Name: focus formation: a cell-based assay to determine the oncogenic potential of a gene
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00
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Este trabalho foi financiado por uma bolsa da New Innovator Award Program Director do NIH (ED). AA foi apoiado em parte por prêmios de graduação do Instituto Nacional do Câncer e da Fundação Nacional de Ciência.

1. Fazer os vetores virais As sequências de codificação para o gene de interesse, bem como os controlos positivos e negativos, são inseridos em pBABEpuro por métodos tradicionais de clonagem (amplificação por PCR, digestão de restrição e de ligação). Existem quatro locais de restrição no vector em que o DNA pode ser inserido: BamHI, SnaBI, EcoRI e Sall. <ol><li> Prepare plasmídeo DNA transfecção-grade a partir de células competentes, segundo o kit plasmídeo midi QIAGEN. ...

<ol>
	<li>Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+assays+for+Ras+transformation.">Biological assays for Ras transformation.</a> Methods in enzymology. , 255-395 (1995).</li><li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell biology : a laboratory handbook. , 345-352 (2006).</li><li>Raptis, L., Vultur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+transformation+assays.">Neoplastic transformation assays.</a> Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).</li><li>Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. 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M., Ishimaru, T., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+the+Mad+family+member+Mad3+in+cerebellar+granule+neuron+precursor+proliferation.">A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation.</a> Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).</li><li>Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad3+negatively+regulates+B+cell+differentiation+in+the+spleen+by+inducing+Id2+expression.">Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression.</a> Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).</li><li>Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cerebellar+proliferation+to+tumorigenesis:+new+insights+into+the+role+of+Mad3.">From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3.</a> Cell cycle. 7, 423-427 (2008).</li><li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells.">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508 (2012).</li><li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors.">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112, 193-205 (2003).</li></ol>

A FFA fornece um método rápido e fácil de avaliar a transformação maligna in vitro. É passível de exibição de um número relativamente grande de genes candidatos e seus requisitos técnicos modestos torná-lo rentável. Além disso, dois ou mais genes pode ser co-expressa (por vezes referido como um ensaio de &quot;cooperação&quot;) para avaliar o potencial tumorigénico de combinação. As vantagens deste ensaio contar com a sua técnica simples, a sua facilidade de quantificação e a sua relativam...

As células tumorais podem ser distinguidos dos seus homólogos normais por uma ampla gama de alterações, a partir de padrões de expressão de genes para epigenomics a alterações morfológicas e proliferativas. Entre estes últimos, redução da dependência do soro, a perda de contacto (densidade) de inibição, a aquisição de proliferação independente de ancoragem e, em última análise, a capacidade de formar tumores quando injectadas em animais são indicadores úteis, mensuráveis ​​de transformação maligna 3. Vários in vitro e em ensaios in vivo têm sido desenvolvidos para a transformação celular. Os ensaios in vitro por objectivo a identificação e medindo alterações na morfologia da cultura (ensaio de formação de foco), dinâmica de cultura (taxa de crescimento, a densidade de saturação) e o factor de crescimento (crescimento em soro reduzido) ou ancoradouro (crescimento em agar mole) requisitos. O padrão de ouro para a determinação do carácter maligno de um tipo de célula permanece a formação de tumores (xenoenxertos) em animais experimentais. No entanto, tele custa e comprimento de estudos in vivo nem sempre fazê-los justificável como uma primeira etapa de validação ou screening de oncogenes candidatos. Embora nenhum ensaio in vitro fornece uma avaliação definitiva do potencial oncogénico de um gene, que não fornecem informações sobre potencial oncogénico que pode afinar futuro em estudos in vivo. Um dos sistemas mais utilizados para a avaliação do potencial oncogênico in vitro é o foco Formação Ensaio 2. Esta abordagem baseia-se na utilização de NIH 3T3 de fibroblastos de rato, uma linha de células não transformadas que mostram forte inibição de contacto. A sobre-expressão de um oncogene resulta em perda do crescimento dependente de densidade; As células transformadas podem então crescer em múltiplas camadas, formando &quot;focos&quot;, facilmente visualizado contra a monocamada de células não transformadas fundo. O Ensaio de formação de focos, em seguida, mede a capacidade de um oncogene candidato para induzir a transformação maligna, como evidenciado pela perda de contacto Inibiç como um fenótipo mensurável. O FFA tem sido utilizado para avaliar a sobre-expressão por transformação de proteína-quinases (por exemplo, Src 4, 5 BRAF), factores de transcrição (por exemplo, N-myc 6) receptores, L-acoplados à proteína (por exemplo, P2RY8 7) e GTPases (p.ex. , Ras 1), entre outros. A relativa facilidade deste ensaio faz-se uma boa escolha que vai proporcionar uma resposta rápida e visualmente claro para se sobre-expressão do gene é suficiente para transformar células de fibroblastos NIH 3T3 de rato in vitro. O FFA descrito neste protocolo utiliza a linha celular de empacotamento Plat-E 8, o qual fornece as proteínas virais de empacotamento, e o vector retroviral pBABEpuro 9 (Addgene plasmídeo 1764) para a produção de retrovírus. Após transfecção com a construção pBABEpuro contendo o gene de interesse, a linha celular Plat-E vai produzir retrovírus ecotrópico que pode ser utilizado para infectar as células NIH 3T3. Tseu método de entrega gene viral é mais eficiente do que os métodos de transfecção química tradicionais e oferece uma maneira de expressar de forma sustentável o gene 10. Uma vez incorporado no genoma das células NIH 3T3, a sobre-expressão do gene de interesse é impulsionado pelo repetições terminais longas virais (LTR) 11. Esta expressão constante pode ser usado para determinar se o gene de interesse tem actividade oncogénica, tal como medido pela formação de focos, sobre as células NIH 3T3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">pBABE-puro vector</td>
			<td style="width:127px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">Plasmid 1764</td>
			<td style="width:171px;">cloning vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic</td>
			<td style="width:127px;">Cell Biolabs, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">RV-101</td>
			<td>cell line for viral production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">NIH 3T3 Cell Line murine</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">93061524</td>
			<td>cell line for focus formation assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">10 mL BD Luer-Lok tip syringe</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">309604</td>
			<td>viral production reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">0.45 &#956;m Puradisc Syringe Filter</td>
			<td style="width:127px;">Whatman</td>
			<td style="width:123px;">6750-2504</td>
			<td>viral production reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:127px;">Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">23966-2</td>
			<td>cell transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td style="width:127px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:123px;">TR-1003-G</td>
			<td>cell transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">C581-25</td>
			<td>cell stain reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Plasmid Plus Midi Kit</td>
			<td style="width:127px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12945</td>
			<td>plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">BD Falcon Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">353003</td>
			<td>cell culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">11995-065</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">25300-054</td>
			<td>cell culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">31985-062</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focus formation: a cell-based assay to determine the oncogenic potential of a gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

MXD3 é um fator fundamental zipper hélice-alça-hélice leucina (bHLHZ) de transcrição que é um membro da MYC / MAX / network MAD. Ele é um membro da família atípica MAD 13-15, e tem sido referida como estando envolvida na carcinogénese 16,17. Quando comparado com pBABEpuro (controlo negativo) e MYC (controlo positivo), os pratos de NIH 3T3 que sobre-expressas foi MXD3 tinham significativamente menos focos (Figura 1A). Os dados na Figura 1B foram recolhido...

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Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Concentre Formação: Um Ensaio Celular para Determinar o Potencial oncogénica de um Gene

O ensaio de formao de foco fornece um método simples para avaliar o potencial de transformação de um oncogene candidato.

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Research

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Medicine

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