Name: focus formation: a cell-based assay to determine the oncogenic potential of a gene
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da New Innovator Award Program del direttore NIH (ED). AA è stato sostenuto in parte da premi di laurea dal National Cancer Institute e la National Science Foundation.

1. Rendere i vettori virali Le sequenze codificanti per il gene di interesse, così come i controlli positivi e negativi, sono inseriti in pBABEpuro con metodi tradizionali di clonazione (amplificazione PCR, digestione di restrizione e legatura). Ci sono quattro siti di restrizione sul vettore in cui il DNA può essere inserito: BamHI, SnaBI, EcoRI e Sali. <ol><li> Preparare trasfezione-grade plasmide DNA dalle cellule competenti mediante il kit plasmide midi QIAGEN. </li><li> Misurare la ...

<ol>
	<li>Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+assays+for+Ras+transformation.">Biological assays for Ras transformation.</a> Methods in enzymology. , 255-395 (1995).</li><li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell biology : a laboratory handbook. , 345-352 (2006).</li><li>Raptis, L., Vultur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+transformation+assays.">Neoplastic transformation assays.</a> Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).</li><li>Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. 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P., Land, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+mammalian+gene+transfer:+high+titre+retroviral+vectors+with+multiple+drug+selection+markers+and+a+complementary+helper-free+packaging+cell+line.">Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line.</a> Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. 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J., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-phase-specific+expression+of+the+Mad3+gene+in+proliferating+and+differentiating+cells.">S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells.</a> The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).</li><li>Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+the+Mad+family+member+Mad3+in+cerebellar+granule+neuron+precursor+proliferation.">A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation.</a> Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).</li><li>Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad3+negatively+regulates+B+cell+differentiation+in+the+spleen+by+inducing+Id2+expression.">Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression.</a> Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).</li><li>Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cerebellar+proliferation+to+tumorigenesis:+new+insights+into+the+role+of+Mad3.">From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3.</a> Cell cycle. 7, 423-427 (2008).</li><li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells.">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508 (2012).</li><li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors.">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112, 193-205 (2003).</li></ol>

La FFA fornisce un metodo semplice e veloce per valutare trasformazione maligna in vitro. E &#39;suscettibile di proiezione di un numero relativamente elevato di geni candidati, e le sue esigenze tecniche modeste rendono conveniente. Inoltre, due o più geni possono essere coexpressed (talvolta indicato come un saggio &quot;cooperazione&quot;) per valutare il potenziale cancerogeno della combinazione. I vantaggi di questo test si basano sulla sua tecnica semplice, la facilità di quantificazione e la sua relati...

Le cellule tumorali possono essere distinti dalle loro controparti normali da una vasta gamma di alterazioni, dai modelli di espressione genica per epigenomica ai cambiamenti morfologici e proliferativi. Tra questi ultimi, ridotta dipendenza da siero, perdita di contatto (densità) inibizione, l&#39;acquisizione della proliferazione di ancoraggio-indipendente e, in ultima analisi, la capacità di formare tumori quando iniettate in animali sono utili, indicatori misurabili di trasformazione maligna 3. Diversi in vitro e in vivo sono stati sviluppati per la trasformazione cellulare. In vitro mirare a individuare e cambiamenti nella cultura morfologia (attenzione test formazione), la dinamica della cultura (il tasso di crescita, la densità di saturazione) e fattore di crescita di misura (la crescita nel siero ridotta) o ancoraggio (crescita in soft agar) esigenze. Il gold standard per determinare la natura maligna di un tipo di cellula rimane la formazione di tumori (xenotrapianti) negli animali da esperimento. Tuttavia, tl costo e la durata degli studi in vivo non sempre li rendono giustificabile in una prima fase di validazione o proiezione di oncogeni candidati. Anche se nessun test in vitro fornisce una valutazione definitiva del potenziale oncogeno di un gene, essi forniscono informazioni in potenziale oncogeno che potrebbero restringere futuro studi in vivo. Uno dei sistemi più utilizzati per valutare il potenziale oncogeno in vitro è al centro di Formazione Assay 2. Questo approccio si basa sull&#39;uso di NIH 3T3 fibroblasti di topo, una linea cellulare non trasformato che mostra forte inibizione contatto. Sovraespressione di un oncogene si traduce in perdita di crescita di densità-dipendente; cellule trasformate possono crescere in strati multipli, formando &quot;fuochi&quot;, facilmente visualizzato sullo sfondo monostrato di cellule non trasformate. La formazione fuoco Assay, poi, misura la capacità di un oncogene candidato per indurre la trasformazione maligna, come dimostra la perdita di contatto inibition come un fenotipo misurabile. L&#39;FFA è stato utilizzato per valutare la trasformazione da sovraespressione di proteine ​​chinasi (ad esempio, Src 4, BRAF 5), fattori di trascrizione (ad esempio, N-myc 6) recettori, G-accoppiati alle proteine ​​(ad esempio, P2RY8 7) e GTPases (ad esempio, , Ras 1), tra gli altri. La relativa facilità di questo saggio rende una buona scelta che fornirà una risposta rapida e visivamente chiaro se sovraespressione del gene è sufficiente per trasformare cellule di fibroblasti di topo NIH 3T3 in vitro. L&#39;FFA descritto in questo protocollo utilizza la linea cellulare di confezionamento Plat-E 8, che fornisce proteine ​​virali di imballaggio, e il vettore retrovirale pBABEpuro 9 (Addgene plasmide 1764) per la produzione di retrovirus. Dopo trasfezione con il costrutto pBABEpuro contenente il gene di interesse, la linea cellulare Plat-E produrrà retrovirus ecotropic che può essere utilizzato per infettare cellule NIH 3T3. Til suo metodo virale di consegna del gene è più efficiente rispetto ai metodi di trasfezione chimici tradizionali e offre un modo per esprimere in modo sostenibile il gene 10. Una volta inseriti nel genoma delle cellule NIH 3T3, sovraespressione del gene di interesse è guidato dalla lunghe ripetizioni terminali virali (LTR) promotore 11. Questa costante espressione può essere usato per determinare se il gene di interesse ha attività oncogenica, come misurato dalla formazione di foci, sulle cellule NIH 3T3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">pBABE-puro vector</td>
			<td style="width:127px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">Plasmid 1764</td>
			<td style="width:171px;">cloning vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic</td>
			<td style="width:127px;">Cell Biolabs, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">RV-101</td>
			<td>cell line for viral production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">NIH 3T3 Cell Line murine</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">93061524</td>
			<td>cell line for focus formation assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">10 mL BD Luer-Lok tip syringe</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">309604</td>
			<td>viral production reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">0.45 &#956;m Puradisc Syringe Filter</td>
			<td style="width:127px;">Whatman</td>
			<td style="width:123px;">6750-2504</td>
			<td>viral production reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:127px;">Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">23966-2</td>
			<td>cell transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td style="width:127px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:123px;">TR-1003-G</td>
			<td>cell transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">C581-25</td>
			<td>cell stain reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Plasmid Plus Midi Kit</td>
			<td style="width:127px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12945</td>
			<td>plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">BD Falcon Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">353003</td>
			<td>cell culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">11995-065</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">25300-054</td>
			<td>cell culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">31985-062</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focus formation: a cell-based assay to determine the oncogenic potential of a gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

MXD3 è un fattore fondamentale cerniera elica-ansa-elica leucina (bHLHZ) di trascrizione che è un membro del MYC / MAX / network MAD. Si tratta di un atipico membro della famiglia MAD 13-15, ed è stato segnalato per essere coinvolti nella carcinogenesi 16,17. Rispetto al pBABEpuro (controllo negativo) e MYC (controllo positivo), i piatti NIH 3T3 dove era sovraespresso MXD3 era significativamente inferiore foci (Figura 1A). I dati della figura 1B sono stati racco...

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Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Concentrarsi Formazione: Un test cellulare per determinare il potenziale oncogeno di un gene

Il saggio Formazione Focus fornisce un metodo semplice per valutare il potenziale di trasformare un oncogene candidato.

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

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