Name: stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration
Uploaded: 2014-08-04T23:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration at JoVE.com

We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.

<ol>
	<li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+brain:+significant+answers+and+significant+questions.">Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li><li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Dev Neurobiol. 72, 429-461 (2012).</li><li>Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+potential+of+glia:+lessons+from+reactive+gliosis.">The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis.</a> Nat Rev Neurosci. 12, 88-104 (2011).</li><li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation.">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32, 638-647 (2009).</li><li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult.">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Dev. 8, 3 (2013).</li><li>Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+neuronal+regeneration+in+the+central+nervous+system+of+teleost+fish.">Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the central nervous system of teleost fish.</a> Eur J Neurosci. 34, 917-929 (2011).</li><li>Zupanc, G. K., Sirbulescu, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teleost+fish+as+a+model+system+to+study+successful+regeneration+of+the+central+nervous+system.">Teleost fish as a model system to study successful regeneration of the central nervous system.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 367, 193-233 (2013).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Dev Biol. 295, 278-293 (2006).</li><li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell+fate.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Dev Biol. 295, 263-277 (2006).</li><li>Zupanc, G. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+persistence+of+new+neurons+in+the+adult+zebrafish+brain:+a+quantitative+analysis.">Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis.</a> Neuroscience. 146, 679-696 (2007).</li><li>Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+composition+of+neurogenic+periventricular+zones+in+the+adult+zebrafish+forebrain.">The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain.</a> J Comp Neurol. 520, 2275-2316 (2012).</li><li>Marz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58, 870-888 (2010).</li><li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Dev Dyn. 240, 2221-2231 (2011).</li><li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates.">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev Genes Evol. 223, 131-147 (2013).</li><li>Ayari, B., El Hachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon.">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> J Neurotrauma. 27, 959-972 (2010).</li><li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon:+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis.">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60, 343-357 (2011).</li><li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury.">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Dis Model Mech. 5, 200-209 (2012).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+neurogenesis+from+neural+progenitor+cells+requires+injury-induced+expression+of+Gata3.">Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3.</a> Dev Cell. 23, 1230-1237 (2012).</li><li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138, 4831-4841 (2011).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338, 1353-1356 (2012).</li><li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish.">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li><li>Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+cell+fate+analysis+in+zebrafish+using+olig2+BAC+transgenics.">Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics.</a> Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).</li><li>Armant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+whole+mount+in+situ+analysis+of+transcriptional+regulators+in+zebrafish+embryos.">Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 380, 351-362 (2013).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

हम यहाँ वयस्क zebrafish की खोपड़ी के माध्यम से एक सुई धक्का द्वारा एक telencephalic चोट प्रेरित करने के लिए, और immunohistochemistry द्वारा और स्वस्थानी संकरण में इस चोट के लिए सेलुलर और आणविक प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन. अन्य मौजूदा तरीकों पर इस तकनीक का मुख्य लाभ अपनी सादगी, गति और लागत कुशलता है. इसलिए, एक कम समय में कई घायल दिमाग के उत्पादन की अनुमति देता है जो इस तकनीक, आसानी से उत्थान और neurogenesis में एक भूमिका के साथ जीन की पहचान करने के लिए सीटू संकरण स्क्रीन में एक बड़े पैमाने के साथ जोड़ा जा सकता है. चोट किया जाता है जिस पर वयस्क zebrafish की उम्र महत्वपूर्ण है. मछली 15 साल से अधिक उम्र के हैं, खोपड़ी बहुत मुश्किल है और यह खोपड़ी नीचे धक्का दे दिया या बल्कि सफाई से छिद्रित से खंडित किया जा रहा है कि संभव है. इसके विपरीत, छोटी मछली (छोटी से 4 महीने) में चल रहा neurogenesis की एक बहुत कुछ है, वहाँ अभी भी है, जो हो सकता है घास का मैदानप्रतिक्रियाशील neurogenesis के बारे में झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए डी. इस दृष्टिकोण में एक और महत्वपूर्ण कदम चाकू के घाव की दक्षता को सत्यापित करने के लिए और दोनों गोलार्द्धों घायल कर रहे हैं कि बाहर करने के लिए है. यह विरोधी PCNA एंटीबॉडी के साथ वर्गों धुंधला द्वारा नजर रखी जा सकती है. एक सही ढंग से पेश घाव में, PCNA गोलार्द्धों में से केवल एक में विनियमित ऊपर काफी होना चाहिए. यह प्रेरित यांत्रिक चोट ऐसे गैर विशिष्ट सेल पृथक, क्योंकि माध्यमिक अध: पतन, सूजन और रक्त मस्तिष्क बाधा के विनाश की वृद्धि की कोशिका मृत्यु, और निलय क्षेत्र की क्षति के रूप में और के रूप में कई साइड इफेक्ट हो जाएगा कि दिमाग में रखना जरूरी है मस्तिष्क पैरेन्काइमा में मस्तिष्कमेरु द्रव के संभावित परिणाम के प्रवाह. हालांकि, घायल मछली की चोट से बहुत कम पीड़ित दिखाई देते हैं. 2 मिनट के भीतर ही वे फिर से मुक्त तैर रहे हैं और सामान्य भोजन व्यवहार के बारे में 4 घंटे के भीतर बहाल है. 3 सप्ताह के बाद मैंnjury अब और आकृति विज्ञान दिखाई नहीं देता है. हमारे हाथ में, कई सौ सर्जरी से हम 5 दिनों के बाद घाव पर ऊतक विज्ञान के द्वारा मूल्यांकन के रूप में हम एक 100% की चोट की दर थी कि इस तथ्य के बावजूद एक भी मछली खोना नहीं था. पिछले वर्षों में ऐसे ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण के रूप में अन्य तकनीकों के ऊतक या सेल प्रकार विशिष्ट पृथक 2 निर्माण करने के लिए zebrafish में विकसित किया गया है. इन तकनीकों का बहुत ही सुंदर और न्यूनतम इनवेसिव हैं हालांकि वे जटिल डीएनए निर्माणों और बहुत थकाऊ और समय लेने वाली हो सकती है, जो कई स्थिर zebrafish ट्रांसजेनिक लाइनों की स्थापना की पीढ़ी पर आधारित हैं. इसलिए, इस तरह इस प्रोटोकॉल में वर्णित परख के रूप में सरल यांत्रिक दृष्टिकोण वयस्क मस्तिष्क neurogenesis और उत्थान अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण रहते हैं.

स्तनधारी वयस्क जीवन के दौरान नए न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए एक बहुत ही सीमित क्षमता है, और मस्तिष्क में वयस्क neurogenesis ज्यादातर पार्श्व ventricles के subventricular क्षेत्र (SVZ) में स्थित दो telencephalic क्षेत्रों तक ही सीमित है, और दांतेदार की subgranular क्षेत्र (SGZ) हिप्पोकैम्पस 1 में गाइरस. स्तनधारी भी कुशलतापूर्वक, neurodegenerative रोगों, स्ट्रोक, या चोट की वजह से मस्तिष्क की क्षति की मरम्मत नहीं कर सकते. खोया न्यूरॉन्स की जगह नहीं कर रहे हैं और astrocytes, microglia, और oligodendrocytes सहित glial कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार, के बजाय प्रसार, मनाया जाता है. प्रतिक्रियाशील gliosis नामक इस proliferative प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में घायल हो गए, मस्तिष्क के ऊतकों neuronal और axonal उत्थान 2-4 रोकता है जो एक glial निशान के गठन से सील बंद है. स्तनधारियों, teleost मछली के विपरीत zebrafish तरह वयस्क अवस्था में बहुतायत से नए न्यूरॉन्स के रूप में और एक उच्च पुनर्योजी और proliferat हैकेंद्रीय तंत्रिका तंत्र 2,5-7 के घावों की मरम्मत के लिए संभावित ive. zebrafish वयस्क मस्तिष्क पूरे जीवन 8-11 दौरान नए न्यूरॉन्स की एक बड़ी संख्या उत्पन्न कि 16 अलग तंत्रिका स्टेम सेल आलों में शामिल है. वयस्क zebrafish मस्तिष्क के इन विशिष्ट प्रसार क्षेत्रों में जन्म न्यूरॉन्स वे परिपक्व और मौजूदा neuronal नेटवर्क 8,10,12-15 में एकीकृत जाएगा जहां उनके लक्ष्य क्षेत्रों की ओर पलायन. वयस्क zebrafish में पहचान पूर्वज क्षेत्रों के अलावा, telencephalic निलय क्षेत्र सबसे अधिक अध्ययन neuronal स्टेम सेल आलों में से एक है. इस पूर्वज आला में कोशिकाओं को अपनी आकृति विज्ञान, विभाजन की दर और विभिन्न glial या neuronal मार्करों की अभिव्यक्ति के बारे में तीन अलग प्रकार में वर्गीकृत किया जा सकता है. मैं टाइप करें और प्रकार द्वितीय कोशिकाओं लंबी प्रक्रिया है जो कोशिकाओं की तरह रेडियल glial हैं. वे GFAP, nestin, और S100β सहित स्टेम सेल मार्कर व्यक्त करते हैं. प्रकार द्वितीय कोशिकाओं proliferat जबकि मैं कोशिकाओं को पैदा नहीं करते लिखेंई धीरे से, इस तरह के सेल परमाणु प्रतिजन (PCNA) और desoxythymidine analogues के समावेश proliferating के रूप में प्रसार मार्कर की उनकी अभिव्यक्ति इसका सबूत है. प्रकार III कोशिकाओं तेजी से तंत्रिका progenitors बनने के लिए और इस तरह पीएसए NCAM 5,16 के रूप में तंत्रिका मार्कर जीन व्यक्त करने के लिए प्रतिबद्ध हैं कि कोशिकाओं को विभाजित कर रहे हैं. Teleost मछली के पुनर्योजी क्षमता अच्छी तरह से प्रलेखित रहे हैं, केवल कुछ प्रकाशनों चोट 15,17-22 के जवाब में वयस्क telencephalon में neuronal उत्थान में शामिल सेलुलर और आणविक तंत्र का वर्णन किया और विस्तार से जांच की है. Zebrafish वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र उत्थान और मरम्मत में फंसा तंत्र को समझने के लिए और विधान और पुनर्योजी neurogenesis के बीच समानता और अंतर को समझने के लिए, हम वयस्क telencephalic चोट का एक zebrafish मॉडल विकसित किया है. यहाँ, हम telencephalic hemisph में से एक में एक चोट उत्पन्न करने के लिए नेत्रहीन कैसे वर्णन करेंगेएक सिरिंज सुई की मदद से ERES, एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में contralateral unlesioned पक्ष रखते हुए. हम भी सेल प्रसार और immunohistochemistry द्वारा जीन अभिव्यक्ति में और सीटू संकरण assays में चोट पर परिवर्तन की निगरानी करने के लिए कैसे दिखाई देंगे.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="782">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">335.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x DPBS (-/-)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14200-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 G syringe (Omnican 40)</td>
			<td>B.Braun Melsungen</td>
			<td align="right">916162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene molding cup tray&#160;</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>17177C-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PeqGOLD Universal Agarose&#160;</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>35-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>W 2835919108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aqua Poly/Mount</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td align="right">9127.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection needle</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KX93.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td align="right">335.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Loctite 414</td>
			<td>Sch&#246;ffler und W&#246;rner</td>
			<td><a href="http://62.157.117.162/BP2NAV500/ItemDetail_NAV.aspx?ItemID=06%201362%200020">06 1362 0020</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass slides</td>
			<td>Labonord</td>
			<td align="right">5305103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slips 24 x 60 mm</td>
			<td style="width:163px;">Labonord</td>
			<td align="right">5305060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes 94 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td align="right">632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcons 15 ml</td>
			<td style="width:163px;">Greiner bio-one</td>
			<td align="right">188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td align="right">662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-S100 (1:500)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z031101-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-PCNA (1:400)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M087901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GFP (1&#160;:1000)</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Dig AP-coupled antibody&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td align="right">11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP)&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td align="right">1383221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT)&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td align="right">1383213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1092766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene molding cup tray&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">17177C-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome VT1000S</td>
			<td>Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope Sp5 DM6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope Nikon SMZ 645</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well flat bottomed tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Falcon catalog&#160;</td>
			<td align="right">353226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Student Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Danio rerio Tg(olig2:EGFP)</td>
			<td align="right">24</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2)</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration

वयस्क zebrafish चोट के बाद उनके केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को पुनर्जीवित करने के लिए एक अद्भुत क्षमता है. सेलुलर प्रतिक्रिया और zebrafish वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) उत्थान और मरम्मत में शामिल आणविक तंत्र की जांच करने के लिए, हम वयस्क telencephalic चोट का एक zebrafish मॉडल विकसित किया है. इस दृष्टिकोण में, हम स्वयं zebrafish वयस्क telencephalon में एक इंसुलिन सिरिंज सुई धक्का द्वारा एक चोट उत्पन्न करते हैं. अलग पोस्ट चोट दिनों में, मछली उनके दिमाग बाहर विच्छेदित और सेल प्रसार, gliogenesis, और neurogenesis निरीक्षण करने के लिए उपयुक्त मार्कर के साथ immunohistochemistry और / या स्वस्थानी संकरण (ISH) में से दाग रहे हैं, बलिदान कर रहे हैं. contralateral unlesioned गोलार्द्ध एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. शाही सेना गहरी अनुक्रमण के साथ उदाहरण के लिए संयुक्त यह विधि zebrafish वयस्क telencephalon न्यूरोजेनेसिस, उत्थान, और मरम्मत में एक भूमिका के साथ नए जीनों के लिए स्क्रीन करने के लिए कर सकते हैं.

इस आलेख में वर्णित कार्यप्रवाह का उपयोग करना, एक घाव एक वयस्क zebrafish telencephalon (आंकड़े 1 ए -1 बी) के दाएँ गोलार्द्ध में पेश किया गया था. एक सही लोग घायल हो गए telencephalon (चित्रा -3 सी) के पूरे एक प्रकार का कपड़ा के माध्यम से उदर को पृष्ठीय से फैली कि एक घाव नहर की ओर जाता है. घाव गोलार्द्धों में से एक के लिए प्रतिबंधित किया जाना चाहिए और औसत दर्जे का निलय पार नहीं करना चाहिए. घाव नहर उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी (चित्रा -3 सी) के साथ दिख रहा है और लगभग 35 दिनों के बाद 15 चंगा हो जाएगा. 3-7 डीपीएल में और S100β (3B चित्रा) immunohistochemistry 15 से detectable है, यह पहले से सेल परमाणु प्रतिजन (चित्रा 3A PCNA) proliferating के एक ऊपर विनियमन लोग घायल हो गए के बाद कि दिखाया गया था. PCNA और S100β का धुंधला रेडियल glial कोशिकाओं के प्रसार का संकेत है, अतिव्यापी है. एफमछली 24: urthermore, oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं (OPCs) कल्पना करने के क्रम में, एक चाकू के घाव परख टीजी (EGFP olig2) पर प्रदर्शन किया गया था. एक विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ धुंधला करने पर, घाव नहर के पास OPCs के संचय (चित्रा 3 डी) detectable है. इस संचय क्षणिक है, और OPC समूहों 35 डीपीएल 15 पर अब और नहीं मनाया जाता है. घाव ठीक से पेश नहीं किया गया था, तो घाव नहर दिखाई नहीं होगा, और ऊपर विनियमन PCNA और S100β या OPCs के संचय का पता लगाने योग्य नहीं होगा. PCNA मस्तिष्क की चोट के लिए सबसे ज्यादा संवेदनशील मार्कर है. चाकू के घाव की दक्षता को सत्यापित करने के लिए और दोनों गोलार्द्धों घायल कर रहे हैं कि बाहर करने के लिए आदेश में, यह दृढ़ता से हमेशा एक विरोधी PCNA एंटीबॉडी के साथ वर्गों दाग की सिफारिश की है. एक सही ढंग से पेश घाव में, PCNA काफी होना चाहिए विनियमित केवल एक ही गोलार्द्धों के में (15 से 4 गुना). ज्यादातर मामलों में यह हैकेवल जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की निगरानी के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में contralateral unlesioned पक्ष का उपयोग करने के लिए पर्याप्त है, यह अत्यधिक जंगली प्रकार दिमाग की telencephalic गोलार्द्धों में अभिव्यक्ति के साथ नियंत्रण गोलार्द्ध में जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने की सिफारिश की है. इस तरह, दोनों गोलार्द्धों को प्रभावित करती है कि जीन की अभिव्यक्ति पर घाव के किसी भी प्रणालीगत प्रभाव का पता लगाया जा सकता है. चाकू के एक व्यवस्थित प्रतिलेखन नियामकों (टीआरएस) की अभिव्यक्ति की स्क्रीन के साथ संयोजन में परख घाव (25 और श्मिट एट अल., अप्रकाशित) भी न्यूरोजेनेसिस और उत्थान (आंकड़े 4A-4C) में एक संभावित भूमिका के साथ टी.आर. जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह दृष्टिकोण telencephalon में व्यक्त की है और जिनकी अभिव्यक्ति की चोट (चित्रा -4 ए सी) के जवाब में विनियमित ऊपर से विशेष रूप से है कि कारकों की एक संख्या की पहचान की है. <imgalt = &quot;चित्रा 1&quot; के लिए: सामग्री चौड़ाई = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51753/51753fig1highres.jpg&quot; चौड़ाई = &quot;500&quot; /&gt; चित्रा 1. वयस्क zebrafish telencephalic वार लोग घायल हो गए योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. ए) एक इंसुलिन सिरिंज सुई एक telencephalic चोट उत्पन्न करने के लिए एक वयस्क zebrafish की खोपड़ी के माध्यम से धक्का दिया है. सफेद लाइन दो telencephalic गोलार्द्धों के बीच सीमा का प्रतिनिधित्व करता है और ग्रीन क्रॉस एक वयस्क zebrafish मस्तिष्क के चाकू के घाव. बी) पृष्ठीय दृश्य की स्थिति को दर्शाता टकराया. प्रमुख मस्तिष्क क्षेत्रों संकेत कर रहे हैं. ग्रीन क्रॉस प्रेरित चोट. सी) telencephalic चोट प्रेरित करने के लिए कार्य करता है जो सुई,, की नोक 2 मिमी उपायों की स्थिति को दर्शाता है. घ्राण बल्ब (ओ), telencephalon (दूरभाष) और ऑप्टिक tectum (ओटी). <img alt="चित्रा 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig2highres.jpg" width="500" /> चित्रा 2. एसएक छंटनी agarose ब्लॉक में एक वयस्क zebrafish मस्तिष्क की chematic प्रतिनिधित्व बस से पहले vibratome सेक्शनिंग. पूर्वकाल ऊपर है. घ्राण बल्ब (ओ), telencephalon (दूरभाष), ऑप्टिक tectum (ओटी), सेरिबैलम (सीबी) और मज्जा (एम). स्केल पट्टी: 500 माइक्रोन. <img alt="चित्रा 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig3highres.jpg" width="500" /> चित्रा 3. घाव चोट वार करने के लिए पुनर्योजी के हिमायती हैं. 5 दिनों में ई.) वयस्क zebrafish मस्तिष्क वार लोग घायल हो गए पर निलय क्षेत्र (तीर) पर विनियमित अप (डीपीएल). एबी) proliferative मार्कर PCNA (ए) और रेडियल glial मार्कर S100β (ख) का घाव पोस्ट. (सी) घाव चैनल उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी (तीर) के तहत दिखाई है. निलय क्षेत्र ग्रीन लाइन ने संकेत दिया है. (डी) Oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं (olig2: ईजीएफ पी)) घाव (तीर के स्थल पर जमा हो. स्केल पट्टी: 200 माइक्रोन. सभी पैनलों में, दाएँ गोलार्द्ध lesioned गोलार्द्ध है. पृष्ठीय ऊपर है. डी ए में धराशायी लाइन प्रकार का कपड़ा और subpallium के बीच की सीमा को इंगित करता है. <img alt="चित्रा 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" width="600" /> निगरानी की के रूप में चित्रा 4. चोट वार के जवाब में विनियमित ऊपर से जीन का एक उदाहरण है. Eomesa सही telencephalic गोलार्द्ध में (ए, बी) और sox4a (सी) mRNA अभिव्यक्ति (छुरा घोंपा गोलार्द्ध) की मजबूत विनियमन (तीर) नोट 5 डीपीएल में स्वस्थानी संकरण में से. बाएँ गोलार्द्ध रिहाई है और नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. (बी) ए पृष्ठीय के पृष्ठीय telencephalic क्षेत्र के एक उच्च बढ़ाई ऊपर से पता चलता है. स्केल पट्टी: ए और सी के लिए 200 माइक्रोन और बी के लिए 55 माइक्रोनएक में लाइन धराशायी और सी प्रकार का कपड़ा और subpallium के बीच अलगाव को इंगित करता है. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a> <table><tbody><tr><td colspan="2"> लघुरूप </td></tr><tr><td> एपी </td><td> Alkaline फॉस्फेट </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> 5-Bromo-4-क्लोरो 3&#39;-indolyphosphate </td></tr><tr><td> बीएसए </td><td> गोजातीय सीरम albumin </td></tr><tr><td> सीएनएस </td><td> केंद्रीय तंत्रिका तंत्र </td></tr><tr><td> खुदाई </td><td> Digoxygenin </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> डाइमिथाइल sulfoxide </td></tr><tr><td> डीपीएल </td><td> दिन घाव पोस्ट </td></tr><tr><td> eomesa </td><td> Eomesodermin Homolog एक </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन </td></tr><tr><td> घंटा </td><td> घंटा </td></tr><tr><td> HYBबफर </td><td> संकरण बफर </td></tr><tr><td> ISH </td><td> स्वस्थानी संकरण में </td></tr><tr><td> MeOH </td><td> मेथनॉल </td></tr><tr><td> एनबीटी </td><td> नाइट्रो नीले tetrazolium </td></tr><tr><td> OPCs </td><td> Oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं </td></tr><tr><td> पीबीएस </td><td> फास्फेट बफर खारा </td></tr><tr><td> PCNA </td><td> सेल परमाणु प्रतिजन proliferating </td></tr><tr><td> पीएफए </td><td> Paraformaldehyde </td></tr><tr><td> ProtK </td><td> Proteinase कश्मीर </td></tr><tr><td> पीएसए NCAM </td><td> Polysialylated neuronal सेल आसंजन अणु </td></tr><tr><td> PTW </td><td> पीबीएस, 0.1% बीच 20 </td></tr><tr><td> शाही सेना </td><td> Ribonucleic एसिड </td></tr><tr><td> आरटी </td><td> कमरे के तापमान </td></tr><tr><td> SGZ </td><td> Subgranular क्षेत्र </td></tr><tr><td> sox4a </td><td> जीन -4 ए युक्त SRY बॉक्स</td></tr><tr><td> एसएससी </td><td> खारा सोडियम साइट्रेट </td></tr><tr><td> SVZ </td><td> Subventricular क्षेत्र </td></tr><tr><td> टीआरएस </td><td> ट्रांसक्रिप्शन नियामकों </td></tr></tbody></table>

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Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

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