proteome Res. 7, 1740-1749 (2008).</li><li>Mittler, G., Butter, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SILAC-based+DNA+protein+interaction+screen+that+identifies+candidate+binding+proteins+to+functional+DNA+elements.">A SILAC-based DNA protein interaction screen that identifies candidate binding proteins to functional DNA elements.</a> Genome research. 19, 284-293 (2009).</li><li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+QUICK.">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li><li>Boulon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+protein+frequency+library+and+its+application+in+the+reliable+identification+of+specific+protein+interaction+partners.">Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 861-879 (2010).</li><li>Wang, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+dynamic+interactors+of+protein+complexes+by+quantitative+mass+spectrometry.">Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 46-57 (2008).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+COP9+signalosome+complex+using+affinity+purification+and+mass+spectrometry.">Characterization of the human COP9 signalosome complex using affinity purification and mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 7, 4914-4925 (2008).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אסטרטגית הנפתח SILAC המתוארת כאן מהווה אמצעי רגיש מאוד ורב עוצמה של גילוי חלבון חדש: אינטראקציות חלבון, ויתר על כן מאפשרת האפליה המהירה ופשוטה של ​​דפוסים המחייבים שינו בין דגימות קשורות קשר הדוק של עניין. בדוגמא זו טכניקה זו הייתה בשימוש כדי לחקור את החלבון: אינטראקציות חלבון של חלבוני eIF4AI וeIF4AII 6. לידיעתו של המחבר, זהו המחקר הראשון בספרות מנצלת את השירות של פרוטאומיקה SILAC לחקור interactome הסלולרי של שני isoforms של eIF4A אלה. הגישה כפי שתואר לעיל משתמשת GFP-תג ואנטי-GFP חרוזים 9, 10 ולכן שינויים עשויים להידרש כדי לאפשר גישה זו כדי לשמש לחלבון ספציפי של עניין, לדוגמא אם התג ממוקם בN-או C-סופית של חלבון. איפה, כתמים מערביים אפשריים או מבחני פונקציונליים צריכיםיש לבצע כדי לזהות מחייב של שותף אינטראקציה חלבון ידוע. צריך חלבון לא יסבול היתוך עם תג ה-GFP, תיוג אחר או אסטרטגיות הנפתח הוחלו pulldowns SILAC באמצעות שני תגים אחרים (FLAG 11, 12 ביוטין, סטרפטוקוקוס (הנתונים שלו,) לא פורסם), או על ידי שימוש בנוגדנים ראשוניים נגד חלבון עניין שבו מציאה siRNA של חלבון המטרה מספקת מדגם שליטה 13. ניסויים כאלה כבר מתוארים במקומות אחרים בספרות, אבל בקצרה, שלב 1 ושלבים 5.4-8 היינו להיות מיושמים כאמור לעיל, בצעדים 2-5.3 שונה בהתאם למערכת ביטוי / הנפתח של בחירה באמצעות תשומות חלבון שווים כפי שמתואר ב צעדים 2.4-2.5. כשלבי הכימות לאפשר חלבונים המחייבים שאינם ספציפיים שיש להסיר ברמת הניתוח, מומלץ להשמיט מראש דגירה עם חרוזים שליטה, או שטיפות מלח גבוהות על מנת לשמר חלבון דל זיקה: אינטראקציות חלבון עם חלבון של עניין . Ma nucleasey להיכלל או הושמט מפרוטוקול זה על פי הפרטים של ניסוי מסוים. לדוגמא: כמו החלבונים המשמשים בשיטה זו הם helicases RNA, קוקטייל RNase נכלל בפרוטוקול כדי להסיר אינטראקציות עקיפות בתיווך באמצעות RNA (שלב 3.2). במקרים מסוימים עם זאת, יכול להיות שיש להפיק תועלת מביצוע ניסויים במקביל עם ובלי nuclease לזהות אינטראקציות תלויות חומצות גרעין. בתוך פרוטוקול זה, המיתוג של &quot;בינוני&quot; ודגימות &#39;כבדות&#39; בניסויים לשכפל מומלץ לשלוט וריאציה הוצגה על ידי הבדלים בתקשורת SILAC או צמיחת תאים. שליטה חלופית כרוכה במעבר הרציף של כל שלושה (, &#39;הבינוני&#39;, &#39;אור&#39; ו &#39;הכבדות&#39;) כלי התקשורת בניסויי העתק. בעוד גישה זו היא שעלולה להיות מחמירה יותר, זה להגדיל את המורכבות של הניתוח, כמו בלשכפל אחד לפחות, חלבון של עניין wחולה להיות מיוצר בתאים &#39;אור&#39; שכותרתו ולכן יש צורך להבחין בין החלבונים שזוהו באופן עקבי בדגימות &#39;אור&#39; (מזהמים סביבתיים כגון keratins), ואלה שמועשרים רק בדגימות &#39;אור&#39; כאשר חייב חלבון של ריבית. תוך השימוש בנתוני כימות מאפשר אפליה של ספציפיות מאינטראקציות לא ספציפיות באמצעות שימוש בסף, באופן בלתי נמנע כמה אינטראקציות אמיתיות עשויות להיות מושלכת. הגישה הנ&quot;ל היא גישה פשוטה ומהירה לזיהוי חלבון: אינטראקציות חלבון זה יכול להיות ניסיון בקלות על ידי חוקרים ללא ניסיון קודם עם ספקטרומטריית מסה, או ניתוח של חלבון גדול: מערכי נתונים אינטראקציה חלבון. עבור רוב השימושים זה יותר ממספיק לזיהוי חלבונים חדשים של עניין. שינויים בהמשך לגישה זו כדי לעזור להפחית אובדן נתונים זה מתוארים במקומות אחרים בספרות, וכוללים שימוש ביחסי ציבורספרייה בתדירות otein בי ידועות חלבונים מזהמים לקבוצה מסוימת של פרמטרים ניסיוניים (קו תא, מטריצת חרוז, תנאי חיץ) עשויה להיות שלילית 10, 14. עם זאת, בהתאם לפרמטרים של ניסוי מסוימים זה עשוי להיות נחוץ כדי להפעיל מספר ניסויי שליטה לייצר proteome חרוז וזה ולכן יכול להגביר הן את חשבון והמורכבות של הניסוי. מידע נוסף על טכניקה זו הוא זמין מאתר האינטרנט www.peptracker.co.uk 14. צריך גם לציין, כי הפרוטוקול שתואר לעיל כרוך בערבוב דגימות שכותרתו שונה בסופו של תהליך immunoprecipitation (שמכונה ערבוב לאחר טיהור - ניסוי SILAC MAP). הדבר נעשה כחלבון: אינטראקציות חלבון להתרחש בשיווי משקל נתון 15. יש לציין שקבוצות אחרות יש בשילוב גישת SILAC מפה זו מתוארת בפרוטוקול זה עם דגירה של הדגימותלפני הנפתח (טיהור לאחר ערבוב - PAM SILAC) עבור אורכים שונים של זמן (20 דקות לשעה 2 היו בשימוש בספרות) 15, 16. בהתבסס על כמה מהר יחס חלבון יורד לכיוון 1:1, ניתן לחקור באופן איכותי זיקות מחייבות ולהגדיר חלבונים כמו חלבוני אינטראקציה יציבים או דינמיים 15. לסיכום, pulldowns SILAC מייצג אמצעי רב עוצמה לזיהוי חלבונים באינטראקציה עם חלבון נתונה של ריבית, בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. הטכניקה יכולה להיות מותאמת בקלות למספר אסטרטגיות טיהור שונות, המאפשרת יישום שלה לכל חלבון נתונה של ריבית. כימות של תוצאות בהרבה מפשטת זיהוי של אינטראקציות אמיתיות, ומאפשרת הרפיה של תנאי חיץ מחמירים המשמשים להסרת קלסרים שאינם ספציפיים, ובכך שומרת על אינטראקציות זיקה נמוכות. כפי שניתן לעומת עד שלוש דגימות באמור לעילאסטרטגיה, יש לו את הטכניקה עוצמות ברורות בהשוואת הבדלים בחלבון קושר בין isoforms שונה חלבון, חלבוני מוטציה, או את ההשפעה של מעכבים תרופתיים. כפרוסות ג&#39;ל כל מנותחות ולא להקות בודדות שכתם על ידי Coomassie, המספרים של חלבונים שזוהו בוודאות גבוהה הם בדרך כלל גבוהים יותר מאלה שזוהו בGST / TAP-הנפתח סטנדרטיים, והנסיין הטיה בבחירת חלבונים של עניין מוסר. הטכניקה ולכן משווה מאוד לטובה עם טכניקות נפוצות אחרות המשמשות בזיהוי של חלבונים אינטראקציות רומן (שמרים 2 היברידי, GST / או pulldowns TAP).

צעד חיוני בהבנת תפקוד חלבון הוא זיהוי של חלבוני אינטראקציה רלוונטיים. איפה חלבונים כאלה אינם ידועים יש מספר טכניקות זמינות, כל אחד עם יתרונות משלהם וחסרונות. אלה כוללים את מערכת השמרים שני ההיברידית, מבחני הנפתח באמצעות חלבון רקומביננטי, כמו גם טיהור זיקת טנדם או TAP תיוג 1, 2. בנוסף אחרונים יותר לטכניקות אלה הוא שילוב של טיהור זיקה של חלבון של עניין משורת תאים של יונקים רלוונטיים, ואחריו על ידי ספקטרומטריית מסה כמותית באמצעות תיוג איזוטופ יציב של חומצות אמינו בתרבית תאים 3 (SILAC). זו יש יתרונות על פני הגישה של שני ההיברידית שמרים שבלוקליזציה התא ולאחר translational שינויים אינם מוטרדים, כמו גם יתרונות על פני מסורתי בכך שהיא היא גישת כמותית ולא איכותית המאפשרת למשתמש ריאה תיוג TAP<html> dily להבחין שאינו במיוחד באינטראקציה חלבונים וחומרים מזהמים, מגורמי מארח שלהיקשר באופן ספציפי. יתר על כן, כמדגם מנותח בדרך כלל כולו, ולא להקות חלבון בודדות, כמו, חלבונים של עניין אינם רעול פנים על ידי דומה נודדים חלבונים על ג&#39;ל, ואין הם בדרך כלל צריכים להיות נוכחים ברמות מספיקות כדי להיות גלוי לאחר צביעה, מה שמוביל ל מספרים מוגברים של חלבונים שזוהו בביטחון 4. כדי להדגים את הטכניקה הזו, התכה GFP של גורם החניכה תרגום אוקריוטים הקשור קשר הדוק eIF4AI וeIF4AII מניה שעל זהות חומצת אמין 90% נחקרו על ידי פרוטאומיקה כמותיים SILAC-immunoprecipitation. eIF4AI האדם והשני היו משובטים לתוך pEGFP-C1 ליצירת חלבון היתוך שבו GFP הוא קבע את N-הסופית של eIF4A. כדי למנוע את הצורך ביצירת שורות תאי יציבות transfection חולף שימש כדי לספק המבנים הללו לתאי איזוטופ יציבים שכותרת 293T. &quot;Jove_content&quot;&gt; תאים תויגו ראשון במשך שבועיים בתקשורת תרבות תא SILAC, ואחרי transfection של DNA פלסמיד קידוד חלבון של עניין. תאים אז היו lysed, ריכוז החלבון מנורמל, וכמויות שווים של זיקת lysate מטוהרים על agarose אנטי-GFP. כמויות שווה של eluate אוחדו לאחר מכן והגישו לניתוח LC-MS/MS. התוצאות של ניתוח זה מעובד מכן לזהות חלבון אמון גבוה: אינטראקציות חלבון (איור 1). immunoprecipitation SILAC מאפשרת זיהוי לא רק אינטראקציות ישירות אלא גם זיקה נמוכה או אינטראקציות עקיפות עם קומפלקסי חלבונים 4. באמצעות מערכת זו, immunoprecipitations eIF4AI והשני אפשר זיהוי לשעתק ובטוח בעצמו של השותף העיקרי מחייב eIF4G (isoforms I / II ו-III) 5, כמו גם יחסי גומלין עקיפים עם eIF4E, ומספר רבים של רכיבים המורכבים eIF3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium &#160;(DMEM)</td>
			<td style="width:87px;">Dundee Cell Products</td>
			<td style="width:88px;">LM010</td>
			<td style="width:745px;">DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:271px;">Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml</td>
			<td rowspan="2" style="width:87px;">Dundee Cell Products</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">DS1003</td>
			<td rowspan="2" style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Arginine (R0) 25g</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">A8094</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Arginine (R6) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CLM-2265</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Arginine (R10) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CNLM-539</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Lysine (K0) 25g</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">L8662</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Lysine (K4) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">DLM-2640</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Lysine (K8) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CNLM-291</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml</td>
			<td style="width:87px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">15140-122</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:88px;">11668-027</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">GFP-trap Agarose (500&#956;l resin)</td>
			<td style="width:87px;">Chromotek</td>
			<td style="width:88px;">gta-20</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">5x SDS Sample loading buffer</td>
			<td style="width:87px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">PN39000</td>
			<td style="width:745px;">The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td style="width:87px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:88px;">539134</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">1.7ml&#160; prelubricated tubes</td>
			<td style="width:87px;">Costar</td>
			<td style="width:88px;">3207</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">BCA protein assay kit (1L)</td>
			<td style="width:87px;">Pierce</td>
			<td style="width:88px;">23225</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Tris (Trizma)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Rnase cocktail</td>
			<td style="width:87px;">Ambion</td>
			<td>AM2286&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">NP-40 alternative</td>
			<td style="width:87px;">Millipore</td>
			<td align="right">492016</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of protein interaction partners in mammalian cells using silac-immunoprecipitation quantitative proteomics

פרוטאומיקה כמותית בשילוב עם טיהור חיסונית זיקה, immunoprecipitation SILAC, מייצגת אמצעי רב עוצמה לגילוי חלבון חדש: אינטראקציות חלבון. על ידי המאפשר כימות היחסית מדויקת של שפע חלבון בשליטה והן דגימות בדיקה, אינטראקציות אמיתי ניתן להבחין בקלות ממזהמים ניסיוניים. ניתן לשמר אינטראקציות זיקה נמוכה באמצעות השימוש בתנאי חיץ פחות מחמירים ויישארו לזיהוי בקלות. פרוטוקול זה דן בתיוג של תאים בתרבית רקמה עם חומצות אמינו שכותרתו איזוטופ היציב, transfection וimmunoprecipitation של זיקה מתויג חלבון של עניין, ואחריה ההכנה להגשה למתקן ספקטרומטריית מסה. פרוטוקול זה אז מסביר כיצד לנתח ולפרש את הנתונים שהוחזרו מספקטרומטר המסה על מנת לזהות שותפים סלולריים אינטראקציה עם חלבון של עניין. כדוגמא טכניקה זו תחול על iDENתצדיק את החלבונים מחייבים את גורמי חניכה תרגום אוקריוטים: eIF4AI וeIF4AII.

בניסוי הנפתח SILAC טיפוסי, הרוב המכריע של חלבונים שזוהו (&gt; 90%) מייצג מזהמים כמו גם חלבונים מחייבים שאינם ספציפי למטריצת זיקה וזה מודגם באיור 2 ב &#39;, גם כאשר פרוטוקולי כביסה להסיר רוב המזהמים cytoplasmic כגון (איור 2 א) GAPDH. עם זאת, באשכולות של הלא ספציפי מחייבים חלבונים בהתפלגות נורמלית מאפשר לי חלבונים באופן ספציפי להיקשר לחלבון של עניין יש להבחין כמו אלה מדגם / יחסים מדומים גבוהים יותר מהרקע. בעוד מזהמים אמורים באופן תיאורטי אשכול סביב יחס יומן 2 SILAC של 0, זה לא בהכרח המקרה, דוגמא לכך היא נתון באיור 3. סיבות אפשריות לכך כולל תיוג SILAC מושלם של תאים, טעינת כרכים או ריכוזים של lysate שוויוניים על חרוזים אנטי-GFP, אובדן מקרי של חרוזים במהלך טיהור או שילוב שוויוני<html> ing של דגימות בסוף הליך הטיהור 3. עם זאת, הנתונים בהנחה שהם נותחו על בסיס סטיית תקן סף מהממוצע של המזהמים מתפלגים נורמלי, משמרות קטין במרכוז של נתונים לא אמורה להשפיע על איכות התוצאות. כאשר משווים את ההבדלים באינטראקציות חלבון בין שני חלבונים קשורים, מצב דומה עלול להתרחש בו חלבון אחד של העניין מופק לרמות גבוהות יותר בתוך תאים משנייה (או בשל הבדלים ביעילות transfection, או נכס מהותי של החלבון או mRNA) . וריאציה מסוימת בביטוי (לדוגמא, איור 2 א) ניתן לתיקון על ידי ניתוח ליחס SILAC לשתי דגימות אלה. בדוגמא זו אלה יהיו דגימות ה-GFP-eIF4AI וה-GFP-eIF4AII. על ידי ניתוח יחס 4AI/4AII SILAC כאמור בסעיף 7, ניתן לזהות חלבונים שמחייבים משתנה באופן משמעותי בין isoforms. <html> class = &quot;jove_content&quot;&gt; באיור 4, ייצוג מחייב חלבוני eIF4A זיהו באחד הניסויים שנערכו ההעתק מוצג הממחיש את הכיסוי של מתחם גורם ייזום פרוטוקול זה הושג. היחס הגבוה ביותר נצפה בדרך כלל עם eIF4G, אשר נקשר ישירות לeIF4A, עם יחס נמוך יותר עבור eIF4E, אשר נקשר לeIF4G באתר מהאתר מחייב eIF4A. יחס נמוך יותר נצפה עבור חברים של מתחם eIF3. עם זאת, זה ממחיש באופן ברור כי הניסוי באופן משביע רצון זיהה שותפים המחייבים הן ישירים ועקיפים של eIF4AI ושני. כפי שניתן לצפות מהזהות גבוהה רצף 6, חלבון: אינטראקציות חלבון הופיעו נשמרים במידה רבה בין שני isoforms במערכת זו ניסיונית 7, 8. בחירה של חלק מחלבוני האינטראקציה מוצגת בטבלה 2, הממחישה את פורמט הנתונים. <table border="0" cellpadding="0" cellsp</html style=";text-align:right;direction:rtl">Acing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> כותרת עמודה </td><td> תיאור </td></tr><tr><td> הצטרפות </td><td> מציג את מספר ההצטרפות לרצף </td></tr><tr><td> כיסוי </td><td> חלקם של רצף החלבון מכוסה על ידי פפטידים זוהו </td></tr><tr><td> ♯ PSM </td><td> התאמה רפאים פפטיד </td></tr><tr><td> ♯ פפטידים </td><td> מספר כולל של פפטידים ייחודיים שזוהו לחלבון </td></tr><tr><td> ♯ AAS </td><td> אורכו של חלבון בחומצות אמינו </td></tr><tr><td> MW (דה) </td><td> המשקל המולקולרי של חלבון בDaltons. לא כולל שינויים </td></tr><tr><td> calc. PI </td><td> הנקודה איזואלקטרית התיאורטית של חלבון </td></tr><tr><td> ציון </td><td> הציון הכולל של חלבון (המייצג את הסכום של indivעשרות פפטיד idual). הציון המדויק הנדרש למשמעות ינוע בין ניסויים. מתקן MS בדרך כלל יחול 5% הפסקת שיעור גילוי שווא. </td></tr><tr><td> רצף </td><td> רצף חומצות האמינו המרכיבות את החלבון </td></tr><tr><td> יחס </td><td> העצמה היחסית של פפטידים בשם מדגם שכותרתו, בהשוואה למדגם שכותרת שנייה </td></tr><tr><td> רוזן יחס </td><td> מספר יחסי פפטיד ששמשו לחישוב יחס חלבון נתון </td></tr><tr><td> השתנות יחס (%) </td><td> ההשתנות של יחסי פפטיד הבודדים המשמשים לחישוב יחס חלבון נתון </td></tr><tr><td> תיאור </td><td> שמו של החלבון </td></tr></tbody></table> טבלת 1. כותרות עמודות רגילה מדו&quot;ח Proteome Discoverer.בעוד מידע שימושי ניתן להשיג מכל אחת מהעמודות אלה, אלה קריטיים לניתוח זה מוצגים באותיות מודגשות. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1057" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> הצטרפות </td><td> פפטידים </td><td> 4AI/Mock </td><td> 4AII/Mock </td><td> שם </td><td> ניתוח SILAC </td></tr><tr><td> A8K7F6 </td><td> 21 </td><td> 100 </td><td> 1 </td><td> eIF4AI </td><td rowspan="2"> חלבון &#39;פיתיון&#39; </td></tr><tr><td> Q14240 </td><td> 22 </td><td> 0.01 </td><td> 90.855 </td><td> eIF4AII </td></tr><tr><td> G5E9S1 </td><td> 25 </td><td> 47.575 </td><td> 30.53 </td><td> eIF4GI </td><td rowspan="3"> אינטראקציה חלבונים </td></tr><tr><td> Q59GJ0 </td><td> 5 </td><td> 11.778 </td><td> 10.619 </td><td> eIF4GII60; </td></tr><tr><td> P06730 </td><td> 3 </td><td> 7.22 </td><td> 7.57 </td><td> eIF4E </td></tr><tr><td> Q5T6W5 </td><td> 4 </td><td> 0.685 </td><td> 0.646 </td><td> hnRNPK </td><td rowspan="2"> מזהמים-במיוחד שאינו מחייבים </td></tr><tr><td> P62805 </td><td> 1 </td><td> 0.531 </td><td> 0.498 </td><td> H4 היסטון </td></tr><tr><td> H6VRG2 </td><td> 18 </td><td> - </td><td> - </td><td> קראטין-1 </td><td rowspan="2"> מזהמים סביבתיים </td></tr><tr><td> P35527 </td><td> 11 </td><td> 0.01 </td><td> 0.01 </td><td> cytoskeletal קרטין-1 9 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. נתונים אופייניים מניסוי immunoprecipitation SILAC. מתן נתונים דוגמא לחלבון של עניין / פיתיון (פפטידים גבוהים, יחס גבוה), חלבוני אינטראקציה עם חלבון של עניין (פפטידים גבוהים / נמוכים, יחס גבוה), שאינו מחייבים באופן ספציפי חלבונים (pept גבוה / נמוךאידו, יחס יורד מתחת לסף - בניסוי זה 0.96), ומזהמים סביבתיים (לעתים קרובות פפטידים גבוהים, יחס שלילי / מתחת לסף). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig1.jpg" /> איור 1. ניסויי תכנית. ראשית תאים גדלים בתקשורת חסרת ארגינין וליזין ולהחליף עם ארגינין איזוטופ היציב שכותרתו ויזין 2 שבועות (1). (2) תאים הם זורעים לתוך 10 סנטימטר 2 מנות וtransiently transfected עם פלסמידים קידוד ה-GFP (מוק) או חלבוני GFP היתוך (דוגמאות). (3) תאים lysed והחלבונים GFP או GFP היתוך הם immunoprecipitated מlysates התא. (4) דוגמאות משולבות בביחס של 1:1 והגישו לניתוח LC-MS/MS. הנתונים נותחו לאחר מכן להסיר את זיהוי חלבון אמון נמוךכישורים, וכדי לבחור ברמה של העשרת החלבון המתאימה לחלבוני אינטראקציה אמיתיים. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig2.jpg" /> איור 2. אישור תנאי immunoprecipitation מתאימים. א) ניתוח מערבי כתם של lysates תא, כמו גם שברים מאוגדים וכרוך מimmunoprecipitation מאשר ביטוי וimmunoprecipitation של החלבון של עניין. כתם מערבי נגד GAPDH מאשר דלדול של חלבונים שאינן אינטראקציה וכתם מערבי עוד שותפת אינטראקציה ידועה של eIF4A מאשרת immunoprecipitation המוצלחת של חלבוני קשירה לחלבון של עניין. ב) שותפים באינטראקציה של חלבון של עניין אינם ידועים, ג&#39;ל מוכתם כסף רשאי לאשר immunoprecipitation של חלבוני אינטראקציה. על כסף הכתם הזה<html> להקות ג&#39;ל ed עבור ה-GFP וGFP-eIF4AI/II ברורות, ולהקה הנודדת בגודל הנכון עבור eIF4G קיים רק בנתיבי GFP-4AI/II-bound ולא בנתיב שליטת ה-GFP. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig3.jpg" /> איור 3. נציג תוצאות. היסטוגרמה המציגה את ההתפלגות של יחסי חלבון מן חוזר אחד () הנפתח ה-GFP-eIF4AII ה-GFP-eIF4AI או (ב). הפסקת סטיית תקן 1.96 מסומנת בקו מקווקו. חלבוני אינטראקציה נופלים מחוץ למזהמים בדרך כלל המופצים ניכרים מ~ 0.25 ו1 ב (א), ו ~ .3-1.5 ב( ב &#39;). les/ftp_upload/51656/51656fig4.jpg &quot;/&gt; איור 4. זיהוי של חברים מורכבים eIF מהעתק אחד של ניסוי SILAC IP. חלבונים בירוק היו החלבון של עניין משמש לנפתח אינטראקציה חלבונים מוצלים מאדום לדברים לבנים להיכנס 2 יחס SILAC בIP SILAC עם אדום להיות החלבון הנפוץ ביותר בניתוח, ולבן להיות הפסקת 1.96 SD. חלבונים המוצלים באפור לא זוהו בניתוח זה.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics at JoVE.com

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

ניסויי immunoprecipitation SILAC מייצגים אמצעי רב עוצמה לגילוי חלבון חדש: אינטראקציות חלבון. על ידי המאפשר כימות היחסית מדויקת של שפע חלבון בשליטה והן דגימות בדיקה, אינטראקציות אמיתי ניתן להבחין בקלות ממזהמים ניסיוניים, ואינטראקציות זיקה נמוכות נשמרו באמצעות שימוש בתנאי חיץ פחות מחמירים.

זיהוי של שותפי אינטראקציה חלבון בתאי יונקים באמצעות SILAC-immunoprecipitation פרוטאומיקה כמותי

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר<sub&gt; 2</sub&gt; כלי-<sub&gt; 2</sub&gt; Domains אבץ האצבע

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

זיהוי של איתות תאיים אירועים מושרה תאים קיימא על ידי אינטראקציה עם תאים שכנים מוות של תאים אפופטוטיים שעברו

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...