Name: generation and purification of human ino80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes
Uploaded: 2014-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes at JoVE.com

Arbeit in der Autoren Labor wird durch einen Zuschuss aus dem National Institute of General Medical Sciences (GM41628) und durch einen Zuschuss an die Stowers Institut für medizinische Forschung von der Helen Nelson Medical Research Fund in der Greater Kansas City Community Foundation unterstützt.

1. Erzeugung und Kultur der HEK293 Stabile Zelllinien, Ganzkörperansicht oder Mutant Versionen von FLAG-Epitop-markierten INO80 oder Andere INO80 Komplexe Untereinheiten <ol><li> Klon-cDNA in voller Länge oder mutierte menschliche INO80 ATPase-Untereinheit oder eine andere INO80 in den Säugetierexpressionsvektor pcDNA5 / FRT mit einer in-frame, N terminalen FLAG-Epitop-Tag kodiert. </li><li> Bestätigung der Sequenz der insertierten cDNAs durch DNA-Sequenzierung, bevor fortgefahren wird. </li><li> Um die Transfekti...

<ol>
	<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+chromatin+remodeling+complexes,+Annual+Review+of+Biochemistry.">The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry.</a> 78, 273-304 (2009).</li><li>Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HSA+domain+binds+nuclear+actin-related+proteins+to+regulate+chromatin-remodeling+ATPases.">The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases.</a> Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).</li><li>Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromatin+remodelling+complex+involved+in+transcription+and+DNA+processing.">A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing.</a> Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).</li><li>Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+actin-related+proteins+in+ATP-dependent+chromatin+remodelling.">Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling.</a> Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+organization+of+the+human+INO80+chromatin+remodeling+complex:+an+evolutionarily+conserved+core+complex+catalyzes+ATP-dependent+nucleosome+remodeling.">Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).</li><li>Sauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+recombination:+developments+and+applications.">Site-specific recombination: developments and applications.</a> 5 (5), 521-527 (1994).</li><li>Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinase-mediated+gene+activation+and+site-specific+integration+in+mammalian+cells.">Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells.</a> Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).</li><li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+chromatin+remodeling+complex+with+similarities+to+the+yeast+INO80+complex.">A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YY1+functions+with+INO80+to+activate+transcription.">YY1 functions with INO80 to activate transcription.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).</li><li>Yao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Modes+of+Regulation+of+the+Uch37+Deubiquitinating+Enzyme+in+the+Proteasome+and+in+the+Ino80+Chromatin-Remodeling+Complex.">Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex.</a> Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).</li><li>Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+purification+of+FLAG+epitope-tagged+bacterial+alkaline+phosphatase+using+a+novel+monoclonal+antibody+and+peptide+elution,+Biotechniques.">Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques.</a> 16 (4), 730-735 (1994).</li><li>Barker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, 207-245 (2005).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+cell+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei.</a> Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).</li></ol>

Strukturelle und funktionelle Untersuchungen mit mehreren Untereinheiten Säuger Chromatin-Remodeling-Komplexe aus höheren Eukaryoten durch die Schwierigkeit der Herstellung von biochemisch nützlichen Mengen solcher Komplexe, die mutierte oder fehlende bestimmte Untereinheiten Untereinheiten insgesamt behindert. Es gibt eine Reihe von technischen Hürden: Erstens hat die genetische Manipulation in Säugerzellen technisch anspruchsvoll und zeitaufwendig gewesen. Anders als Hefezellen, deren Genom kann leicht bearbeitet...

Evolutionär konservierte Familie SNF2 Chromatin-Remodeling-Komplexe sind Schlüsselregulatoren des Chromatins Organisation und DNA-Zugänglichkeit 1. Diese Umbau-Komplexe schließen immer eine zentrale SNF2 artigen ATPase Untereinheit, die in einigen Fällen, montiert mit verschiedenen Zubehör Proteine ​​und bildet mit mehreren Untereinheiten makromolekulare Baugruppen. Um die molekularen Details der ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Prozess zu untersuchen, ist es wichtig, die Beiträge der gegebenen Untermengen von Untereinheiten und / oder den Domain-Strukturen Aktivitäten der Komplexe zu verstehen. Solche Analysen erfordern die Fähigkeit, hoch gereinigten Mutante Komplexe, insbesondere Protein-Untereinheiten oder Domänenstrukturen fehlt erzeugen. Vorherige Struktur-Funktions-Studien von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Komplexe sind allgemein für die Hefe-Modellsystem fokussiert aufgrund der überlegenen Handhabbarkeit des Hefe-Genom (siehe zB Lit. 1-4). Angesichts der Erhaltung derZusammensetzung Einheit und Funktionalität unter ortho-Remodeling-Komplexe, Untersuchungen der Struktur und Funktion der Hefe-Remodeling-Komplexen haben wichtige Einblicke in ihre Gegenstücke in höheren Eukaryoten ist. Dennoch nennenswerte Spezies-spezifische Unterschiede zwischen den Umbau Komplexe existieren, von Gewinn oder Verlust der Spezies-spezifische Untereinheiten, Gewinn oder Verlust der Arten-spezifische Domänen von konservierten Untereinheiten und Sequenzvariabilität innerhalb konservierten Domänen von konservierten Untereinheiten entstehen. Solche Unterschiede können im Prinzip durch die Notwendigkeit für höhere eukaryotische Zellen zu neuen molekularen und zellulären Umgebungen anzupassen angetrieben werden. So verstehen, wie Untereinheiten der höheren eukaryotischen Umbau Komplexe dazu beitragen, die Nukleosomen Umbauprozess ist wertvoll, denn es wirft nicht nur Licht auf die grundlegenden Mechanismen der ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Prozess, sondern kann auch wertvolle Einblicke in die Mechanismen, durch die Chromatinstruktur und Genexpression in higsie Eukaryonten reguliert. Bisher gab es nur strukturelle und funktionelle Untersuchungen mit mehreren Untereinheiten Säuger Chromatin-Remodeling-Komplexe, zum Teil aufgrund der Schwierigkeiten bei der biochemisch definiert Chromatin-Remodeling-Komplexe und Unterkomplexe beschränkt. Wir haben teilweise diese Schwierigkeiten mit den unten beschriebenen Verfahren, bei denen Immunaffinitätsreinigung verwendet wird, um intakt INO80 oder INO80 Subkomplexe aus menschlichen Zellen stabil exprimiert N-terminal FLAG-Epitop markierten Wildtyp-oder mutierte Versionen von INO80 5-7 vorzubereiten umgangen (Abbildung 1) . Intakte INO80 Komplexe aus menschlichen Zellen zu erhalten, wird Flp-vermittelte Rekombination verwendet werden, um transgene HEK293-Zelllinien, die stabil FLAG-Epitop markierten cDNAs Untereinheiten des Komplexes INO80 8-10 kodieren, zu erzeugen. Da die Überexpression von INO80 Untereinheiten kann etwas giftig sein, ist es notwendig, zu isolieren und zu pflegen klonalen Zelllinien unter selektiven CoBedingungen ausgebracht, um eine stabile Expression des Transgens in den vielen Passagen für die Erweiterung des Großzellkulturen erforderlich zu gewährleisten. Um kleinere INO80 Subkomplexe, die nur eine Teilmenge der Untereinheiten enthalten, zu erhalten, haben wir erfolgreich verwendet zwei Ansätze (Abbildung 2a, b). In der ersten, erzeugen wir HEK293 Flp-In-Zelllinien, die stabil mutierten Versionen INO80 die Domains für die Wechselwirkung mit spezifischen Untereinheiten 5 erforderlich fehlt. Alternativ wird siRNA-vermittelten Zuschlags verwendet, um die gewünschte Untereinheit von den Zellen eines geeigneten FLAG-markierten INO80 Einheit (unveröffentlichte Daten) Expression führen. Schließlich, um die Menschen INO80 Komplexe zu reinigen, ist FLAG-Agarose-Chromatographie basiert 11 verwendet, um eine INO80 haltigen Fraktion aus Kernextrakten zu bereichern, damit eine effektive Senkung der Anwesenheit von verunreinigenden Cytosolproteine ​​in der letzten Fraktion, die gereinigtes INO80 oder INO80 Subkomplexe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax-I (stablized glutamine)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">35050-079</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12176C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FuGENE6 transfection reagent&#160;&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:147px;">E2312</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hygromycin B, sterile in PBS</td>
			<td>AG Scientific</td>
			<td style="width:147px;">H-1012-PBS</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA5/FRT vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V6010-20</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Flp-In HEK293 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">R780-07</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V600520</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZview&#160; Red ANTI-FLAG&#160; M2 Affinity Gel&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F2426</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calf serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12138C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TARGETplus SMARTsiRNA pool</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5x siRNA resuspension buffer&#160;</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">#B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine RNAiMAX&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">13778</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">51985-091</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">45000</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TrypLE (trypsin)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">12604</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x FLAG Peptide</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3290</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Bio-Spin Chromatography Column</td>
			<td style="width:212px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:147px;">737-5021</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)</td>
			<td style="width:212px;">Amicon</td>
			<td style="width:147px;">UFC805024&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Desalting Columns&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">89882</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, mouse</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3165</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, rabbit</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F7425</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">P8340</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzonase&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td style="width:147px;">70664</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Equipment</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wheaton Dounce Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td style="width:147px;">06-435C&#160;</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339080</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-17 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">369691</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml polycarbonate tubes&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355630</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 ml polycarbonate bottles&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355655</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339160</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 70.1 Ti rotor&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">342184</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Clay Adams Nutator Mixer</td>
			<td style="width:212px;">BD Diagnostics</td>
			<td style="width:147px;">15172-203&#160;</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glas-Col Tube/Vial Rotator</td>
			<td style="width:212px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:147px;">099A RD4512</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermal cycler PTC 200</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td style="width:147px;">PTC 200</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">roller bottle incubator</td>
			<td style="width:212px;">Bellco biotechnology</td>
			<td style="width:147px;">353348</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td>
			<td style="width:212px;">Millipore</td>
			<td style="width:147px;">IPFL07810</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">3207</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and purification of human ino80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes

INO80 Chromatin-Remodeling-Komplexe regulieren Nukleosomen Dynamik und DNA-Zugänglichkeit durch Katalyse ATP-abhängigen Nukleosomen Umbau. Menschliche INO80 Komplexe aus Protein-Untereinheiten 14 einschließlich INO80 eine SNF2 artigen ATPase, die sowohl als die katalytische Untereinheit und dem Stützgerüst zur Montage der Komplexe dient. Funktionen der anderen Untereinheiten und die Mechanismen, durch die sie den INO80 Komplexes Chromatin-Remodeling-Aktivität beitragen noch schwer, was zum Teil auf die Herausforderung der Erzeugung INO80 Baugruppen in menschlichen Zellen oder heterologen Expressionssystemen. Dieses Protokoll beschreibt JOVE eine Prozedur, die die Reinigung der menschlichen INO80 Chromatin-Remodeling Subkomplexe, die eine Untereinheit fehlt oder eine Teilmenge der Untereinheiten ermöglicht. N-terminal FLAG-Epitop markiert INO80 cDNA stabil in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK) 293-Zelllinien mit Flp-vermittelte Rekombination eingeführt. In dem Fall, dass eine Untergruppe von Untereinheiten des Komplexes ist INO80 zu be gelöscht, statt einer Mutante INO80 Proteine, die die Plattform für die Montage dieser Untereinheiten sind, nicht immer zum Ausdruck bringt. Im Falle eine individuelle Untereinheit ist erschöpft sein, eine Transfekte siRNAs dieser Untereinheit in ein HEK 293-Zelllinie, die stabil FLAG getaggt INO80 ATPase. Kernextrakte werden hergestellt und FLAG Immunpräzipitation durchgeführt, um die Proteinfraktionen, die INO80 Derivate bereichern. Die Zusammensetzungen gereinigt INO80 Subkomplexe kann dann unter Verwendung von Verfahren wie beispielsweise Immunoblotting, Silberfärbung und Massenspektrometrie analysiert werden. Die INO80 und INO80 Subkomplexe entsprechend diesem Protokoll erzeugt wird, kann weiter analysiert werden unter Verwendung von verschiedenen biochemischen Tests, welche in den beiliegenden JOVE Protokoll beschrieben sind. Die hier beschriebenen Methoden können für die Untersuchung der strukturellen und funktionellen Eigenschaften einer Säuger mehreren Untereinheiten Chromatin-Remodeling-Komplexe und Modifikation angepasst werden.

Figur 1 zeigt ein Flussdiagramm eine Zusammenfassung der zur Erzeugung, Reinigung und Charakterisierung menschlicher INO80 ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Komplexen Verfahren. Wie in den 2 und 3 dargestellt, diese Verfahren ermöglichen die Erzeugung von beiden Wildtyp INO80 und INO80 Subkomplexe, die verschiedenen Untereinheiten fehlen, wodurch die nachfolgende biochemische Analysen der Beitrag dieser fehlenden Untereinheiten an enzyma...

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Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung und Reinigung von Wildtyp-und Mutantenversionen der menschlichen INO80 Chromatin-Remodeling-Komplexes. Epitop-markierte Versionen der INO80 Untereinheiten stabil in HEK293-Zellen exprimiert, und die Gesamtkomplexe und Komplexe ohne spezifische Sätze von Untereinheiten durch Immunaffinitätschromatographie gereinigt.

Generation und Reinigung von Menschen INO80 Chromatin Remodeling Komplexe und Subkomplexe

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

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DNA and Chromosome Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

Reinigung und Visualisierung von Influenza A Virus Ribonukleoproteinkomplexe

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Forschung

Biologie

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part II: Reinigung und Kultur der Menschenrechte Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

Visualisierung der interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) Netzwerk in Mäuse

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Herstellung, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanoidkomplexe für die Verwendung als Kontrastmittel für die Magnetresonanz-Tomographie

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Generation, Reinigung und Charakterisierung von Cell-invasive DISC1 Protein Spezies

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Effizienten Herstellung und Reinigung von rekombinantem murinem Kindlin-3 von Insektenzellen für biophysikalische Studien

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Biochemischen Assays zur Analyse von Aktivitäten von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzyme

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...