Name: identification of protein interaction partners in mammalian cells using silac-immunoprecipitation quantitative proteomics
Uploaded: 2014-07-06T14:00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами от Wellcome Trust и BBSRC в ИГ. И.Г. является Wellcome старший научный сотрудник.

<ol>
	<li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions.">Protein-protein interactions.</a> Biochem Soc Trans. 38, 875-878 (2010).</li><li>Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+interacting+partners+using+tandem+affinity+purification.">Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+protein+interactions+and+complexes+by+affinity+purification+followed+by+label-based+quantitative+mass+spectrometry.">Resolving protein interactions and complexes by affinity purification followed by label-based quantitative mass spectrometry.</a> Proteomics. 12, 1623-1638 (2012).</li><li>Emmott, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+interactome+of+the+coronavirus+infectious+bronchitis+virus+nucleocapsid+protein+and+functional+implications+for+virus+biology.">The cellular interactome of the coronavirus infectious bronchitis virus nucleocapsid protein and functional implications for virus biology.</a> J Virol. 87, 9486-9500 (2013).</li><li>Li, W., Belsham, G. J., Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+initiation+factors+4A+(eIF4A)+and+4G+(eIF4G)+mutually+interact+in+a+1:1+ratio+in+vivo.">Eukaryotic initiation factors 4A (eIF4A) and 4G (eIF4G) mutually interact in a 1:1 ratio in vivo.</a> J Biol Chem. 276, 29111-29115 (2001).</li><li>Nielsen, P. J., Trachsel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+protein+synthesis+initiation+factor+4A+gene+family+includes+two+related+functional+genes+which+are+differentially+expressed.">The mouse protein synthesis initiation factor 4A gene family includes two related functional genes which are differentially expressed.</a> EMBO J. 7, 2097-2105 (1988).</li><li>Galicia-Vazquez, G., Cencic, R., Robert, F., Agenor, A. Q., Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+response+linking+eIF4AI+activity+to+eIF4AII+transcription.">A cellular response linking eIF4AI activity to eIF4AII transcription.</a> RNA. 18, 1373-1384 (2012).</li><li>Zakowicz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+the+DEAD-box+RNA+helicase+eIF4AII+characterizes+its+interaction+with+transformation+suppressor+Pdcd4+and+eIF4GI.">Mutational analysis of the DEAD-box RNA helicase eIF4AII characterizes its interaction with transformation suppressor Pdcd4 and eIF4GI.</a> RNA. 11, 261-274 (2005).</li><li>Rothbauer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+nanotrap+for+biochemical+and+functional+studies+with+fluorescent+fusion+proteins.">A versatile nanotrap for biochemical and functional studies with fluorescent fusion proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 282-289 (2008).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes.">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li><li>Dobreva, I., Fielding, A., Foster, L. J., Dedhar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+integrin-linked+kinase+interactome+using+SILAC.">Mapping the integrin-linked kinase interactome using SILAC.</a> J Proteome Res. 7, 1740-1749 (2008).</li><li>Mittler, G., Butter, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SILAC-based+DNA+protein+interaction+screen+that+identifies+candidate+binding+proteins+to+functional+DNA+elements.">A SILAC-based DNA protein interaction screen that identifies candidate binding proteins to functional DNA elements.</a> Genome research. 19, 284-293 (2009).</li><li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+QUICK.">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li><li>Boulon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+protein+frequency+library+and+its+application+in+the+reliable+identification+of+specific+protein+interaction+partners.">Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 861-879 (2010).</li><li>Wang, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+dynamic+interactors+of+protein+complexes+by+quantitative+mass+spectrometry.">Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 46-57 (2008).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+COP9+signalosome+complex+using+affinity+purification+and+mass+spectrometry.">Characterization of the human COP9 signalosome complex using affinity purification and mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 7, 4914-4925 (2008).</li></ol>

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Стратегия пулдаун SILAC описано здесь представляет собой очень чувствительные и мощные средства обнаружения новый белок: белковых взаимодействий, и, кроме того позволяет быстро и просто дискриминация измененных обязательных моделей между тесно связанных образцов, представляющих интерес. В этом примере этот метод был использован для исследования белок: белок взаимодействий eIF4AI и eIF4AII белков 6. Насколько известно автору, это первое исследование, в литературе эксплуататорского полезность SILAC протеомики исследовать клеточный интерактома этих двух изоформ eIF4A. Подход, как описано выше использует GFP-тегов и анти-GFP бусы 9, 10 и, следовательно, изменения могут потребоваться, с тем чтобы этот подход, который будет использоваться для конкретного интересующего белка, например, является ли тег помещается в N-или С-конец белка. Где это возможно, западные пятна или функциональные тесты должныбыть выполнены, чтобы обнаружить связывание известного партнера белка взаимодействия. Если белок не переносят слияние с GFP тега, другой маркировкой или выпадающих стратегий были применены к SILAC Pulldowns использованием как другие метки (FLAG 11, биотин 12, STREP (собственные данные, не опубликовано)), или с помощью первичных антител против белка интереса, где миРНК нокдаун белка-мишени обеспечивает контрольный образец 13. Такие эксперименты были описаны в другом месте в литературе, но вкратце, шаг 1 и шаги 5.4-8 будет применяться, как указано выше, с шагами 2-5.3 модифицированных в случае необходимости для экспрессии / выпадающего системы выбора с использованием равных входных белка, как описано в шаги 2.4-2.5. Как этапы количественного позволяют неспецифического связывания белков должны быть удалены на уровне анализа, рекомендуется опустить преинкубации с контрольными бисером, или высоких моет соли для того, чтобы сохранить низким сродством белок: белковые взаимодействия с интересующего белка . Нуклеазы мау быть включены или исключены из этого протокола в соответствии со спецификой конкретного эксперимента. Например: как белки, используемые в этом методе являются РНК геликазы, РНКазы коктейль был включен в протокол, чтобы удалить косвенного взаимодействия, опосредованные через РНК (шаг 3.2). Однако в некоторых случаях, не может быть выгоду от запуска параллельных экспериментов с и без нуклеазы определить нуклеиновых кислот зависимые взаимодействия. В рамках этого протокола, переключение &quot;среды&quot; и &quot;тяжелых&quot; образцов в повторных экспериментах рекомендуется контролировать для изменения введенной различий в SILAC СМИ или рост клеток. Альтернативный контроль включает в себя последовательное переключение всех трех («легкие», «среднего» и «тяжелый») СМИ в реплик экспериментов. В то время как этот подход является потенциально более строгими, это увеличить сложность анализа, как минимум в одной репликации, представляющего интерес белка шплохо быть произведены в «свет» меченых клеток и поэтому необходимо различать белков последовательно, определенных в «свет» образцов (загрязнители окружающей среды, такие как кератинами), и те, которые обогащены только в «свет» образцов при связывании с белком интерес. В то время как использование количественного данных позволяет различение конкретных-от неспецифических взаимодействий за счет использования порогового значения, неизбежно некоторые подлинные взаимодействия могут быть отброшены. Подход выше простой и быстрый подход к идентификации белков: белковых взаимодействий, которые могут быть легко попытки исследователей без предыдущего опыта с масс-спектрометрии, или анализа большого белка: наборы данных белковых взаимодействий. Для большинства применений этого более чем достаточно для идентификации новых белков, представляющих интерес. Дальнейшие модификации данного подхода, чтобы помочь уменьшить эту потерю данных описаны в другом месте в литературе и включают использование пр.otein библиотека частота где известно примесей белков для конкретного набора параметров эксперимента (клеточной линии борта матрицы, условий буфер) могут быть исключены 10, 14. Тем не менее, в зависимости от конкретных экспериментальных параметров может быть необходимо, чтобы запустить ряд контрольных экспериментов, чтобы генерировать шарик протеом и, следовательно, это может увеличить как расходы и сложность эксперимента. Дополнительная информация об этой технике можно получить в www.peptracker.co.uk сайте 14. Следует также отметить, что протокол, описанный выше включает смешивание по-разному меченых проб в конце процесса иммунопреципитации (называется смесительной после очистки - MAP SILAC эксперимента). Это делается белка: белковые взаимодействия происходить при заданной равновесия 15. Следует отметить, что другие группы объединили Эта карта SILAC подход, описанный в данном протоколе с инкубации образцовдо пулдауна (очистка после смешивания - PAM SILAC) для различных отрезков времени (20 мин до 2 ч, были использованы в литературе) 15, 16. На основе того, насколько быстро падает соотношение белок к 1:1, то можно качественно исследовать аффинности связывания и для определения белков в качестве стабильных или динамических взаимодействующих белков 15. Таким образом, SILAC Pulldowns представляют собой очень мощные средства идентификации белков, взаимодействующих с данной интерес белка, в физиологически соответствующего обстановке. Этот метод может быть очень легко адаптировать к ряду различных стратегий очистки, что позволяет его применение к той или иной интерес белка. Количественное определение результатов значительно упрощает идентификацию подлинных взаимодействий и позволяет релаксацию жестких условиях буфер, используемый для удаления неспецифических связующих и, следовательно, сохраняет низкие взаимодействия сродством. Как до трех образцов можно сравнить в приведенном вышеСтратегия, техника имеет четкие преимущества в сравнении различия в Связывание белков между различными белковых изоформ, мутантных белков, или эффекта фармакологических ингибиторов. Как целые кусочки геля анализируются, а не отдельных групп, которые пятно Кумасси, количество белков, выявленных на высокое доверие, как правило, выше, чем те, которые определены в стандартном GST / TAP-пулдауна, и экспериментатор предвзятость в выборе белки интересов удаляется. Техника поэтому сравнивает очень выгодно отличается от других широко используемых методов, используемых в идентификации новых белков-взаимодействий (дрожжи 2-гибридных, GST / Его или TAP Pulldowns).

Существенным шагом в понимании функции белка является выявление соответствующих взаимодействующих белков. Где такие белки неизвестны есть ряд методов доступны, каждый со своими достоинствами и недостатками. К ним относятся дрожжи двух гибридную систему, раскрывающиеся анализов с использованием рекомбинантного белка, а также очистку тандем сродства или TAP-тегов 1, 2. Более недавнее дополнение к этих методов является сочетание аффинной очистки интересующего белка от соответствующей линии клеток млекопитающих, а затем количественного масс-спектрометрии с использованием изотопа стабильного маркировки аминокислот в клеточной культуре (SILAC) 3. Это имеет преимущества по сравнению с дрожжевой двухгибридной подхода в этой локализации клеток и пост-трансляционных модификаций не возмущается, а также преимуществ по сравнению с традиционным TAP-тегов в том, что это количественное, а не качественное подход, позволяющий пользователю РиDíly отличить неспецифически взаимодействующих белков и загрязнителей, от хозяина факторов, которые специфически связываются. Кроме того, как образец анализировали обычно целом, а не в виде отдельных белковых полос, белки, представляющие интерес, не маскируется аналогично миграции белки в геле, и они, как правило, должны присутствовать в достаточном уровне, чтобы быть видимыми после окрашивания, что приводит к увеличение числа уверенно идентифицированных белков 4. Чтобы продемонстрировать эту технику, GFP слитые тесно связанной с эукариотической фактор инициации трансляции eIF4AI и eIF4AII, что доля более 90% идентичности аминокислотной были исследованы SILAC-иммунопреципитации количественных протеомики. Человека eIF4AI и II, были клонированы в pEGFP-C1 сформировать гибридный белок, где GFP закрепляется на N-конце eIF4A. Чтобы избежать необходимости создания стабильных клеточных линий временная трансфекция был использован для доставки этих конструкций в стабильный изотоп меченых клеток 293Т. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Клетки сначала помечены течение двух недель в SILAC клеточной культуральной среде, а затем трансфекции плазмидной ДНК, кодирующей интересующий белок. Клетки затем лизируют, концентрация белка нормализованы, и равное количество лизата сродством очищают на анти-GFP агарозы. Равные количества элюата, затем были объединены и представлены для анализа LC-MS/MS. Результаты этого анализа затем обрабатываются для выявления высокого доверия белок: белковые взаимодействия (рис. 1). SILAC иммунопреципитацию позволяет выявить не только прямых взаимодействий, но и низким сродством или косвенных взаимодействий с белковыми комплексами 4. Используя эту систему, eIF4AI и II immunoprecipitations разрешено воспроизводимый и уверенный опознавание первичной связывающим партнером eIF4G (изоформ I / II и III) 5, а также косвенные взаимодействия с eIF4E, а также многочисленные компоненты комплекса eIF3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium &#160;(DMEM)</td>
			<td style="width:87px;">Dundee Cell Products</td>
			<td style="width:88px;">LM010</td>
			<td style="width:745px;">DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:271px;">Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml</td>
			<td rowspan="2" style="width:87px;">Dundee Cell Products</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">DS1003</td>
			<td rowspan="2" style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Arginine (R0) 25g</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">A8094</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Arginine (R6) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CLM-2265</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Arginine (R10) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CNLM-539</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Lysine (K0) 25g</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">L8662</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Lysine (K4) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">DLM-2640</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Lysine (K8) 0.5g</td>
			<td style="width:87px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:88px;">CNLM-291</td>
			<td style="width:745px;">Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml</td>
			<td style="width:87px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">15140-122</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:88px;">11668-027</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">GFP-trap Agarose (500&#956;l resin)</td>
			<td style="width:87px;">Chromotek</td>
			<td style="width:88px;">gta-20</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">5x SDS Sample loading buffer</td>
			<td style="width:87px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">PN39000</td>
			<td style="width:745px;">The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td style="width:87px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:88px;">539134</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">1.7ml&#160; prelubricated tubes</td>
			<td style="width:87px;">Costar</td>
			<td style="width:88px;">3207</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">BCA protein assay kit (1L)</td>
			<td style="width:87px;">Pierce</td>
			<td style="width:88px;">23225</td>
			<td style="width:745px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Tris (Trizma)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Rnase cocktail</td>
			<td style="width:87px;">Ambion</td>
			<td>AM2286&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">NP-40 alternative</td>
			<td style="width:87px;">Millipore</td>
			<td align="right">492016</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of protein interaction partners in mammalian cells using silac-immunoprecipitation quantitative proteomics

Количественные протеомика в сочетании с очистки иммуно-аффинной, SILAC иммунопреципитацией, представляют собой мощное средство для открытия нового белка: белковых взаимодействий. Допуская точную количественную оценку относительного белка изобилии в контрольной группе и образцов, истинные взаимодействия могут быть легко отличить от экспериментальных загрязнений. Низким сродством взаимодействия могут быть сохранены путем использования менее жестких условиях буферных и быть легко идентифицировать. Этот протокол обсуждает маркировки клетках тканевой культуры с стабильный изотоп меченых аминокислот, трансфекции и иммунопреципитации сродством отмеченных интерес белок, после чего готовится для представления к массовому объекта спектрометрии. Этот протокол, то обсуждается, как анализировать и интерпретировать данные, возвращенные из масс-спектрометра с целью выявления клеточных партнеров, взаимодействующих с белком интересов. В качестве примера этот метод применяется для идентифы белки обязательные для эукариотических факторов инициации трансляции: eIF4AI и eIF4AII.

В типичном эксперименте SILAC выпадающего, подавляющее большинство из идентифицированных белков (&gt; 90%) представляют загрязняющие вещества, а также белки, связывающие неспецифически с аффинной матрицы, и это показано на фиг.2В, даже когда стиральные протоколы удалить большую часть цитоплазматического загрязняющих веществ таких как GAPDH (рис. 2А). Тем не менее, кластеризация неспецифически связывающих белков в нормальном распределении позволяет белки, которые специфически связываются с представляющим интерес белком следует отличать так как они имеют более высокие образец / макет коэффициенты, чем фон. В то время как загрязняющие вещества теоретически должна группироваться вокруг SILAC логарифма отношения 2 0, это не обязательно так, пример этого приведен на рис 3. Возможными причинами этого включают несовершенную SILAC маркировки клеток, загрузка неравные объемы или концентраций лизата на анти-GFP бусы, случайной потери из бисера во время очистки или неравной смесиING образцов в конце процедуры очистки 3. Тем не менее, предполагая данные анализируются на основе порогового стандартного отклонения от среднего значения нормально распределенных примесей, незначительные сдвиги в центрирования данных не должны влиять на качество результатов. При сравнении различия в белковых взаимодействий между двумя родственных белков, аналогичная ситуация может возникнуть, когда один интерес белок производится до более высоких уровней, чем в клетках второго (или из-за различий в эффективности трансфекции, или внутреннее свойство белка или мРНК) . Некоторые изменение в выражении (например, 2А) может быть скорректирована на основе анализа соотношение SILAC для этих двух образцов. В данном примере это будут образцы GFP-eIF4AI и GFP-eIF4AII. Анализируя соотношение 4AI/4AII SILAC как описано в разделе 7, можно идентифицировать белки, связывание значительно варьируется между изоформ. <pкласс = &quot;jove_content&quot;&gt; На рисунке 4, представление eIF4A-связывающих белков, выявленных в одном из экспериментов, проведенных реплики показано иллюстрирующий охват фактора комплекса инициации этот протокол достигнутом. Самые высокие показатели, как правило, наблюдается с eIF4G, который связывает непосредственно к eIF4A, с низким соотношением для eIF4E, который связывается с eIF4G на участке, вдали от eIF4A-связывающий сайт. При более низком коэффициенте наблюдались для членов комплекса eIF3. Тем не менее, это ясно показывает, что эксперимент удовлетворительно определены прямые и косвенные обязательные партнеров eIF4AI и II. Как и следовало ожидать от своей идентичности высокой последовательности 6, белок: белковые взаимодействия появился во многом сохраняется между двумя изоформ в этой экспериментальной системе 7, 8. Выбор некоторых из взаимодействующих белков приведены в таблице 2, иллюстрирующий формат данных. <table border="0" cellpadding="0" cellspAcing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Заголовок столбца </td><td> Описание </td></tr><tr><td> Вступление </td><td> Отображает регистрационный номер, для последовательности </td></tr><tr><td> Охват </td><td> Доля последовательности белка, покрытой идентифицированных пептидов </td></tr><tr><td> ♯ PSM </td><td> Пептид спектральная матч </td></tr><tr><td> ♯ пептиды </td><td> Общее количество уникальных пептидов, идентифицированных белок </td></tr><tr><td> ♯ АА </td><td> Длина белка в аминокислоты </td></tr><tr><td> МВт (Да) </td><td> Молекулярная масса белка в дальтон. Исключает изменения </td></tr><tr><td> известково. П.И. </td><td> Теоретическое изоэлектрическая точка белка </td></tr><tr><td> Счет </td><td> Общий балл белка (который представляет собой сумму Individual забивает пептидные). Точная оценка требуется для значения будут варьироваться между экспериментами. Объект, MS, как правило, применяются 5% отсечку на ложных открытие. </td></tr><tr><td> Последовательность </td><td> Последовательность аминокислот, составляющих белок </td></tr><tr><td> Соотношение </td><td> Относительная интенсивность пептидов в именованный меченого образца, по сравнению со вторым меченым образца </td></tr><tr><td> Соотношение Граф </td><td> Количество коэффициентов пептидных, которые были использованы для расчета данного коэффициента белка </td></tr><tr><td> Изменчивость побед (%) </td><td> Изменчивость отдельных коэффициентов пептидных, используемых для расчета данного коэффициента белка </td></tr><tr><td> Описание </td><td> Название белка </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Стандартные заголовки столбцов из отчета Протеом Discoverer.В то время как полезная информация может быть получена от всех этих столбцов, те критическим для этого анализа, выделены жирным шрифтом. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1057"><tbody><tr><td> Вступление </td><td> Пептиды </td><td> 4AI/Mock </td><td> 4AII/Mock </td><td> Название </td><td> Анализ SILAC </td></tr><tr><td> A8K7F6 </td><td> 21 </td><td> 100 </td><td> 1 </td><td> eIF4AI </td><td rowspan="2"> &quot;Приманка&quot; белок </td></tr><tr><td> Q14240 </td><td> 22 </td><td> 0.01 </td><td> 90,855 </td><td> eIF4AII </td></tr><tr><td> G5E9S1 </td><td> 25 </td><td> 47,575 </td><td> 30.53 </td><td> eIF4GI </td><td rowspan="3"> Взаимодействие белков </td></tr><tr><td> Q59GJ0 </td><td> 5 </td><td> 11,778 </td><td> 10,619 </td><td> eIF4GII60; </td></tr><tr><td> P06730 </td><td> 3 </td><td> 7.22 </td><td> 7.57 </td><td> eIF4E </td></tr><tr><td> Q5T6W5 </td><td> 4 </td><td> 0.685 </td><td> 0,646 </td><td> hnRNPK </td><td rowspan="2"> Номера для специально связывания загрязнений </td></tr><tr><td> P62805 </td><td> 1 </td><td> 0,531 </td><td> 0.498 </td><td> Гистонов H4 </td></tr><tr><td> H6VRG2 </td><td> 18 </td><td> - </td><td> - </td><td> Кератин-1 </td><td rowspan="2"> Загрязнители окружающей среды </td></tr><tr><td> P35527 </td><td> 11 </td><td> 0.01 </td><td> 0.01 </td><td> Кератин-1 цитоскелета 9 </td></tr></tbody></table> Таблица 2. Типичные Данные эксперимента SILAC иммунопреципитации. Предоставление данные примера для интересующего белка / приманки (высокие пептиды, высокий коэффициент), белки, взаимодействующие с белком интересов (высокая / низкая пептидов, высоким коэффициентом), не специфически связываться белки (высокая / низкая Peptиды, соотношение падает ниже отсечки - в этом эксперименте 0,96), и загрязнители окружающей среды (часто высокие пептиды, отрицательное отношение / ниже порога). <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig1.jpg" /> Рисунок 1. Экспериментальный план. Во-первых клетки выращивают в средах без аргинин и лизин и замещенный стабильного изотопа меченого аргинин и лизин в течение 2 недель (1). (2) Клетки высевают в 10 см 2 блюд и транзитной трансфекции плазмид, кодирующих GFP (Мок) или GFP слитых белков (Образцы). (3) клетки лизируют и GFP или GFP слитые белки иммунопреципитации из лизатов клеток. (4) Образцы объединены в соотношении 1:1 и представлены для анализа ЖХ-МС/МС. Затем данные анализируются, чтобы удалить низкий идент уверенность белкаifications и выбрать уровень обогащения белка, соответствующего подлинных взаимодействующих белков. <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig2.jpg" /> Рисунок 2. Подтверждение подходящие условия иммунопреципитации. A) Вестерн-блот анализ клеточных лизатов, а также несвязанные и связанные фракции из иммунопреципитации подтверждает экспрессию и иммунопреципитации белка, представляющего интерес. Вестерн-блот против GAPDH подтверждает истощение невзаимодействующих белков и еще вестерн-блоттинга известная взаимодействующих партнером eIF4A подтверждает успешное иммунопреципитацию белков, связывающихся с белка. B) Где взаимодействующие партнеры интерес белка не известны, окрашивали серебром гель может подтвердить иммунопреципитацию взаимодействующих белков. На этой серебристо-пятно<html> ред гель полосы для GFP и GFP-eIF4AI/II ясны, и группа мигрирующих с правильным размером для eIF4G присутствует только в GFP-4AI/II-bound полос, а не в контрольной GFP-лейн. <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51656/51656fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51656/51656fig3.jpg" /> Рисунок 3. Представитель результаты. Гистограмму, показывающую распределение коэффициентов белка от одного повторения (А) GFP-eIF4AI или (В) GFP-eIF4AII пулдауна. 1.96 стандартное отклонение среза отмечен пунктирной линией. Взаимодействующих белков выходящие за нормально распределенных загрязняющих веществ очевидны из ~ 0,25 и 1 в (А) и ~ 0,3-1,5 в (B). les/ftp_upload/51656/51656fig4.jpg &quot;/&gt; Рисунок 4. Идентификация EIF сложных членов из одной реплики эксперимента SILAC IP. Белки в зеленый были представляющий интерес белок, используемый для выпадающего меню белков, взаимодействующих с заштрихованы от красного до белого в зависимости от войти 2 соотношение SILAC в SILAC IP с красным является наиболее распространенный белок в анализе, и белый быть отсечка 1.96 SD. Белки, окрашенные в серый не были определены в этом анализе.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics at JoVE.com

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

SILAC иммунопреципитации эксперименты представляют собой мощное средство для обнаружения новый белок: белковых взаимодействий. Допуская точное относительное количественное определение белка изобилии в контрольной группе и тестовых образцов, истинных взаимодействий может быть легко отличить от экспериментальных загрязняющих веществ и низкой аффинности взаимодействия сохраняется за счет использования менее жестких условиях буфера.

Идентификация белков взаимодействию Партнеры в клетках млекопитающих Использование SILAC-иммунопреципитации количественная протеомика

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Research

JoVE Journal

Biology

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Идентификация белковых комплексов с количественной протеомики в CEREVISIAE С.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Бимолекулярные флуоресценции комплементации (BiFC) Пробирной для белок-белковые взаимодействия в Лук ячеек с использованием генной пушки Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Идентификация белка взаимодействие партнеров, используя тандем аффинной очистки

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Проточной цитометрии бимолекулярного флуоресценции Комплементация: Высокая пропускная способность Количественный метод изучения взаимодействия белок-белок

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

миРНК Скрининг для идентификации Убиквитин и Убиквитин-подобной системе регуляторов биологических путей в культивируемых клетках млекопитающих

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Выявление белок-белковых сайтов взаимодействие по пептидов массивов

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Генома белок-белковых Взаимодействие Скрининг белком-фрагментом комплементации анализа (РСА) в живых клетках

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Прямая белка Доставка клетках млекопитающих, используя сотовый проницаемым Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Его<sub&gt; 2</sub&gt; Цинк пальцев Домены

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Идентификация внутриклеточных сигнальных событий, наведенных в жизнеспособные клетки при взаимодействии с соседними сотами Проходят апоптотической гибели клеток

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Графический пользовательский интерфейс для отслеживания концентрации белка в программном сопровождении в динамических клеточных выпячиваниях

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...