Name: generation and purification of human ino80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes
Uploaded: 2014-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes at JoVE.com

Yazarların laboratuvar İş Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü (GM41628) bir hibe ile ve Büyükşehir Kansas City Community Vakfı Helen Nelson Tıbbi Araştırma Fonundan Tıp Araştırma Enstitüsü Stowers bir hibe ile desteklenmektedir.

1. Üretim ve tam uzunluktaki veya FLAG işareti Mutant sürümleri ifade eden HEK293 Sabit bir Hücre Soylarının Kültür epitop Ino80 ya da diğer alt-birimleri INO80 Kompleks <ol><li> Tam uzunlukta ya da mutant insan Ino80 ATPaz ya da in-frame, N-terminal FLAG epitop etiketi olan memeli ifade vektörü pcDNA5 / FRT içine bir INO80 alt birimini kodlayan cDNA klonu. </li><li> Devam etmeden önce, DNA dizilimi yolu ile eklenen cDNA dizisini doğrulamak. </li><li> Transfeksiyon gerçekleştirmek için, DMEM (Dulbecc...

<ol>
	<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+chromatin+remodeling+complexes,+Annual+Review+of+Biochemistry.">The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry.</a> 78, 273-304 (2009).</li><li>Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HSA+domain+binds+nuclear+actin-related+proteins+to+regulate+chromatin-remodeling+ATPases.">The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases.</a> Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).</li><li>Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromatin+remodelling+complex+involved+in+transcription+and+DNA+processing.">A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing.</a> Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).</li><li>Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+actin-related+proteins+in+ATP-dependent+chromatin+remodelling.">Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling.</a> Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+organization+of+the+human+INO80+chromatin+remodeling+complex:+an+evolutionarily+conserved+core+complex+catalyzes+ATP-dependent+nucleosome+remodeling.">Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).</li><li>Sauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+recombination:+developments+and+applications.">Site-specific recombination: developments and applications.</a> 5 (5), 521-527 (1994).</li><li>Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinase-mediated+gene+activation+and+site-specific+integration+in+mammalian+cells.">Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells.</a> Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).</li><li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+chromatin+remodeling+complex+with+similarities+to+the+yeast+INO80+complex.">A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YY1+functions+with+INO80+to+activate+transcription.">YY1 functions with INO80 to activate transcription.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).</li><li>Yao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Modes+of+Regulation+of+the+Uch37+Deubiquitinating+Enzyme+in+the+Proteasome+and+in+the+Ino80+Chromatin-Remodeling+Complex.">Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex.</a> Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).</li><li>Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+purification+of+FLAG+epitope-tagged+bacterial+alkaline+phosphatase+using+a+novel+monoclonal+antibody+and+peptide+elution,+Biotechniques.">Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques.</a> 16 (4), 730-735 (1994).</li><li>Barker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, 207-245 (2005).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+cell+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei.</a> Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).</li></ol>

Yüksek Ökaryotlardaki çok altbirimli memeli kromatin remodeling komplekslerinin yapısal ve fonksiyonel çalışmalar mutant birimlerini içeren veya tamamen belli altbirimden yoksun bu tür komplekslerin biyokimyasal yararlı miktarlarda hazırlanması zorluk tarafından engellenmiştir. İlk olarak, memeli hücrelerinde genetik manipülasyon teknik zorlu ve zaman alıcı olmuştur: teknik engellerin vardır. Genomu kolaylıkla Recombineering teknikler kullanılarak düzenlenebilir ve hedef olabilir, maya hücreleri...

Evrimsel olarak korunmuş SnF2 aile kromatin remodeling kompleksleri kromatin organizasyonu ve DNA erişilebilirlik 1 anahtar regülatörler. Bu kompleksler, remodeling, her zaman, bazı durumlarda, çeşitli yardımcı proteinleri ile toplanır ve çoklu alt birim makro-molekül yığınları oluşturan, merkezi bir SnF2 gibi ATPaz alt-birimi bulunmaktadır. ATP&#39;ye bağımlı kromatin yeniden modelleme süreci molekül ayrıntılarını incelemek için, bu komplekslerin faaliyetlerine alt birimlerde ve / veya alan yapı belirli alt-katkılarını anlamak önemlidir. Bu tür analizler, belirli bir protein alt birimleri veya alan yapı yoksun yüksek düzeyde saflaştırılmış mutan kompleksler üretmek üzere yeteneğini gerektirir. ATP-bağımlı kromatin yeniden şekillenme komplekslerinin mi yapı-fonksiyon çalışmalarını yaygın (ref 1-4, örneğin, bakınız) bağlı olarak maya genomuna üstün uygulanabılirliği için maya model sistem üzerine odaklanmıştır. Koruma verilmişortolog biçimlenme kompleksleri arasında birim bileşimi ve işlevsellik, yapısı ve maya yeniden şekillenme komplekslerinin işlevi çalışmalar yüksek ökaryotlar meslektaşlarıyla önemli bilgiler sağladı. Bununla birlikte, takdir türe özgü biçimlenme kompleksler arasında fark kazancı ya da korunmuş alt-birimlerinin korunmuş bölgeler içinde yer alan türe özel alt ünitesi, kazanç ya da korunmuş alt-birimlerinin türe spesifik etki kaybı ve dizi değişkenliğine kaybından kaynaklanan, mevcut. Bu tür farklılıklar prensipte yüksek ökaryotik hücreler yeni moleküler ve hücresel ortamlara uyum için ihtiyaç tarafından tahrik edilebilir. Değil, sadece mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sağlayabilir aynı zamanda ATP-bağımlı kromatin yeniden şekillenme sürecinin temel mekanizmalarına ışık tutuyor, ama çünkü Böylece, daha yüksek ökaryotik yeniden şekillenme komplekslerinin alt birimleri nucleosome yeniden şekillenme sürecine nasıl katkıda anlamak, değerli olan kromatin yapısı tarafından HIG ve gen ekspresyonuOnun ökaryotlar düzenlenir. Bugüne kadar, sadece biyokimyasal tanımlanan kromatin remodeling kompleksleri ve subcomplexes elde zorluklar nedeniyle kısmen çoklu alt birim memeli kromatin remodeling komplekslerinin yapısal ve işlevsel çalışmalar, orada sınırlı kalmıştır. Bu kısmen immün afinite temizliği kararlı bir şekilde N-terminal FLAG epitopu yabani tip ya da mutant Ino80 5-7 sürümlerini etiketli ifade eden insan hücrelerinden sağlam INO80 veya INO80 subcomplexes hazırlamak için kullanıldığı aşağıda tarif edilen prosedürler ile, bu zorlukların şekilde alt (Şekil 1) . Insan hücrelerinden gelen sağlam INO80 kompleksleri elde etmek için, Flp aracılı rekombinasyon kararlı biçimde INO80 kompleksinin alt-birimleri kodlayan 8-10 FLAG epitopu etiketli cDNA&#39;larını ifade eden transgenik HEK293 hücre soyları meydana getirmek için kullanılır. INO80 alt birimlerinin aşırı ifadesi biraz toksik olduğundan, izole ve seçici kılıfı altında klonal hücre hatları korumak için gerekli olanşulları büyük ölçekli hücre kültürleri genişlemesi için gerekli olan bir çok geçitler boyunca sabit transgen ekspresyonunu sağlamak. Alt birimlerin yalnızca bir alt kümesini içeren küçük INO80 subcomplexes elde etmek için, biz başarılı iki yaklaşım kullanılmıştır (Şekil 2A, B). İlk olarak, belirli bir stably alt birimden 5 ile etkileşim için gereken etki eksikliği Ino80 mutant sürümlerini ifade eden HEK293 Flp olarak hücre hatları oluşturmak. Seçenek olarak ise, siRNA aracılı yok etme, uygun bir FLAG-etiketli INO80 alt birimini (yayınlanmamış veriler) ifade eden hücrelerden istenen alt birimi tüketmek için kullanılır. Son olarak, insan INO80 kompleksleri arıtmak için BAYRAK agaroz kromatografisi göre 11 etkili bir şekilde saflaştırılmış INO80 veya INO80 subcomplexes içeren son fraksiyon sitosolik proteinler kirletici varlığının azaltılması, nükleer ekstreler bir INO80 içeren fraksiyonun zenginleştirmek için kullanılır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax-I (stablized glutamine)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">35050-079</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12176C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FuGENE6 transfection reagent&#160;&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:147px;">E2312</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hygromycin B, sterile in PBS</td>
			<td>AG Scientific</td>
			<td style="width:147px;">H-1012-PBS</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA5/FRT vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V6010-20</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Flp-In HEK293 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">R780-07</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V600520</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZview&#160; Red ANTI-FLAG&#160; M2 Affinity Gel&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F2426</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calf serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12138C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TARGETplus SMARTsiRNA pool</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5x siRNA resuspension buffer&#160;</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">#B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine RNAiMAX&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">13778</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">51985-091</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">45000</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TrypLE (trypsin)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">12604</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x FLAG Peptide</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3290</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Bio-Spin Chromatography Column</td>
			<td style="width:212px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:147px;">737-5021</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)</td>
			<td style="width:212px;">Amicon</td>
			<td style="width:147px;">UFC805024&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Desalting Columns&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">89882</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, mouse</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3165</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, rabbit</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F7425</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">P8340</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzonase&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td style="width:147px;">70664</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Equipment</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wheaton Dounce Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td style="width:147px;">06-435C&#160;</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339080</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-17 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">369691</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml polycarbonate tubes&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355630</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 ml polycarbonate bottles&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355655</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339160</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 70.1 Ti rotor&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">342184</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Clay Adams Nutator Mixer</td>
			<td style="width:212px;">BD Diagnostics</td>
			<td style="width:147px;">15172-203&#160;</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glas-Col Tube/Vial Rotator</td>
			<td style="width:212px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:147px;">099A RD4512</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermal cycler PTC 200</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td style="width:147px;">PTC 200</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">roller bottle incubator</td>
			<td style="width:212px;">Bellco biotechnology</td>
			<td style="width:147px;">353348</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td>
			<td style="width:212px;">Millipore</td>
			<td style="width:147px;">IPFL07810</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">3207</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and purification of human ino80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes

INO80 kromatin remodeling kompleksleri ATP-bağımlı nucleosome biçimlenme katalize ederek nucleosome dinamikleri ve DNA erişilebilirlik düzenler. İnsan INO80 kompleksleri Ino80, katalitik alt birim ve oluşan komplekslerin montajı için yapı iskelesi olarak hizmet, çok SnF2 gibi ATPaz&#39;ın 14 de dahil olmak üzere protein alt birimlerinin oluşur. Diğer alt birimlerin İşlevleri ve INO80 Kompleksin kromatin remodeling etkinliğine katkıda hangi mekanizmalar kötü nedeniyle insan hücreleri veya heterolog ifade sistemlerinde INO80 altparçadan üretme meydan kısmen anlaşılamamaktadır. Bu protokol, JOVE alt birimi ya da alt üniteler bir alt eksik insan INO80 kromatin yeniden şekillenme subcomplexes saflaştırılmasını sağlayan bir prosedür tarif etmektedir. N-terminal FLAG epitopu Ino80 cDNA, kararlı bir şekilde insan embriyonik böbrek (HEK) Flp aracılı rekombinasyon kullanılarak 293 hücre hatları içine yerleştirilen etiketlendi. INO80 kompleksinin alt-birimden oluşan bir alt grup b olduğu takdirdeE olanların bir alt birimlerinin montajı için gerekli platformu eksikliği yerine mutant Ino80 proteinleri ifade, silindi. Durumunda bağımsız bir alt-birimi tükeneceği için, kararlı bir şekilde ifade eden bir FLAG HEK 293 hücre hattı, bu alt-birimini hedef bir transfects siRNA&#39;lar Ino80 ATPaz etiketlendi. Nüklear özütler hazırlandı edilir ve FLAG immüno Ino80 türevlerini ihtiva eden protein fraksiyonları zenginleştirmek için gerçekleştirilir. Saflaştınldı INO80 subcomplexes bileşimleri daha sonra, immüno-lekeleme, gümüş boyama ve kütle spektrometrisi gibi yöntemler kullanılarak analiz edilebilir. Bu protokole uygun olarak elde edilen ve INO80 INO80 subcomplexes buradan sonra, ekteki JOVE protokolde tarif edildiği çeşitli biyokimyasal tahlilleri kullanılarak analiz edilebilir. Burada açıklanan yöntemler herhangi bir memeli çoklu alt birim kromatin yeniden yapısal ve fonksiyonel özellikleri ve değiştirme çalışmaları kompleksleri için adapte edilebilir.

Şekil 1 oluşturmak arındırmak ve insan INO80 ATP&#39;ye bağımlı kromatin yeniden şekillenme kompleksleri karakterize etmek için kullanılan prosedürleri özetleyen bir akış şemasını göstermektedir. Şekil 2 ve 3&#39;te gösterildiği gibi, bu işlemler böylece INO80 ait enzimatik aktivite için bu alt-birimlerin eksik katkı müteakip biyokimyasal analizler sağlayan çeşitli altbirimleri taşımayan vahşi tip INO80 ve INO...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes at JoVE.com

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Bu protokol oluşturulması ve vahşi tip ve insan INO80 kromatin yeniden şekillenme kompleks mutant versiyon saflaştırılması için bir yöntem tarif etmektedir. Epitop INO80 alt birimlerinin versiyonları kararlı biçimde HEK293 hücrelerinde ifade edilir ve alt birimlerinin kümelerini yoksun tam kompleksleri kompleksleri ve bağışıklık yakınlık kromatografisi ile etiketlenmiş.

Nesil ve İnsan INO80 Kromatin Yaptırma Kompleksleri ve subcomplexes saflaştırılması

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

DNA and Chromosome Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Biyoloji

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm II: İnsan Islets saflaştırılması ve Kültür

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

Farelerde Cajal (ICC) Ağ İnterstisyel Hücreler Görselleştirme

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Manyetik Rezonans Görüntüleme için hazırlanması, Saflaştırılması ve lantanide Kompleksleri Kontrast Ajanlar Kullanım Karakterizasyonu

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Hücre-invaziv DISC1 Protein Türlerinin Üretimi, Saflaştırılması, ve Karakterizasyonu

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

ATP-bağımlı Kromatin Tadilat Enzimler Faaliyetlerinin Analizi için biyokimyasal Tahliller

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...