Name: live imaging of drosophila larval neuroblasts
Uploaded: 2014-07-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts at JoVE.com

Эта работа была поддержана разделения очной исследований в Национальных Институтах Здоровья / NHLBI (1ZIAHL006126) и Lenfant биомедицинской докторантуру, присужденных DAL.

1. Подготовка материалов для эксплантата третьего возраста личинок Brains <ol><li> Подготовьте инструменты, необходимые для микродиссекции. <ol><li> Кузница два рассекает инструменты (скальпель и крюк), разместив один рассекает штифт в каждого держателя контактный. Закрепите флажки плотно вру?...

<ol>
	<li>Truman, J. W., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+patterns+of+neurogenesis+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).</li><li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+markers+for+identified+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells+in+the+Drosophila+central+nervous+system.">Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system.</a> Development. 116, 855-863 (1992).</li><li>Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+asymmetry+for+proper+fitness,+function,+and+fate.">Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate.</a> Chromosome research. 21, 271-286 (2013).</li><li>Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+neural+stem+cell+proliferation+by+intermediate+progenitor+cells+in+Drosophila+brain+development.">Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development.</a> Neural development. 3, 5 (2008).</li><li>Bowman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressors+Brat+and+Numb+regulate+transit-amplifying+neuroblast+lineages+in+Drosophila.">The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila.</a> Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).</li><li>Boone, J. Q., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Drosophila+type+II+neuroblast+lineages+containing+transit+amplifying+ganglion+mother+cells.">Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells.</a> Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139, 4297-4310 (2012).</li><li>Savoian, M. S., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+primary+cultures+of+Drosophila+melanogaster+larval+neuroblasts.">Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts.</a> Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).</li><li>Fleming, S. L., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flattening+Drosophila+cells+for+high-resolution+light+microscopic+studies+of+mitosis+in+vitro.">Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).</li><li>Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Mad2+to+the+kinetochore+requires+the+Rod/Zw10+complex.">Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex.</a> Current biology. 15, 856-861 (2005).</li><li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+centrioles.">Flies without centrioles.</a> Cell. 125, 1375-1386 (2006).</li><li>Lucas, E. P., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+the+proper+connection+between+the+centrioles+and+the+pericentriolar+matrix+requires+Drosophila+centrosomin.">Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin.</a> J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).</li><li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+amplification+can+initiate+tumorigenesis+in+flies.">Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies.</a> Cell. 133, 1032-1042 (2008).</li><li>Conduit, P. T., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnn+dynamics+drive+centrosome+size+asymmetry+to+ensure+daughter+centriole+retention+in+Drosophila+neuroblasts.">Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts.</a> Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome research. 6, 533-549 (1998).</li><li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+Drosophila+neural+stem+cells.">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells.</a> Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).</li><li>Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts+retain+the+daughter+centrosome.">Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome.</a> Nat. Commun. 2, 243 (2011).</li><li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrobin+controls+mother-daughter+centriole+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts.">Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).</li><li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Live+Cell+Imaging+and+Automated+4D+Analysis+of+Drosophila+Neuroblast+Lineages.">Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Neumuller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells+by+transgenic+RNAi.">Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi.</a> Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Siegrist, S. E., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+cues+orient+the+cell+division+axis+in+Drosophila+embryonic+neuroblasts.">Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts.</a> Development. 133, 529-536 (2006).</li><li>Broadus, J., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+cues,+intrinsic+cues+and+microfilaments+regulate+asymmetric+protein+localization+in+Drosophila+neuroblasts.">Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts.</a> Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).</li><li>Britton, J. S., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila:+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms.">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125, 2149-2158 (1998).</li><li>Siller, K. H., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lis1/dynactin+regulates+metaphase+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical/basal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila.">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).</li><li>Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+the+model+to+the+test:+are+APC+proteins+essential+for+neuronal+polarity,+axon+outgrowth,+and+axon+targeting.">Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting.</a> J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).</li><li>Lerit, D. A., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLP+inhibits+the+activity+of+interphase+centrosomes+to+ensure+their+proper+segregation+in+stem+cells.">PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells.</a> J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).</li><li>Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+pericentrin-like+protein+is+essential+for+cilia/flagella+function,+but+appears+to+be+dispensable+for+mitosis.">The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis.</a> J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).</li><li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Spd-2+recruits+PCM+to+the+sperm+centriole,+but+is+dispensable+for+centriole+duplication.">Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication.</a> Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).</li><li>Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localisation+of+the+mitotic+POLO+kinase+shows+a+highly+dynamic+association+with+the+mitotic+apparatus+during+early+embryogenesis+in+Drosophila.">In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila.</a> Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).</li><li>Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+is+a+dynamic+structure+that+ejects+PCM+flares.">The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares.</a> J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).</li></ol>

Изображений живых клеток является бесценным подход, используемый для изучения механизмов, которые регулируют ACD стволовых клеток, дифференцировку клеточных клонов, и морфогенез сложных тканей. Хотя исследовательские группы исторически использовали различные методы, чтобы визуализи...

Стволовые клетки поддерживать баланс дифференциации и самообновление генерировать сотовой разнообразие во время раннего развития и заменить поврежденные клетки во взрослых тканях. Регулирование этого гомеостаза предотвращает как потери и над-расширение популяции стволовых клеток, что может привести к вредным дегенерации тканей или опухолей. Нейробластов (NBS) являются широко изучены нервные стволовые клетки Drosophila центральной нервной системы (рис. 1А), что первые формы во время эмбриональных стадий 1, 2. NBs пройти неоднократные вспышки асимметричных клеточных делений (ACD) для получения двух неравномерно суждено клетки: самообновлению стволовых клеток и дифференциации клеток. ACD руководствуется центросомах, не-мембранных органелл, которые действуют как микротрубочки организующих центрах большинства клеток 3. Во время митоза, NB центросомы организовать и ориентировать биполярного митотическое веретено вдоль апикально-базальной полярнаяОсь ность. При отщеплении разделяющей NB, верхушечные судьба детерминанты, определяющие судьбу стволовых клеток и базальных судьба детерминанты, определяющие дифференциацию, выделяются в неравных дочерних клеток. В личиночной центральной мозга, два типа NBs можно отличить по их числу, должность, выражения фактора транскрипции, и клеточной линии (рис. 1А) 4-6. Тип I NBs являются наиболее распространенными, и около 90 из них заполнить переднюю и заднюю стороны каждого зрительного доли головного мозга 7. Эти NBs выразить транскрипционный фактор Asense (ASE), и они характерно разделить на одной самообновляющейся NB и один меньше ганглий материнская клетка (GMC; рис. 1В). Каждый GMC подвергается одной дивизии терминала генерировать два нейрона или глии (рис. 1b). В отличие от этого, НБС восемь Type II, которые населяют заднюю сторону каждой оптической доле хватает ASE выражение 5. Они проходят ACDДля производства одного самообновлению NB и один промежуточный нейронной прародителя (ИЯФ). ИЯФ, в свою очередь, делит асимметрично три-пять раз. Каждый из этих отделов приводит к регенерации ИЯФ и производства одного GMC 4. В совокупности конкретных идентичность NB и временной порядок GMC рождения приводит к поразительному разнообразию нейронов взрослого центральной нервной системы. Понимание клеточной биологии, что лежит в основе NB ACD была значительно улучшена за счет использования живых методов визуализации клеток. Опубликованные протоколы, используемые исследователями к фото живых NBs варьироваться в широких пределах. В целом, однако, эти методы могут быть сгруппированы в две основные категории, отличающихся личиночной мозг остается ли нетронутыми или механически диссоциируют. Оба метода имеют свои преимущества и недостатки в зависимости от применения исследователя. Ранние сообщения, раскрывающие живой NB клеток DIVIsions подразумевают некоторую степень ручного диссоциации личиночной мозга. Эти протоколы деталь размазывая 8 или дразнить друг от друга 9 мозг, чтобы расти краткосрочные первичных культур НБС на покровные стекла. Для улучшения визуализации, круглые NBs обычно сжатая с покровные с либо стеклах 8 или геле колодки 9. Хотя уплощенных клеток улучшили оптику, эти методы часто приводят к NB митотических дефектов, в том числе регрессии щели расхождения и невозможности разделить более чем один раз. Таким образом, протоколы, связанные как ручной диссоциации и физическое искажение личиночной мозговой ткани, как правило, только подходит для очень краткосрочные (т.е.., Один клеточный цикл или меньше) приложения. Кроме того, полу-недопустимыми или полностью уплощение неповрежденные мозги между стеклах и покровные ограничивает время можно потратить с изображениями данного образца к примерно 30-минутного периода 10. Несмотря на это ограничение, Тхис подход успешно используется 11-14. Недавние усилия, чтобы жить изображений в отрыве предел NBS физическое искажение изолированных клеток. Эти методы особенно полезны для приложений, где необходимо поддерживать клеточных культур для нескольких циклов деления клеток. Например, диспергированные клетки из диссоциированных вручную мозга может быть частично встроен в сгусток, изготовленного из смеси фибриногена и тромбина 15 для долгосрочного изображений 16. Кроме того, эксплантированной мозг может быть сначала химически диссоциирует с ферментом коллагеназой, следующий вручную путем многократного нарушенного прохождении через концом пипетки, а затем высевали на поли-L-лизин покрытием со стеклянным дном блюда 17, 18. Покрытие стеклянной посуды либо фибриногена или поли-L-лизина способствует прикреплению и небольшое распространение круглых клеток, в результате чего их как можно ближе к покровным как можно без больших физических искажений. В дополнительна эти способы включают культивирование НБС в среде, которая может быть легко обменены на фармакологических экспериментов возмущений 18. В целом, непосредственно покрытие разошлись NBs улучшает изображений оптики без ущерба для долгосрочных возможности визуализации. В последнее время это протокол, описывающий долгосрочную культивирование диссоциированном NBs был подробно описан 19. Однако этот подход не лишен ограничений. Есть несколько предостережений, чтобы изображений живых разложенных NBs. В поле диспергированных клеток, например, трудно определить конкретные NB клоны, которые пространственно организованных в интактном мозге 1. Кроме того, различия типа я против Тип NBS II в рамках диссоциированном ткани также представляет значительную проблему без выражения клона индикаторов или подтипа конкретных трансгенов, таких как worniu-GAL4, asense-GAL80 20. Хотя эти трансгены весьма полезны для некоторых применений, они ограничивают исследователей тех трансгенов экспрессуют под контролем энхансера UAS элемента 21 и требуют более сложных схем генетические. Исследования, которые касаются пространственного или временного развитие NBs, следовательно, требуют в естественных изображений в контексте интактной ткани. Более того, исследования диссоциированных эмбриональных NBs показывают, что физический контакт соседних клеток имеет решающее значение для интерфаза локализация ключевых полярности детерминанты 22, 23. Эти исследования показывают, полностью изолированы NBs больше не поддерживать инвариант ось митотического веретена. Вместо этого, эти клетки отображать более рандомизированных оси шпинделя и широкие углы разделения между последовательными почек GMC, возможно, связано с потерей апикальной центросом позиционирования 22. Хотя отношения между личиночной NBs и их соседних клеток не была изучена, стоит учесть, что личинок микросреда стволовых клеток может посягать на клеточной полярности или другихповедения. Для поддержания физиологического контекст личиночной NBs, мы изображение ACD из цельных мозгов. Учитывая присущие ограничения, связанные с изображениями в отрыве NBs, наша лаборатория и другие разработали протоколы для изображения последовательных раундов NB ACD из целых личинок мозгов. Методы к изображению мозга интактных часто заменять жесткой поверхности стекла на одной стороне культуральной камере с гибкой мембраны, чтобы предотвратить искажение ткани или повреждений и позволяют для газообмена. Некоторые способы включают монтажа эксплантированной мозги в смеси с насекомыми культивирования среды, сыворотка, и аскорбиновой кислоты с жиром органов, выделенных из десять личинок 24. Выделенные жира тела добавляются, потому что они выделяют митоген известно, стимулирует NB деление клеток 25. Этот протокол сохраняет целостность ткани свыше 3 часов, а, следовательно, поддаются долгосрочному изображений 24, 26-28. В последнее время это протокол, описывающий долготаг-термин изображений интактных личинок мозга в присутствии аскорбиновой кислоты, сыворотки и жировых тел была подробно 29. Важно отметить, что, так как ткань не является ни подвергается ни стопорится, такой подход является менее полезны для приложений, где происходит обмен культивирование среднего (например, исследований наркотиков, immunodepletion и др.). Наша лаборатория упростил всю подготовку монтирования живых личинок мозгов для долгосрочного изображений 30, 31. Главное преимущество нашего протокола над другими является его простота: наши наблюдения показывают, ни сыворотку, аскорбиновую кислоту, инсулин, ни жира тела являются необходимые добавки к фото последовательных раундов NB ACD. Хотя добавки, такие как инсулин, были полезны для длительного визуализации стволовых клеточных делений 32 и коллективной миграции клеток в дрозофилы яичников 33, они, кажется, безразличен для NB ACD, как наш изображений среда состоит из простой смеси станцийndard насекомое культивирования клеток, дополненной антибиотика-противогрибкового для предотвращения загрязнения. Благодаря использованию многоразовых газопроницаемой или стеклянным дном чашки для культивирования, мы были в состоянии выдержать несколько раундов последовательных NB ACDS. Те же образцы эксплантированной легко может быть использован для иммунофлуоресценции и других процедур с фиксированной ткани. В этом протоколе, мы подробно рассечение интактных личинок мозгов, а также подготовка мозги как для живой и фиксированной анализа.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="851">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">94.6077.410</td>
			<td style="width:167px;">A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Schneider&#39;s S2 Medium</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td>A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider&#39;s S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Glass coverslips, #1.5 22X22 mm</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-541-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Halocarbon oil 700</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8898</td>
			<td>A high viscosity inert oil that is clear and colorless.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26018-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Minutien dissecting pins</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">pair of Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:185px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Dissecting needle/probe with plastic handle</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-965-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Syringe filter, 0.22 mm pore size</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Syringe 5 mL&#160;</td>
			<td style="width:185px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">plastic transfer pipet</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S30467-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:380px;">paraformaldehyde, 32% EM-grade</td>
			<td style="width:185px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15714</td>
			<td>CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">DAPI (4&#39;, 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>A dye that labels DNA and is excited by UV light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">18606-20</td>
			<td>A water-soluble mounting medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of drosophila larval neuroblasts

Стволовые клетки делятся асимметрично для создания двух потомство клеток с неравной судьба потенциала: в самообновляющейся стволовых клеток и дифференциации клетки. Учитывая их актуальность для развития и болезни, понимание механизмов, которые регулируют деление асимметричный стволовых клеток была надежной областью исследования. Потому что они генетически послушный и пройти последовательных раундов деления клеток примерно раз каждый час, стволовые клетки Drosophila центральной нервной системы, или нейробластах, являются незаменимыми моделями для изучения деления стволовых клеток. Около 100 нервные стволовые клетки находятся вблизи поверхности каждого из двух личинок долей головного мозга, что делает эту модель система особенно полезна для живых изображений микроскопических исследований. В этой работе мы рассмотрим несколько подходов, широко используемые для визуализации стволовых клеток подразделения, и мы обращаемся относительные преимущества и недостатки этих методов, которые используют диссоциированных против здоровых тканей мозга. Мы также подробно наш simplifIED протокол, используемый для эксплантата целые мозги от третьего возраста личинок для изображений живых клеток и приложений фиксированных анализа.

Онлайн визуализация выяснены ряд механизмов, которые регулируют NB ACD. До захвата изображений, необходимо определить оптимальные условия визуализации. Необходимо сбалансировать скорость захвата кадров с продолжительностью изображений живых клеток. Для тонкой клеточной анализа, напр?...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts at JoVE.com

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Этот протокол детали обтекаемый метод, используемый для проведения изображений живых клеток в контексте интактной личиночной мозга. Подходы изображений живых клеток имеют неоценимое значение для изучения асимметричных делений нейронных стволовых клеток, а также других нейрогенных и развития процессов, последовательно раскрывая механизмы, которые ранее были замечены.

Живая съемка<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Личиночные нейробласты

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Магнитно-резонансной спектроскопии живых Дрозофилы С помощью магии прядильной Угол

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Визуализация личинок Сегментные Нервы у 3 Й Инстар Drosophila Подготовка личинок

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

В естественных условиях Визуализация синаптических пузырьков В дрозофилы личинок Сегментные Аксоны

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-ячейки изображения сенсорных клеток-предшественников органов в интактных Drosophila Куколки

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Вскрытие и иммуногистохимического личинок, куколок и взрослых<em&gt; Drosophila</em&gt; Сетчатки

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Функциональный анализ из питания личинок округа в Дрозофилы</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Почему Количественное вопросы: Определение характеристик фенотипов на<em&gt; Drosophila</em&gt; Личиночная нейромышечных синапсах

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Использование линейных агарозном каналов для изучения<em&gt; Drosophila</em&gt; Личиночная Ползучая Поведение

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Одноклеточных резолюции флуоресценции живут изображений дрозофилы суточного часов в культуре личиночной мозга

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Отслеживание дрозофилы личиночной поведение в ответ на Optogenetic стимуляции обонятельных нейронов

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...