Name: focus formation: a cell-based assay to determine the oncogenic potential of a gene
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом из Нью-Новатор программы по присуждению директора NIH (ЭД). АА частично поддержана студентов награды от Национального института рака и Национального научного фонда.

1. Создание вирусных векторов Кодирующие последовательности для интересующего гена, а также положительных и отрицательных контролей, которые вставлены в pBABEpuro традиционными методами клонирования (ПЦР-амплификации, ограничение и лигирования). Существуют четыре сайты ре?...

<ol>
	<li>Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+assays+for+Ras+transformation.">Biological assays for Ras transformation.</a> Methods in enzymology. , 255-395 (1995).</li><li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell biology : a laboratory handbook. , 345-352 (2006).</li><li>Raptis, L., Vultur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+transformation+assays.">Neoplastic transformation assays.</a> Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).</li><li>Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpressed+pp60c-src+can+induce+focus+formation+without+complete+transformation+of+NIH+3T3+cells.">Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells.</a> Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).</li><li>Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+biological+activity+of+human+homologs+of+the+raf/mil+oncogene.">Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene.</a> IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).</li><li>Yancopoulos, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-myc+can+cooperate+with+ras+to+transform+normal+cells+in+culture.">N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).</li><li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+activity+of+purinergic+receptor+P2Y,+G+protein+coupled,+8+revealed+by+retroviral+expression+screening.">Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening.</a> Leukemia &amp; lymphoma. 48, 978-986 (2007).</li><li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plat-E:+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses.">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene. 7, 1063-1066 (2000).</li><li>Morgenstern, J. P., Land, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+mammalian+gene+transfer:+high+titre+retroviral+vectors+with+multiple+drug+selection+markers+and+a+complementary+helper-free+packaging+cell+line.">Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line.</a> Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).</li><li>Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+5'+and+3'+long+terminal+repeat+promoter+function+in+human+immunodeficiency+virus.">Comparison of 5' and 3' long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus.</a> Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).</li><li>Fukumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+gene+transfection+by+DNA+compaction+at+pH+4.0+using+acidified,+long+shelf-life+polyethylenimine.">Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine.</a> Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).</li><li>Fox, E. J., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-phase-specific+expression+of+the+Mad3+gene+in+proliferating+and+differentiating+cells.">S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells.</a> The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).</li><li>Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+the+Mad+family+member+Mad3+in+cerebellar+granule+neuron+precursor+proliferation.">A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation.</a> Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).</li><li>Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad3+negatively+regulates+B+cell+differentiation+in+the+spleen+by+inducing+Id2+expression.">Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression.</a> Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).</li><li>Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cerebellar+proliferation+to+tumorigenesis:+new+insights+into+the+role+of+Mad3.">From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3.</a> Cell cycle. 7, 423-427 (2008).</li><li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells.">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508 (2012).</li><li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors.">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112, 193-205 (2003).</li></ol>

FFA обеспечивает быстрый и простой способ оценить злокачественной трансформации в пробирке. Это поддается скрининга относительно большого количества генов-кандидатов, и его скромные технические требования делают рентабельным. Кроме того, два или более генов может быть совместно?...

Опухолевые клетки можно отличить от их нормальных аналогов широким диапазоном изменений, из форм генной экспрессии в Epigenomics в морфологических и пролиферативных изменений. Среди последних, уменьшение зависимости от сыворотки, потеря контакта (плотности) торможения, приобретение крепления независимой пролиферации и, в конечном счете, способность образовывать опухоли при введении животным полезны, измеримые показатели злокачественной трансформации 3. Несколько в пробирке и в естественных условиях анализов были разработаны для трансформации клеток. В пробирке анализы направлены на выявление и измерение изменений в области культуры морфологии (образование анализа фокус), динамики культуры (темп роста, плотность насыщения) и фактор роста (рост в восстановленной сыворотки) или якорь (рост на мягком агаре) требованиям. Золотой стандарт для определения злокачественной природы клеток определенного типа, остается формирование опухоли (ксенотрансплантаты) у экспериментальных животных. Тем не менее, тон стоит и продолжительность обучения в естественных условиях не всегда делают их оправдано в качестве первого этапа проверки или досмотра кандидатов онкогенов. Хотя ни анализ в пробирке не дает определенную оценку онкогенного потенциала гена, они дают полное представление онкогенного потенциала, который может сузить будущее в естественных условиях исследования. Одним из наиболее широко используемых систем для оценки онкогенного потенциала в пробирке находится в центре внимания Формирование Анализ 2. Этот подход основан на использовании NIH-3T3 мыши фибробластов, не-трансформированной клеточной линии, которая показывает сильное ингибирование контактной. Избыточная экспрессия онкогенов приводит к потере плотности в зависимости от роста; Трансформированные клетки можно затем растут в несколько слоев, образующих &quot;очаги&quot;, легко визуализировать на фоне монослоя нетрансформированных клеток. Фокус Формирование Анализ, то, измеряет способность кандидата онкоген, чтобы вызвать злокачественную трансформацию, о чем свидетельствует потеря контакта Inhibition как измеримое фенотипа. FFA был использован для оценки трансформации сверхэкспрессией протеинкиназ (например, Src 4, 5 BRAF), факторы транскрипции (например, N-Myc 6), G-белками рецепторы (например, P2RY8 7) и GTPases (например, Рас 1), среди прочих. Относительная простота этого теста делает его хорошим выбором, который обеспечит быстрый и визуально четкий ответ на ли избыточная экспрессия гена достаточно, чтобы превратить NIH 3T3 фибробластов мышей клетки в пробирке. FFA описано в данном протоколе используется Plat-E упаковка клеточную линию 8, который обеспечивает вирусные белки упаковки и ретровирусный вектор pBABEpuro 9 (Addgene плазмиду 1764), чтобы произвести ретровирус. После трансфекции с pBABEpuro конструкции, содержащей нужный ген, клеточная линия Plat-E будет производить экотропного ретровируса, который может быть использован для инфицирования клеток NIH-3T3. Tвирусная способ доставки генов является более эффективным, чем традиционные методы химической трансфекции и предлагает способ устойчиво экспрессировать ген 10. После того, как включается в геном клеток NIH-3T3, избыточная экспрессия интересующего гена приводится в действие вирусных длинные концевые повторы (LTR), промотор 11. Эта константа выражение может быть использовано для определения того, имеет ли интерес ген онкогенного активности, измеренной с образованием очагов на клетках NIH-3T3.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">pBABE-puro vector</td>
			<td style="width:127px;">Addgene</td>
			<td style="width:123px;">Plasmid 1764</td>
			<td style="width:171px;">cloning vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic</td>
			<td style="width:127px;">Cell Biolabs, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">RV-101</td>
			<td>cell line for viral production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">NIH 3T3 Cell Line murine</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">93061524</td>
			<td>cell line for focus formation assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">10 mL BD Luer-Lok tip syringe</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">309604</td>
			<td>viral production reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">0.45 &#956;m Puradisc Syringe Filter</td>
			<td style="width:127px;">Whatman</td>
			<td style="width:123px;">6750-2504</td>
			<td>viral production reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:127px;">Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">23966-2</td>
			<td>cell transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td style="width:127px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:123px;">TR-1003-G</td>
			<td>cell transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">C581-25</td>
			<td>cell stain reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Plasmid Plus Midi Kit</td>
			<td style="width:127px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">12945</td>
			<td>plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">BD Falcon Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">353003</td>
			<td>cell culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">11995-065</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">25300-054</td>
			<td>cell culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">31985-062</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td>cell culture media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focus formation: a cell-based assay to determine the oncogenic potential of a gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

MXD3 является основной спираль-петля-спираль лейцин молния (bHLHZ) транскрипционный фактор, который является членом MYC / MAX / MAD сети. Это нетипичный член MAD семьи 13-15 и было сообщено, участвуют в канцерогенезе 16,17. По сравнению с pBABEpuro (отрицательный контроль) и MYC (положительный конт?...

Watch this Scientific Journal Video about Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene at JoVE.com

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Фокус Образование: клеточном анализе для определения онкогенных потенциал гена

Фокус Формирование анализ обеспечивает простой метод для оценки преобразующую потенциал кандидата онкоген.

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Биомаркеры в животной модели для выявления нервных, гематологических, и поведенческие корреляты посттравматического стрессового расстройства

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Новый хирургический подход к интратрахеального введения биологически активных веществ в фетальный модель мыши

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Высокая пропускная проточной цитометрии Клеточная Анализ для выявления антител к N-метил-D-аспартат рецепторов или допамин-2 рецепторов в сыворотке человека

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Модифицированный<em&gt; В пробирке</em&gt; Вторжение Пробирной для определения потенциальной роли гормонов, цитокинов и / или факторы роста в посредничестве клеточного рака Вторжение

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Роман<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Перенос генов Техника и<em&gt; В пробирке</em&gt; Сотовый основе Анализы для исследования костного Потери в опорно-двигательного аппарата

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Трехмерная (3D) опухоли Сфероид Вторжение Пробирной

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Использование мягких агар колонии Формирование анализе для идентификации ингибиторов туморогенности в клетках рака молочной железы

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

ИСТИНА молчанием генов: Скрининг гептамер типа Руководство Малые РНК библиотека для потенциальных рака терапевтических агентов

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Инъекция Сингенная мышиной меланомы клеток с целью определения их метастатического потенциала в Легких

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side

Сосудистом сплетении эпителиальных клеток на основе модели крови человека-спинномозговой жидкости барьер для изучения бактериальной инфекции от базолатеральной стороны

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The ...