Name: focus formation: a cell-based assay to determine the oncogenic potential of a gene
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00
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이 작품은 NIH 감독의 새로운 혁신 상 프로그램 (ED)에서 부여에 의해 지원되었다. AA는 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)와 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 학부 상에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. 바이러스 성 벡터를 만들기 목적 유전자뿐만 아니라, 양성 및 음성 대조군에 대한 코딩 서열은, 전통적인 클로닝 방법 (PCR 증폭, 제한 효소 및 라이 게이션)에 의하여 pBABEpuro 삽입된다. BamHI로, SnaBI로, EcoRI 및 SalI로 : DNA가 삽입 될 수있다 벡터 네 개의 제한 부위가있다. <ol><li> QIAGEN 플라스미드 미디 키트를 사용하여 유능한 세포에서 형질 급 플라스미드 DNA를 준비합니다. </...

<ol>
	<li>Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+assays+for+Ras+transformation.">Biological assays for Ras transformation.</a> Methods in enzymology. , 255-395 (1995).</li><li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell biology : a laboratory handbook. , 345-352 (2006).</li><li>Raptis, L., Vultur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+transformation+assays.">Neoplastic transformation assays.</a> Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).</li><li>Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. 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P., Land, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+mammalian+gene+transfer:+high+titre+retroviral+vectors+with+multiple+drug+selection+markers+and+a+complementary+helper-free+packaging+cell+line.">Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line.</a> Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. 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J., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-phase-specific+expression+of+the+Mad3+gene+in+proliferating+and+differentiating+cells.">S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells.</a> The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).</li><li>Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+the+Mad+family+member+Mad3+in+cerebellar+granule+neuron+precursor+proliferation.">A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation.</a> Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).</li><li>Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad3+negatively+regulates+B+cell+differentiation+in+the+spleen+by+inducing+Id2+expression.">Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression.</a> Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).</li><li>Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cerebellar+proliferation+to+tumorigenesis:+new+insights+into+the+role+of+Mad3.">From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3.</a> Cell cycle. 7, 423-427 (2008).</li><li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells.">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508 (2012).</li><li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors.">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112, 193-205 (2003).</li></ol>

FFA는 체외에서 악성 변화를 평가하기위한 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다. 이는 후보 유전자의 상대적으로 큰 수의 검사 의무이며, 그 완만 한 기술적 요구는 비용 효율적인 만든다. 또한, 두 개 이상의 유전자를 공 발현 할 수있다 조합 발암 잠재력을 평가하는 (때때로 &quot;협동&quot;분석법이라 함). 이 분석의 장점은 간단 기술, 정량의 용이성과 상대적으로 짧은 턴어라운드 시간에 의존하...

종양 세포 유전자 발현의 패턴에서 증식 및 형태 학적 변화 후성 유전학에, 변경의 폭 넓은 정상 대조 구별 될 수있다. 후자 중에서, 궁극적으로 동물에 주입시 종양을 형성하는 능력은 악성화 (3)의 유용한 측정 지표 인 혈청에 의존하여, 접점 (밀도) 억제의 상실, 앵커리지 - 독립된 확산 인수를 감소. 생체 외 및 생체 내 분석 몇몇 셀룰러 변환을 위해 개발되었다. 시험 관내 분석법을 목표 (환원 혈청 성장)을 식별하고 배양 모폴로지 (초점 형성 어 세이), 문화 역학 (성장 속도, 포화 농도) 및 성장 인자의 변화가 측정 또는 요구 사항 앵커리지 (소프트 한천의 성장). 세포 유형의 악성 특성을 결정하기위한 금 표준 실험 동물에서 종양 형성 (이종) 남아있다. 그러나, t그는 비용 및 생체 내 연구의 길이는 항상 후보 종양 유전자의 첫 번째 검증 단계 또는 스크리닝 그들을 정당화하지 않습니다. 어떤 시험 관내 분석은 유전자의 발암 가능성의 명확한 평가를 제공하지 않지만, 그들은 생체 내 (in vivo) 연구가 미래를 좁힐 수 발암 가능성에 대한 통찰력을 제공 않습니다. 시험관 내에서 종양 발생 가능성을 평가하기위한 가장 널리 사용되는 시스템 중 하나는 초점 형성 분석법이있다. 이 접근법은 NIH 3T3 마우스 섬유 모세포, 강한 접촉 억제를 나타내고 형질 전환되지 않은 세포주의 사용에 의존한다. 밀도에 의존하는 성장의 손실 종양 유전자 결과의 과발현; 형질 전환 된 세포를 용이하게 형질 전환되지 않은 세포의 배경에 대해 단층 가시화 &quot;초점&quot;을 형성하는, 다층으로 성장할 수있다. 접점의 ON 인 손실에 의해 입증되는 바와 같이 포커스 정량법 형성 후, 악성 변환을 유도하는 후보의 종양 유전자 능력을 측정측정 표현형으로 ition. FFA (예를 들면, Src에 4 BRAF 5) 단백질 키나제의 과발현, 전사 인자 (예, N-myc의 6) (예 P2RY8 7), G는 단백질 - 결합 수용체와 GTP 아제 (예에 의해 변형을 평가하기 위해 사용되어왔다 , 라스 1), 다른 사람의 사이에서. 이 분석의 상대적 용이성은 유전자의 과발현은 체외에서 NIH 3T3 마우스 섬유 아세포를 변환 할만큼 충분한 지 여부에 대한 신속하고 시각적으로 명확한 답을 제공 할 것입니다 좋은 선택입니다. 이 프로토콜에서 설명 FFA 패키징 바이러스 단백질을 제공 Plat의 E-패키징 세포주 (8)를 사용하고, 레트로 바이러스 벡터 pBABEpuro 9 (Addgene 플라스미드 1764)는 레트로 바이러스를 생성한다. 관심의 유전자를 포함하는 구조체 pBABEpuro 형질 감염 후, E-Plat의 세포주는 NIH 3T3 세포를 감염시키기 위해 사용될 수 ecotropic 레트로 바이러스를 생성 할 것이다. 티유전자 전달에있어서의 그의 바이러스 전통적인 화학적 형질 전환 방법보다 더 효율적이며 지속적으로 10 유전자를 발현 할 수있는 방법을 제공한다. 일단 NIH 3T3 세포의 게놈 내로 혼입, 목적 유전자의 과발현은 바이러스 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터 (11)에 의해 구동된다. 이 상수는 식 NIH 3T3 세포상의 초점의 형성에 의해 측정 된 관심 유전자, 종양 활성을 가지고 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">pBABE-puro vector</td>
			<td style="width:127px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">Plasmid 1764</td>
			<td style="width:171px;">cloning vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic</td>
			<td style="width:127px;">Cell Biolabs, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">RV-101</td>
			<td>cell line for viral production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">NIH 3T3 Cell Line murine</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">93061524</td>
			<td>cell line for focus formation assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">10 mL BD Luer-Lok tip syringe</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">309604</td>
			<td>viral production reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">0.45 &#956;m Puradisc Syringe Filter</td>
			<td style="width:127px;">Whatman</td>
			<td style="width:123px;">6750-2504</td>
			<td>viral production reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:127px;">Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">23966-2</td>
			<td>cell transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td style="width:127px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:123px;">TR-1003-G</td>
			<td>cell transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">C581-25</td>
			<td>cell stain reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Plasmid Plus Midi Kit</td>
			<td style="width:127px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12945</td>
			<td>plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">BD Falcon Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">353003</td>
			<td>cell culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">11995-065</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">25300-054</td>
			<td>cell culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">31985-062</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focus formation: a cell-based assay to determine the oncogenic potential of a gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

MXD3는 MYC / MAX / MAD 네트워크의 구성원 인 염기성 헬릭스 - 루프 - 헬릭스 류신 지퍼 (bHLHZ) 전사 인자이다. 그것은 MAD 가족 13-15의 비정형 부재이며, 그것은 암화 (16, 17)에 관여하는 것으로보고되었다. pBABEpuro (대조군)과 MYC (양성 대조군)과 비교했을 때, MXD3가 과발현 된 NIH 3T3 요리는 훨씬 적은 초점 (그림 1A)를했다. 도 1b의 데이터는 중요성을 결정하기 위해 여러 실험으?...

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Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

형성 초점 : 세포 기반 분석은 유전자의 발암 성 가능성을 파악하기 위해

초점 형성의 분석은 후보 종양 유전자의 변화 가능성을 평가하기위한 간단한 방법을 제공한다.

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

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