Name: focus formation: a cell-based assay to determine the oncogenic potential of a gene
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00
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Ce travail a été financé par une subvention du Programme de bourse de nouveau Innovateur du directeur des NIH (ED). AA a été financé en partie par des prix de premier cycle de l&#39;Institut national du cancer et la Fondation nationale des sciences.

1. Faire les vecteurs viraux Les séquences codant pour le gène d&#39;intérêt, ainsi que des contrôles positifs et négatifs, sont insérés dans pBabePuro par des méthodes traditionnelles de clonage (amplification par PCR, digestion par restriction et ligature). Il ya quatre sites de restriction sur le vecteur où l&#39;ADN peut être inséré: BamHI, SnaBI, EcoRI et Sali. <ol><li> Préparer transfection qualité plasmide ADN provenant de cellules compétentes en utilisant le kit de ...

<ol>
	<li>Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+assays+for+Ras+transformation.">Biological assays for Ras transformation.</a> Methods in enzymology. , 255-395 (1995).</li><li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell biology : a laboratory handbook. , 345-352 (2006).</li><li>Raptis, L., Vultur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+transformation+assays.">Neoplastic transformation assays.</a> Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).</li><li>Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. 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P., Land, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+mammalian+gene+transfer:+high+titre+retroviral+vectors+with+multiple+drug+selection+markers+and+a+complementary+helper-free+packaging+cell+line.">Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line.</a> Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. 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J., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-phase-specific+expression+of+the+Mad3+gene+in+proliferating+and+differentiating+cells.">S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells.</a> The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).</li><li>Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+the+Mad+family+member+Mad3+in+cerebellar+granule+neuron+precursor+proliferation.">A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation.</a> Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).</li><li>Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad3+negatively+regulates+B+cell+differentiation+in+the+spleen+by+inducing+Id2+expression.">Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression.</a> Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).</li><li>Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cerebellar+proliferation+to+tumorigenesis:+new+insights+into+the+role+of+Mad3.">From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3.</a> Cell cycle. 7, 423-427 (2008).</li><li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells.">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508 (2012).</li><li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors.">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112, 193-205 (2003).</li></ol>

La FFA fournit une méthode rapide et facile pour évaluer la transformation maligne in vitro. Il se prête à la projection d&#39;un nombre relativement important de gènes candidats, et ses exigences techniques modestes rendre rentable. En outre, deux ou plusieurs gènes peuvent être co-exprimés (parfois appelé un dosage &quot;coopération&quot;) pour évaluer le potentiel tumorigène de la combinaison. Les avantages de ce test se appuient sur sa technique simple, sa facilité de quantification et de sa re...

Les cellules tumorales peuvent être distingués de leurs homologues normales par un large éventail de modifications, de profils d&#39;expression génique pour Epigenomics à des changements morphologiques et proliferatives. Parmi ces derniers, réduction de la dépendance sur le sérum, la perte de contact (densité) l&#39;inhibition, l&#39;acquisition de la prolifération indépendante de l&#39;ancrage et, finalement, la capacité de former des tumeurs lorsqu&#39;elles sont injectées dans les animaux sont des indicateurs utiles, mesurables de transformation maligne 3. Plusieurs in vitro et in vivo ont été développés pour une transformation cellulaire. Les essais in vitro pour but d&#39;identifier et de mesurer des changements dans la morphologie de culture (test de formation de mise au point), la dynamique de culture (taux de croissance, la densité de saturation) et le facteur de croissance (croissance en sérum réduite) ou un mouillage (croissance dans la gélose molle) exigences. La méthode de référence pour la détermination de la nature maligne d&#39;un type de cellule reste la formation de tumeurs (les xénogreffes) chez les animaux expérimentaux. Cependant, til a coûté et la longueur des études in vivo ne font pas toujours les justifier comme une première étape de validation ou de dépistage des oncogènes candidats. Bien qu&#39;aucun essai in vitro fournit une évaluation précise du potentiel oncogène d&#39;un gène, ils ne donnent un aperçu de potentiel oncogène qui peuvent affiner l&#39;avenir des études in vivo. L&#39;un des systèmes les plus utilisés pour l&#39;évaluation du potentiel oncogénique in vitro est la Focus Formation Assay 2. Cette approche repose sur l&#39;utilisation de fibroblastes de souris NIH 3T3, une lignée cellulaire non transformée qui montre une forte inhibition de contact. Surexpression d&#39;un oncogène résultats en perte de croissance dépendante de la densité; les cellules transformées peuvent ensuite se développer dans des couches multiples, formant &quot;foyers&quot;, facilement visualisés contre la monocouche de cellules non transformées fond. La mise au point Formation Assay, puis, mesure la capacité d&#39;un oncogène candidat à induire une transformation maligne, comme le montre la perte de contact inhibition comme un phénotype mesurable. La FFA a été utilisée pour évaluer la transformation par la surexpression de protéines kinases (par exemple Src 4, BRAF 5), des facteurs de transcription (par exemple, N-myc 6) récepteurs, G couplés à la protéine (par exemple, P2RY8 7) et GTPases (par exemple, , Ras 1), entre autres. La relative facilité de ce test, il est un bon choix qui fournira une réponse rapide et visuellement évident de savoir si la surexpression du gène est suffisante pour transformer des cellules de fibroblastes de souris NIH 3T3 in vitro. La FFA décrit dans le présent protocole utilise la lignée cellulaire d&#39;encapsidation Plat-E 8, qui fournit les protéines virales d&#39;emballage, et le vecteur rétroviral 9 pBabePuro (Addgene plasmidique 1764) pour produire des retrovirus. Après la transfection avec la construction d&#39;pBabePuro contenant le gène d&#39;intérêt, la lignée cellulaire Plat-E produira retrovirus écotrope qui peut être utilisé pour infecter des cellules NIH 3T3. Tsa méthode virale de la livraison de gènes est plus efficace que les méthodes de transfection chimique traditionnels et offre un moyen d&#39;exprimer le gène 10 durable. Une fois incorporé dans le génome de cellules NIH 3T3, la surexpression du gène d&#39;intérêt est entraîné par le virus de longues répétitions terminales (LTR), le promoteur 11. Cette expression constante peut être utilisée pour déterminer si le gène d&#39;intérêt a une activité oncogène, tel que mesuré par la formation de foyers sur les cellules NIH 3T3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">pBABE-puro vector</td>
			<td style="width:127px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">Plasmid 1764</td>
			<td style="width:171px;">cloning vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic</td>
			<td style="width:127px;">Cell Biolabs, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">RV-101</td>
			<td>cell line for viral production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">NIH 3T3 Cell Line murine</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">93061524</td>
			<td>cell line for focus formation assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">10 mL BD Luer-Lok tip syringe</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">309604</td>
			<td>viral production reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">0.45 &#956;m Puradisc Syringe Filter</td>
			<td style="width:127px;">Whatman</td>
			<td style="width:123px;">6750-2504</td>
			<td>viral production reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:127px;">Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">23966-2</td>
			<td>cell transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td style="width:127px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:123px;">TR-1003-G</td>
			<td>cell transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">C581-25</td>
			<td>cell stain reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Plasmid Plus Midi Kit</td>
			<td style="width:127px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12945</td>
			<td>plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">BD Falcon Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">353003</td>
			<td>cell culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">11995-065</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">25300-054</td>
			<td>cell culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">31985-062</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focus formation: a cell-based assay to determine the oncogenic potential of a gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

MXD3 est une base hélice-boucle-hélice leucine fermeture à glissière (bHLHZ) facteur de transcription qui est un membre de la MYC / MAX / MAD réseau. Ce est un membre de la famille atypique de MAD 13 à 15, et il a été rapporté d&#39;être impliqués dans la carcinogenèse 16,17. Par rapport à pBabePuro (contrôle négatif) et MYC (contrôle positif), les plats NIH 3T3 où MXD3 a été surexprimé avaient significativement moins foyers (figure 1A). Les données de ...

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Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Concentrez Formation: Un test cellulaire pour déterminer le potentiel oncogène d&#39;un gène

Le dosage Focus Formation fournit une méthode simple pour évaluer le potentiel de transformation d&#39;un oncogène candidat.

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

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