Name: focus formation: a cell-based assay to determine the oncogenic potential of a gene
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00
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この作品は、NIHのディレクターの新イノベーター賞プログラム（ED）からの助成金によってサポートされていました。 AAは国立がん研究所、国立科学財団からの学部賞によって部分的にサポートされていました。

1.ウイルスベクターを作る目的の遺伝子、ならびに陽性および陰性対照のためのコード配列は、従来のクローニング法（PCR増幅、制限消化およびライゲーション）によってpBABEpuroに挿入される。 BamHIでSnaBIで、EcoRIおよびSalIで：DNAを挿入することができるベクター上の4つの制限部位がある。 <ol><li> QIAGENプラスミドミディキットを使用してコンピテント細胞からトランス...

<ol>
	<li>Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+assays+for+Ras+transformation.">Biological assays for Ras transformation.</a> Methods in enzymology. , 255-395 (1995).</li><li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell biology : a laboratory handbook. , 345-352 (2006).</li><li>Raptis, L., Vultur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+transformation+assays.">Neoplastic transformation assays.</a> Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).</li><li>Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpressed+pp60c-src+can+induce+focus+formation+without+complete+transformation+of+NIH+3T3+cells.">Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells.</a> Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).</li><li>Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+biological+activity+of+human+homologs+of+the+raf/mil+oncogene.">Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene.</a> IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).</li><li>Yancopoulos, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-myc+can+cooperate+with+ras+to+transform+normal+cells+in+culture.">N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).</li><li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+activity+of+purinergic+receptor+P2Y,+G+protein+coupled,+8+revealed+by+retroviral+expression+screening.">Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening.</a> Leukemia &amp; lymphoma. 48, 978-986 (2007).</li><li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plat-E:+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses.">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene. 7, 1063-1066 (2000).</li><li>Morgenstern, J. P., Land, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+mammalian+gene+transfer:+high+titre+retroviral+vectors+with+multiple+drug+selection+markers+and+a+complementary+helper-free+packaging+cell+line.">Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line.</a> Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. 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J., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-phase-specific+expression+of+the+Mad3+gene+in+proliferating+and+differentiating+cells.">S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells.</a> The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).</li><li>Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+the+Mad+family+member+Mad3+in+cerebellar+granule+neuron+precursor+proliferation.">A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation.</a> Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).</li><li>Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad3+negatively+regulates+B+cell+differentiation+in+the+spleen+by+inducing+Id2+expression.">Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression.</a> Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).</li><li>Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cerebellar+proliferation+to+tumorigenesis:+new+insights+into+the+role+of+Mad3.">From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3.</a> Cell cycle. 7, 423-427 (2008).</li><li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells.">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508 (2012).</li><li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors.">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112, 193-205 (2003).</li></ol>

FFAは、in vitroでの悪性形質転換を評価するための迅速かつ容易な方法を提供する。これは、候補遺伝子の比較的多数のスクリーニングに適用され、その控えめな技術的要件は、費用対効果を高める。さらに、2つ以上の遺伝子を共発現させることができる組み合わせの腫瘍形成能を評価するために（時には「協力」アッセイと呼ばれる）。このアッセイの利点は、その単純な手法、定量...

腫瘍細胞は、遺伝子発現のパターンの形態学的および増殖性の変化にエピゲノミクスに、変化の広い範囲によってそれらの正常な対応物と区別することができる。後者の中では、、、接触の損失（密度）阻害を血清への依存を軽減足場非依存性増殖の取得と、最終的には、動物に注射した場合に腫瘍を形成する能力は、悪性形質転換3の有効、測定可能な指標である。 in vitroおよびin vivoアッセイにおけるいくつかの細胞の形質転換のために開発されてきた。 インビトロアッセイは、（成長速度、飽和密度）及び増殖因子（低血清成長）、培養形態（フォーカス形成アッセイ）の変化を識別し、測定時に培養ダイナミクスを目指すまたは要件アンカレッジ（ソフトアガーでの成長）。細胞型の悪性の性質を決定するためのゴールドスタンダードは、実験動物における腫瘍形成（異種移​​植片）のままである。しかし、T彼は、コストとのインビボ研究の長さは、常に候補癌遺伝子の最初の検証ステップまたはスクリーニング、それらに正当ことはありません。何のin vitroアッセイは、遺伝子の発癌性の明確な評価を提供していないが、これらは、生体内の研究で未来を絞り込むことが発癌性への洞察を提供します。 インビトロでの発癌性を評価するための最も広く使用されているシステムの一つはフォーカス形成アッセイ2である。このアプローチは、NIH 3T3マウス線維芽細胞、強く接触阻害を示し、非形質転換細胞株の使用に依存している。密度依存性増殖の損失の癌遺伝子の過剰発現。形質転換された細胞は、次に簡単に非形質転換細胞のバックグラウンド単層に対して可視化「病巣」を形成する、複数の層で成長することができる。フォーカス形成アッセイは、その後、コンタクトInhibが喪失によって証明されるように、悪性形質転換を誘導する候補癌遺伝子の能力を測定する測定可能な表現型としてition。 FFAは、プロテインキナーゼ（ 例えば 、Srcの4、BRAF 5）の過剰発現により形質転換を評価するために使用されている、転写因子（ 例えば 、N-mycの6）、Gタンパク質共役受容体（ 例えば 、P2RY8 7）およびGTPアーゼ（ 例えばとりわけラス1）。このアッセイの相対的な容易さは、遺伝子の過剰発現は、インビトロで NIH 3T3マウス線維芽細胞を形質転換するのに十分であるか否かを迅速かつ視覚的に明確な答えを提供する適切な選択肢となる。 FFAは、このプロトコルに記載のレトロウイルスを産生するウイルスパッケージングタンパク質を提供するのPlat-Eパッケージング細胞株8、およびレトロウイルスベクターpBABEpuro 9（Addgeneプラスミド1764）を使用する。目的の遺伝子を含むpBABEpuro構築物でトランスフェクションした後、のPlat-E細胞株は、NIH 3T3細胞を感染させるために使用することができるエコトロピックレトロウイルスを産生する。 T遺伝子送達の彼のウイルスの方法は、従来の化学的なトランスフェクション法よりも効率的であり、それは持続的に遺伝子10を表現する方法を提供しています。 NIH 3T3細胞のゲノムに組み込まれると、目的の遺伝子の過剰発現は、ウイルスの長い末端反復（LTR）プロモーター11によって駆動される。この定数式は、NIH 3T3細胞に、病巣の形成によって測定されるように、目的の遺伝子は、発癌活性を有するかどうかを決定するために使用することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">pBABE-puro vector</td>
			<td style="width:127px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">Plasmid 1764</td>
			<td style="width:171px;">cloning vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic</td>
			<td style="width:127px;">Cell Biolabs, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">RV-101</td>
			<td>cell line for viral production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">NIH 3T3 Cell Line murine</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">93061524</td>
			<td>cell line for focus formation assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">10 mL BD Luer-Lok tip syringe</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">309604</td>
			<td>viral production reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">0.45 &#956;m Puradisc Syringe Filter</td>
			<td style="width:127px;">Whatman</td>
			<td style="width:123px;">6750-2504</td>
			<td>viral production reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:127px;">Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">23966-2</td>
			<td>cell transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td style="width:127px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:123px;">TR-1003-G</td>
			<td>cell transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">C581-25</td>
			<td>cell stain reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Plasmid Plus Midi Kit</td>
			<td style="width:127px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12945</td>
			<td>plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">BD Falcon Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">353003</td>
			<td>cell culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">11995-065</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">25300-054</td>
			<td>cell culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">31985-062</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focus formation: a cell-based assay to determine the oncogenic potential of a gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

MXD3は、MYC / MAX / MADネットワークのメンバーである塩基性ヘリックス - ループ - ヘリックスロイシンジッパー（bHLHZ）転写因子である。それは、MADファミリー13-15の異型メンバーであり、発癌16,17に関与することが報告されている。 pBABEpuro（陰性対照）およびMYC（陽性対照）と比較した場合、MXD3を過剰発現させたNIH 3T3料理が著しく少ない病巣（ 図1A）を有してい?...

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Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

フォーカス形成：細胞ベースのアッセイ遺伝子の発癌性を決定するために、

フォーカス形成アッセイは、候補癌遺伝子の形質転換能を評価するための簡単​​な方法を提供する。

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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PTSDの、ニューラル血液学的および行動的相関関係を明らかにするための動物モデルにおけるバイオマーカー

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

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胎児のマウスモデルにおける生物活性剤の気管内投与のための新しい手術アプローチ

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

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Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

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変更された<em&gt;インビトロ</em媒介する癌細胞浸潤におけるホルモン、サイトカインおよび/または成長因子の潜在的な役割を決定するために&gt;浸潤アッセイ

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Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

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Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

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ヒトの血液脳脊髄液関門の脈絡叢上皮細胞ベースのモデルは、基底外側からの細菌感染症を研究するために、

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