Name: rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration
Uploaded: 2014-09-06T14:00:00
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यह अध्ययन राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान अनुदान HL- 103,542, और कैप को BCH संज्ञाहरण रिसर्च फाउंडेशन के गणमान्य इन्नोवेटर पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया.

तैयारी <ol><li> 1 एम कश्मीर HEPES स्टॉक समाधान (KOH के साथ 7.2 पीएच को समायोजित) तैयार करें. </li><li> 0.5 एम कश्मीर EGTA शेयर समाधान (KOH के साथ 8.0 पीएच को समायोजित) तैयार करें. </li><li> 1 एम के.एच. 2 4 पीओ शेयर समाधान तैयार है. </li><li> 1 एम 2</sub...

<ol>
	<li>van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondrial+factors+in+apoptosis:+a+Russian+roulette+with+more+than+one+bullet.">The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet.</a> Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).</li><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+hub+of+cellular+Ca2++signaling.">Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling.</a> Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).</li><li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+Dynamic+Organelles+in+Disease,+Aging,+and+Development.">Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development.</a> Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+Isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods.</a> PLoS ONE. 6 (3), e18317 (2011).</li><li>Bensley, R. R., Hoerr, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+cell+structure+by+freeze-drying+method;+preparation+and+properties+of+mitochondria.">Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria.</a> Anat Rec. 60, 449-455 (1934).</li><li>Claude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+mammalian+liver+cells+by+differential+centrifugation+II.+Experimental+procedures+and+results.">Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results.</a> J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).</li><li>Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues;+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver;+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material.">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).</li><li>Ernster, L., Schtaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+a+historical+Review.">Mitochondria: a historical Review.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li><li>Schmitt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-automated+method+for+isolating+functionally+intact+mitochondria+from+cultured+cells+and+tissue+biopsies.">A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies.</a> Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).</li><li>Fern&#225;ndez-Vizarra, E., Ferr&#237;n, G., P&#233;rez-Martos, A., Fern&#225;ndez-Silva, P., Zeviani, M., Enr&#237;quez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies:+An+update.">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).</li><li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Unit+3.3,+Isolation+of+mitochondria+from+tissues+and+cells+by+differential+centrifugation.">Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2001).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).</li><li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells.">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li><li>Gostimskaya, I., Galkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+highly+coupled+rat+heart+mitochondria.">Preparation of highly coupled rat heart mitochondria.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).</li><li>Masuzawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+autologously+derived+mitochondria+protects+the+heart+from+ischemia-reperfusion+injury.">Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury.</a> American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).</li><li>McCully, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+isolated+mitochondria+during+early+reperfusion+for+cardioprotection.">Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection.</a> American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).</li><li>Olson, M. S., Von Korff, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+endogenous+substrates+of+isolated+rabbit+heart+mitochondria+during+storage.">Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage.</a> J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).</li><li>Diepart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+for+measuring+oxygen+consumption+in+tumor+cells+in+vitro.">Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro.</a> Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).</li><li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro.">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li></ol>

इसे सफलतापूर्वक mitochondrial व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए बर्फ पर सभी समाधान और ऊतकों के नमूनों को रखने के लिए आवश्यक है इस प्रोटोकॉल का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया अलग. बर्फ पर बनाए रखा, तब भी जब अलग माइटोक?...

माइटोकॉन्ड्रिया लाल रक्त कोशिकाओं को छोड़कर शरीर में हर कोशिका में मौजूद हैं और महत्वपूर्ण सेलुलर और चयापचय की प्रक्रिया 1-4 की एक बड़ी संख्या में शामिल हैं. क्योंकि इनमें से कई कार्यों की, mitochondrial क्षति हानिकारक प्रभाव 3 हो सकता है. Mitochondrial समारोह और रोग कई mitochondrial अलगाव तरीकों की जांच करने के आदेश में वर्णित किया गया है. 1940 5-8 को mitochondrial अलगाव की तारीख की जल्द से जल्द प्रकाशित खातों. पहली दस्तावेज प्रयास कम गति 5,8 में नमक के घोल में centrifugation द्वारा पीछा एक मोर्टार में जिगर ऊतक पीस द्वारा mitochondrial अलगाव का प्रदर्शन किया. बाद में, अन्य समूहों के मूल प्रक्रिया पर विस्तार किया है और अंतर centrifugation 6-8 पर आधारित ऊतक विभाजन का प्रदर्शन किया. ये जल्दी तरीकों अक्सर homogenization, और / या अंतर centrifugation 9-15 शामिल है जो वर्तमान तकनीकों का आधार बनाया. homogenizati की संख्याकदम पर और centrifugation प्रोटोकॉल के बीच बदलता है. ये दोहराए चरणों mitochondrial अलगाव के लिए समय बढ़ाने के लिए और अंततः व्यवहार्यता को कम. ठीक से 10,16 नियंत्रित नहीं इसके अलावा, अगर पुस्तिका homogenization mitochondrial क्षति और असंगत परिणाम हो सकता है. हाल ही में, हम दौरे ऊतक 17,18 में प्रत्यारोपण के लिए माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के homogenization और अंतर centrifugation इस्तेमाल किया. यह लंबा अलगाव की प्रक्रिया लगभग 90 मिनट की जरूरत है और इस विधि के नैदानिक ​​प्रयोज्यता इसलिए सीमित था. नैदानिक ​​और शल्य चिकित्सा उपचार में तीव्र चिकित्सकीय प्रयोग के लिए अनुमति देने के लिए हम कम से कम 30 मिनट में किया जा सकता है कि एक तेजी से mitochondrial अलगाव प्रक्रिया का विकास किया है. इस प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ मानकीकृत ऊतक हदबंदी वर्दी और आसानी से मार्गदर्शन homogenization के साथ प्राप्त नहीं है कि ऊतक के अनुरूप homogenization के लिए अनुमति देता है कि कर रहे हैं. Addit मेंआयन, अंतर centrifugation की जगह में अंतर निस्पंदन का उपयोग समय लगता है और अत्यधिक, विशुद्ध रूप से व्यवहार्य और श्वसन सक्षम माइटोकॉन्ड्रिया का अधिक तेजी से अलगाव के लिए अनुमति दोहराए centrifugation कदम समाप्त. कम से कम 30 मिनट में व्यवहार्य और श्वसन सक्षम माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने की क्षमता नैदानिक ​​प्रयोज्यता के लिए अनुमति देता है. इस अलगाव प्रोटोकॉल कोरोनरी धमनी बाईपास ग्राफ्टिंग सर्जरी (सीएबीजी) और अन्य चिकित्सकीय प्रक्रियाओं में उपयोग के लिए क्षमता है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="933">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:377px;">Sucrose</td>
			<td style="width:181px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">84100</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Substilsin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P2173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:377px;">ATPlite Luminescence Assay System, 
			1000 Assay Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6016941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 mL Conical Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">40 &#956;m Nylon Filters</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GentleMACS C tube</td>
			<td>Miltenyl Biotech</td>
			<td>120-005-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 mm biopsy punch</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>33-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 &#956;m Pluristrainer</td>
			<td>Pluriselect</td>
			<td>43-500-10-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eppendorf Centrifuge 5415C</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>EP-5415C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GentleMACS Dissociator&#160;</td>
			<td>Miltenyl Biotech</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well plates, tissue culture treated</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rotomax 120 orbital shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>544-41200-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Synergy H4 Hybrid Multi-Mode 
			&#160;Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multisizer 4 Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxytherm System</td>
			<td>Hansatech Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration

अंतर centrifugation और / या Ficoll ढाल centrifugation का उपयोग पहले से वर्णित mitochondrial अलगाव तरीकों को पूरा करने के लिए 60-100 मिनट की आवश्यकता होती है. हम एक वाणिज्यिक ऊतक dissociator और अंतर निस्पंदन का उपयोग स्तनधारी बायोप्सी से माइटोकॉन्ड्रिया का तेजी से अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल में, पुस्तिका homogenization ऊतक dissociator के मानकीकृत homogenization चक्र के साथ बदल रहा है. यह वर्दी और आसानी से मार्गदर्शन homogenization के साथ प्राप्त नहीं है कि ऊतक के अनुरूप homogenization के लिए अनुमति देता है. ऊतक हदबंदी के बाद, homogenate दोहराए centrifugation कदम को खत्म जो नायलॉन जाल फिल्टर, के माध्यम से फ़िल्टर्ड है. नतीजतन, mitochondrial अलगाव कम से कम 30 मिनट में किया जा सकता है. इस अलगाव प्रोटोकॉल 0.18 ± 0.04 छ (गीला वजन) ऊतक के नमूने से लगभग 2 एक्स 10 10 व्यवहार्य और श्वसन सक्षम माइटोकॉन्ड्रिया पैदावार.

ऊतक हदबंदी और अंतर निस्पंदन का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव में प्रक्रियात्मक चरणों रूपरेखा आंकड़ा चित्र 1 में दिखाया गया है. कुल प्रक्रियात्मक समय 30 मिनट से भी कम है. ऊतक के नमूने ए...

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Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

स्तनधारी ऊतक बायोप्सी से माइटोकॉन्ड्रिया का तेजी से अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन किया है. चूहा जिगर या कंकाल की मांसपेशी की तैयारी एक वाणिज्यिक ऊतक dissociator साथ homogenized गया और माइटोकांड्रिया नायलॉन जाल फिल्टर के माध्यम से अंतर निस्पंदन से अलग थे. वैकल्पिक तरीकों का उपयोग कर 100 मिनट - Mitochondrial अलगाव समय 60 की तुलना &lt;30 मिनट है.

ऊतक हदबंदी और अंतर निस्पंदन द्वारा प्रत्यारोपण के लिए mitochondria की रैपिड अलगाव और शुद्धि

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

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