Name: averaging of viral envelope glycoprotein spikes from electron cryotomography reconstructions using jsubtomo
Uploaded: 2014-10-21T13:00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo at JoVE.com

This work was supported by the Academy of Finland (130750 and 218080 to J.T.H.), the Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z to T.A.B.), and by the MRC (MR/J007897/1 to J.T.H and T.A.B; MR/L009528/1 to T.A.B.).

<ol>
	<li>Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+the+26S+proteasome+by+cryoelectron+tomography.">Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography.</a> Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).</li><li>Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+3-D+structure+of+vimentin+intermediate+filaments+by+cryo-electron+tomography.">Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography.</a> Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).</li><li>Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography+of+clathrin-coated+vesicles:+structural+implications+for+coat+assembly.">Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly.</a> Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).</li><li>Gr&#252;newald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography.">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li><li>Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+structure+of+the+complete+Treponema+primitia+flagellar+motor.">In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor.</a> Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).</li><li>Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography.">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).</li><li>Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+resources+for+cryo-electron+tomography+in+Bsoft.">Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft.</a> Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).</li><li>Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Casta&#241;o-D&#237;ez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamo:+a+flexible,+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments.">Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li><li>Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -. V., F&#246;rster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PyTom:+a+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis.">PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li><li>Fern&#225;ndez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+methods+for+electron+tomography.">Computational methods for electron tomography.</a> 43 (10), 1010-1030 (2012).</li><li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging).">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging).</a> Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li><li>Frangakis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+macromolecular+complexes+in+cryoelectron+tomograms+of+phantom+cells.">Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).</li><li>Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Gr&#252;newald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomographic+structure+of+an+immunodeficiency+virus+envelope+complex+in+situ.">Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ.</a> PLoS pathogens. 2 (8), (2006).</li><li>Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+native+HIV-1+gp120+trimers.">Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers.</a> Nature. 455 (7209), (2008).</li><li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).</li><li>Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+the+third+dimension+to+virus+life+cycles:+three-dimensional+reconstruction+of+icosahedral+viruses+from+cryo-electron+micrographs.">Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).</li><li>Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-containing+viruses+with+icosahedrally+symmetric+capsids.">Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).</li><li>Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography+of+measles+virus+reveals+how+matrix+protein+coats+the+ribonucleocapsid+within+intact+virions.">Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).</li><li>Arranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+native+influenza+virion+ribonucleoproteins.">The structure of native influenza virion ribonucleoproteins.</a> Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).</li><li>Karotki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eisosome+proteins+assemble+into+a+membrane+scaffold.">Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold.</a> Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).</li><li>Pietil&#228;, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virion+architecture+unifies+globally+distributed+pleolipoviruses+infecting+halophilic+archaea.">Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea.</a> Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).</li><li>Huiskonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography+of+Tula+hantavirus+suggests+a+unique+assembly+paradigm+for+enveloped+viruses.">Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses.</a> Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).</li><li>Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthobunyavirus+ultrastructure+and+the+curious+tripodal+glycoprotein+spike.">Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike.</a> PLoS pathogens. 9 (5), (2013).</li><li>Maurer, U. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structure+of+Herpesvirus+Fusion+Glycoprotein+B-Bilayer+Complex+Reveals+the+Protein-Membrane+and+Lateral+Protein-Protein+Interaction.">The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction.</a> Structure. 21 (8), 1396-1405 (1993).</li><li>Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+in+a+marine+picoeukaryote+is+a+disordered+assemblage+of+nucleosomes.">Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes.</a> Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).</li><li>Scheres, S. H. W., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+overfitting+in+cryo-EM+structure+determination.">Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination.</a> Nature. 9 (9), 853-854 (2012).</li><li>Heymann, J. B., Belnap, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bsoft:+image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy.">Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li><li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera.">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).</li><li>Faini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structures+of+COPI-coated+vesicles+reveal+alternate+coatomer+conformations+and+interactions.">The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions.</a> Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabs+enable+single+particle+cryoEM+studies+of+small+proteins.">Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins.</a> Structure. 20 (4), 582-592 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Viryon membran viral glikoprotein başak yapısının ortaya çıkarılmasıyla, virüs kopyalanmasını anlamak ve tedavi etmek ve enfeksiyonu önlemek için terapötik maddelerin geliştirilmesi için esastır. Tek bir parçacık ortalama ile bir araya Elektron mikroskobu kriyo-glikoprotein dahil olmak üzere sivri zarflı virüs partiküllerinin, yapılarını çözmek için en çok kullanılan yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, bu yöntem, simetrik virüsleri icosahedrally sınırlıdır. Burada, Jsubtomo elektron cryo-tomografi ve subtomogram ortalamanın uygulaması ile, biz pleomorfik diğer mevcut yapısal biyoloji yöntemleri uygun değildir virüsleri glikoprotein sivri zarflı belirlenmesi için genel bir protokol ana hatlarıyla. Bizim için temsili sonuçlar, bu yöntemin çözünürlüğü etki mimari, oligomerizasyonu ve sağlam viryonları üzerindeki glikoprotein sivri yüksek dereceli kuruluşa bakış açısı ortaya çıkarmak için yeterli olduğunu göstermektedir. jove_content &quot;&gt; Bu protokol çerçevesinde en kritik adım, bu aşamada başka. Başarılı yürütme glikoprotein kramponları, böylece yeterince büyük ve çok sıkı birbirlerine karşı değil dolu olduğunu varsayar birinden istatistiksel olarak bağımsız iki güvenilir bir başlangıç ​​modelleri oluşturmak bireysel sivri yapabilirsiniz görsel tanınan ve el tomogramları toplanmış ve iki bağımsız modelleri ortalaması alınmalıdır., bu mümkün değilse, protokol iki değişiklik teşebbüs edilebilir. Birincisi, iki bağımsız random modeller sonra ilk subtomograms rastgele iki alt kümelerini tanımlama ve inşa edilebilir Bu alt-gruplar içinde 30 subtomograms ortalama. İkinci olarak, izole edilmiş bir sivri yapı, X-ışını kristalografisi ile, örneğin başka yollarla elde edilmiş olsa bile, bu başlangıç ​​modeli olarak kullanılabilir. Ancak, bakım, düşük alınmalıdır arıtmanın bir sonraki turda olacak iki sonuçlanan modelleri gibi, düşük çözünürlüklü cut-off (50-70 Å) kullanarak filtreyi Bu modeli geçmekSadece bu çözünürlükte ötesinde istatistiksel bağımsız olması. Bu ihtar nedeniyle, eski yaklaşım tavsiye edilir. Bu protokol elde çözünürlük, dört ana faktöre bağlıdır: i. veri toplama stratejisi ve girdi verilerinin kalitesi, ii. subtomograms sayısı, III. hizalama subtomograms doğruluğu ve iv. yapıların heterojen. Birinci ve ikinci sınırlama, büyük ölçüde yüksek sinyal-gürültü doğrudan elektron CTF ile kombine dedektörleri tomografi giderilmiştir ve otomatik veri toplanmasını kullanılarak aşılabilir birlikte, hizalama hassasiyeti daha da ilgi kendisinin yapısının boyutu ve şekli etkilenir. Belirgin özellikleri göstermeyen küçük sivri bu protokolü uygulanır, bu hizalama doğruluk ve böylece çözünürlüğü arttırmak için 31 sivri Fab fragmanlarını bağlamak için avantajlı olabilir. Son olarak, bu yapılar için ortalama halinde sergi çoklu biçimlerde, alt-tomam sınıflandırma yöntemi ayrıca farklı konformasyonlara ortalama için kullanılabilir. Bu amaçla, Jsubtomo güçlü subtomogram sınıflandırma 9 sunan, Dinamo paketi ile bütünleştirir. Yukarıdaki protokol izole edilmiş viral glikoproteinler de, X-ışını kristalografisi tamamlayıcıdır. Kristalografik yapılar viryon zanna göre glikoproteinin Tam bir yönlendirme elde etmek için alt-tomogram ortalamalar içine monte edilebilir. Bu metodolojinin uygulama şüphesiz zarflı virüs yapısında ve patobiyolojisi üzerine ışık tutmaya devam edecektir.

Elektron cryo-tomografi karmaşık biyolojik örneklerin bir üç boyutlu (3D) yeniden hesaplanmasını sağlayan bir elektron cryo-mikroskopi görüntüleme tekniğidir. Müsait örnekler bütün prokaryotik hücreler 5 ve bütün ökaryotik hücreler 6 bile ince alanlara saflaştırılmış makro-moleküler kompleksler 1, filaman 2, kaplamalı veziküller 3 ve pleomorfik membran virüs 4 arasında değişir. Bir tilt-dizi, 3D tomografik hacimleri, ya tomogramları veri toplama ardından, Bsoft 7 ve imod 8 olmak üzere birkaç kurulan yazılım paketleri kullanılarak hesaplanabilir. Elektron cryo-tomografi sınırı gelen tomografik hacimlerinin biyolojik yorumlanması biyolojik örneklerin çalışmaya doğasında iki yönü. Bağlı olarak büyük radyasyon hasarı verilmesinden önce, biyolojik malzemelerden uygulanabilir sınırlı elektron doz signa, İlktomografi veri L-gürültü oranları tipik olarak çok düşüktür. İkinci olarak, veri toplama sırasında kısıtlı örnek eğim geometrisinin bir sonucu olarak, nesnenin bazı incelemeler tomografik hacimde bir sözde &#39;eksik kama&#39; artefakt yol mevcut kalır. Tomografik birim halinde başarılı olarak 9-12 ortalama böyle makromoleküler kompleksler olarak özdeş yapılar, tekrar içerir, ancak, bu dezavantajların her ikisi de aşılabilir. Tomogram rekonstrüksiyonlarda gelen yapıları ortalama önce, ilgi nesneler bulundu ve aynı yönde hizalanmış olmalıdır. Bu tür yapıları yerlerinin çoğu zaman, şablon olarak 13 eşleşen anılan bir yaklaşım kullanarak tomografik hacminde bir şablon yapının çapraz korelasyon elde edilebilir. Bu eşleştirme işleminde kullanılan şablon elektron cryo-mikroskobu veya 3D rekonstrüksiyon ile birlikte elektron cryo-tomografi elde edilebilir, ya da gelen simüle bir yoğunluk haritası olabilirBir atom yapısı. Birkaç bilgisayar paketler 11, bu görevleri yerine getirmek üzere geliştirilmiştir. HIV-1 gibi membran virüsler, glikoprotein sivri ortalama, onların yapısını 14-16 çalışmak için özellikle başarılı bir yaklaşım olmuştur. Yapının, virüs konakçı etkileşimleri hem de moleküler temeli ortaya çıkartılması ve anti-viral ve aşı tasarımının gelişimi yönlendirmek için ayrılmaz bir parçasıdır. Makromoleküler glikoproteinler kristalografi ayrı ayrı virütik ve komplekslerin yapı analizine (4, bir zaman daha iyi) yüksek çözünürlüklü için tercih edilen bir tekniktir, ancak bu yöntemle elde edilen X-ışını yapısı, viryonun üzerindeki doğal ortamdan izole membran proteinleri vardır . Bu durumda, bu virion bağlamında viral glikoproteinlerin daha yüksek dereceli mimari, önemli bilgileri, eksik kalır. Öte yandan, elektron mikroskobu ve kriyo-tek parçacık yenidenbütün kılıflı virüsler ikosahedral simetri 17,18 ile virionlann sınırlandırılmıştır. Alt ses uyumu ile birlikte elektron cryotomography böylece yerinde düzensiz şekilli, pleomorfik virüslerin glikoprotein sivri çalışma izin tamamlayıcı bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Biz Jsubtomo tomografik alt birimlerin tespiti, hizalama ve ortalama için (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) adında bir yazılım geliştirdik. Jsubtomo hücresel ve viral yapının 19-26 bir dizi yapı belirlemelerinde kullanılmıştır. Burada, biz belirlenmesi viral yüzey başak yapıları sağlayan ayrıntılı bir protokol, anahat. Gürültü ilişkilendirerek aşırı arıtma ortalama yapıların aşmak için, &#39;altın standart&#39; arıtma şeması 10,27 benimsenmiştir. Son olarak, görselleştirme ve tipik sonuçların yorumlanması için stratejiler tartışılmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:184px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jsubtomo (ver 1.3.1)</td>
			<td style="width:184px;">University of Oxford</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>www.opic.ac.uk/jsubtomo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bsoft (ver 1.8.7)</td>
			<td style="width:184px;">NIAMS, NIH</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>bsoft.ws</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:184px;">UCSF</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>www.cgl.ucsf.edu/chimera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

averaging of viral envelope glycoprotein spikes from electron cryotomography reconstructions using jsubtomo

Zarflı virüsler konakçı hücrelere giriş aracılık etmek ile ilgili yüzeyi üzerindeki zar glikoproteinleri kullanmaktadır. Bu glikoprotein &#39;sivri&#39; Üç-boyutlu yapısal analizler çoğunlukla viral patogenezi anlamak için ve ilaç tasarımında teknik açıdan zor ama önemlidir. Burada, bir protokol elektron cryo-tomografi verileri hesaplama ortalamaya yoluyla viral başak yapı tayini için sunulmuştur. Elektron cryo tomografi bir doğala yakın, dondurulmuş sulu halde membran virüsler gibi biyolojik örneklerin pleomorfik, üç boyutlu hacimli tomografik rekonstrüksiyon veya tomografi, elde etmek için kullanılan elektron mikroskobu bir tekniktir. Bu tomografi düşük çözünürlükte olsa, üç boyutta ilgi yapılar ortaya çıkarmak. Alt birimlerine veya alt tomografi Hesaplamalı ortalama, viral glikoprotein sivri gibi yapısal motiflerini, tekrar eden yüksek çözünürlüklü detay elde etmek için gereklidir. Ali için ayrıntılı bir hesaplama yaklaşımıgning ve Jsubtomo yazılım paketi kullanarak, alt-tomogram ortalama özetlenmiştir. Bu yaklaşım, virion zar üzerinde yüksek seviyeli başak sivri uç etkileşimlerin bir çalışma 20-40 Â çözünürlük aralığında ve çalışma viral glikoprotein sivri yapısının görselleştirme sağlar. Tipik sonuçlar Bunyamwera virüsü, Bunyaviridae ailesinden zarflı virüs için sunulmuştur. Bu aile, insan ve hayvan sağlığı için bir tehdit patojenlerin yapısal olarak farklı bir gruptur.

Biz 24 set daha önce yayınlanmış verileri kullanılarak Bunyamwera virüsü (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) zarf glikoprotein kompleksi için yukarıda belirtilen alt tomogram ortalama iş akışı uygulama göstermektedir. Veri toplama ve arıtım parametreleri izleyen Tablo 1 &#39;de listelenmiştir. Bir temsilci tomogram, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Parametre (birim) </td><td> Değer </td></tr><tr><td> Veri toplama </td><td></td></tr><tr><td> Gerilimi (kV) </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Kalibre büyütme (X) </td><td> 111.000 </td></tr><tr><td> Piksel boyutu (Å) </td><td> 5.4 </td></tr><tr><td> Tahmini doz (e - / Å 2) </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Underfocus (um) </td><td> 4.0-4.5 </tD&gt; </tr><tr><td> İlk CTF sıfır (Å) bir </td><td> 26-30 </td></tr><tr><td> Eğim aralığı (°) </td><td> -60-60 </td></tr><tr><td> Tilt örnekleme (°) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Veri ve arıtma </td><td></td></tr><tr><td> Tomografi </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Virionları </td><td> 29 </td></tr><tr><td> Viryonunun başına Tohumlar </td><td> 106 </td></tr><tr><td> Tohum sayısı </td><td> 3.074 </td></tr><tr><td> Spike tespit </td><td> 1.346 </td></tr><tr><td> Örtüşmeler çıkarıldıktan sonra ani </td><td> 1.401 </td></tr><tr><td> Çapraz-korelasyon sivri tabanlı değil seçimi </td><td> 1.022 </td></tr><tr><td> Spike son ortalamaya dahil </td><td> 1.022 </td></tr><tr><td> Simetri </td><td> C3 </td></tr><tr><td> Açısal örnekleme (°) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Çözünürlükarıtmada kullanılan aralığı (Å) </td><td> 42-334 </td></tr><tr><td> Nihai çözünürlük tahmini (a) b </td><td> 35 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Bunyamwera veri toplama ve arıtma istatistikleri. Bir CTF, kontrast transfer fonksiyonu. b 0.143 bir eşik iki bağımsız rafine yapılar arasındaki Fourier kabuk korelasyon kullanılarak hesaplanmıştır. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 2:. Bunyamwera virionlann bir tomografisinde yoluyla Dilim her viryonunun çevresi belirgin Çeşitli başak yan görüntüleridir ok uçları ile gösterilir. Tomogram 60 Â Filtresinde düşük geçiş olmuştur. Ölçek çubuğu 100 nm. Öncelikle, biz 205 elle aldı sivri kullanarak bir başlangıç ​​modeli (rafine <strong&gt; Şekil 3). Merkez-en başak üç kat simetri herhangi bir simetri (Şekil 3B) uygulamadan açıktı ve arıtma sonraki turlarda (Şekil 3C) empoze edildi. Viryon yüzeyler üzerinde otomatik olarak sivri tespit için, 43 nm ile 20 ° (Şekil 4A) arasında aralığın yarıçapta her bir virion 106 tohumları üretilir ve yinelemeli membran (Şekil 4B) göre konumlarını rafine. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig3highres.jpg" width="600" /> Şekil 3: ilk şablon yapısı iyileştirildi. (A) Silindir şeklinde sivri elle tanımlanmış pozisyonlarda inşa (C100) şablonu ortalama. (B) Ortalama yoğunluğu arıtma beş tur sonra herhangi bir simetri olmadan (C1), üç kat ile görüntüler bir başak empozesimetrik özellikleri. Modelin çözünürlüğü 48 Å. Başak (C) Ortalama üç kat simetri ile arıtma beş turdan sonra 41 Å de çözüldü. <img alt="Şekil 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig4highres.jpg" width="600" /> Şekil 4:.. Tohumların Arıtma ab) A, (daha önce tohumların bir alt) ve sonra (B) &#39;arıtma Şekil 2&#39; den bir viryon yoğunluğuna (B) &#39;de gösterilmektedir tohumlar olmuştur renk kodlu ilgili Çapraz göre korelasyon katsayıları (mavi, düşük korelasyon; kırmızı, yüksek korelasyon). (Örtüşmelerin çıkardıktan sonra üst% 75; ~ 1,000 kramponları) iyi correlating glikoprotein başak yamalar son ortalamasını hesaplamak için kullanıldı. Ortalama 35-Å çözünürlük (Şekil 5) karar verildi. Bu, ortada bir trimetik başak yapı ortaya çıkardıaltı komşu sivri bazı katkı ilave. Bilinen pozisyonlarda yapısını yerleştirerek hesaplanan virionlar, kompozit modelleri, viryon yüzeyi (Şekil 6) üzerine sivri yerleştirilmesini saptandı. Bazen, sivri yerel emretti yamalar (Şekil 6B) belirgindir. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig5highres.jpg" width="600" /> Şekil 5: şablon eşleştirme sonra glikoprotein başak tabakasının bir yama Rafine yapısı. (AB) &#39;bile&#39; ve &#39;garip&#39;, verilerin iki yarısı yeniden inşa İki haritalar gösterilmektedir. Iki harita yaklaşımın validness doğrulayan bir benzerlik dikkat çekici derecesini göstermektedir. Iki harita birbirinden bağımsız olarak tamamen yeniden inşa edilmiş olarak başak uzun ekseni etrafında yönelim farklı. Iki harita (C) ortalama ile gösterilir35 Å nihai kararı. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig6highres.jpg" width="600" /> Şekil 6: Bunyamwera virion üzerindeki sivri Yerleştirme. (A), viryonun Bileşik modeli. Görünüm vektörleri (sopa) sivri yönelimleri göstermektedir. Renkler her başak ve şablon yapısı (mavi, düşük korelasyon; kırmızı, yüksek korelasyon) arasındaki çapraz korelasyon göstermektedir. Sivri bir sipariş yama (B) A close-up.

Watch this Scientific Journal Video about Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo at JoVE.com

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Jsubtomo kullanılarak Elektron Cryotomography Rekonstrüksiyonunda ikinci viral zarf glikoproteini Spikes ortalamasını

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Cryo-Elektron Tomografi ve Otomatik Sub-tomogram Ortalaması kullanarak HIV Zarf Glikoproteinler Moleküler Yapılarının Belirlenmesi

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Özgül İnsan ve Hayvan Virüsler Mikrobiyal Kaynak Takip için maliyet-etkin Yöntemi

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Virüs mutasyon Frekans RNA Virüsler ve Karakterizasyonu Fidelity Varyantlar izolasyonu

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA Hidroksiapatit Kromatografisi kullanarak bir Çevre Viral Topluluk ayrılması

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Adenovirüs ile enfekte Normal İnsan Hücreleri Viral Çoğaltma Bölme zenginleştirilmiş Alt nükleer Kesirler izolasyonu

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...