Name: fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (fiona)
Uploaded: 2014-09-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH Grants 068625, NSF Grants 1.063.188 og Center of the Physics of levende celler 0822613. spesiell takk går til Dr. Marina Marjanovic i Beckman Institute for Advanced Science and Technology for gaven av kaninøyne.

Etikk Uttalelse: Hornhinnen vev fra kaniner ble innhentet i samsvar med University of Illinois Institutional Animal Care og bruk retningslinjer. 1. TIRFM Setup MERK: Bruk laser-vernebriller hele tiden. <ol><li> Kontroller at alle nødvendige optiske komponenter som er oppført i listen over Materialene er tilgjengelige og klare for justering. Du kan eventuelt bruke substitutter med tilsvarende funksjoner fra andre selskaper. Sørg for at speil og linser bør ha...

<ol>
	<li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Relation+of+Aperture+and+Power+in+the+Microscope.">The Relation of Aperture and Power in the Microscope.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (3), 300-309 (1882).</li><li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Relation+of+Aperture+and+Power+in+the+Microscope+(continued).">The Relation of Aperture and Power in the Microscope (continued).</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (4), 460-473 (1882).</li><li>Thompson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes.">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li><li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+V+Walks+Hand-Over-Hand:+Single+Fluorophore+Imaging+with+1.5-nm+Localization.">Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization.</a> Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).</li><li>Yildiz, A., Tomishige, M., Vale, R. D., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Walks+Hand-Over-Hand.">Kinesin Walks Hand-Over-Hand.</a> Science. 303 (5658), 676-678 (2004).</li><li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+VI+Steps+via+a+Hand-over-Hand+Mechanism+with+Its+Lever+Arm+Undergoing+Fluctuations+when+Attached+to+Actin.">Myosin VI Steps via a Hand-over-Hand Mechanism with Its Lever Arm Undergoing Fluctuations when Attached to Actin.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37223-37226 (2004).</li><li>Yildiz, A., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Imaging+with+One+Nanometer+Accuracy:+Application+to+Molecular+Motors.">Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy: Application to Molecular Motors.</a> Accounts of Chemical Research. 38 (7), 574-582 (2005).</li><li>Toprak, E., Yildiz, A., Hoffman, M. T., Rosenfeld, S. S., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+kinesin+is+so+processive.">Why kinesin is so processive.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (31), (2009).</li><li>Kural, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+melanosomes+inside+a+cell+to+study+molecular+motors+and+their+interaction.">Tracking melanosomes inside a cell to study molecular motors and their interaction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5378-5382 (2007).</li><li>Gordon, M. P., Ha, T., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+high-resolution+imaging+with+photobleaching.">Single-molecule high-resolution imaging with photobleaching.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6462-6465 (2004).</li><li>Qu, X., Wu, D., Mets, L., Scherer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer-localized+multiple+single-molecule+fluorescence+microscopy.">Nanometer-localized multiple single-molecule fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11298-11303 (2004).</li><li>Churchman, L. S., &#214;kten, Z., Rock, R. S., Dawson, J. F., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+high-resolution+colocalization+of+Cy3+and+Cy5+attached+to+macromolecules+measures+intramolecular+distances+through+time.">Single molecule high-resolution colocalization of Cy3 and Cy5 attached to macromolecules measures intramolecular distances through time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1419-1423 (2005).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Super-Resolution+Imaging+with+Photo-Switchable+Fluorescent+Probes.">Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes.</a> Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Abramoff, M. D., Magalh&#227;es, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics international. 11 (7), 36-42 (2004).</li><li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization.">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Optics Express. 14 (18), 8111-8120 (2006).</li><li>Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+algorithms+for+tracking+single+fluorescent+particles.">Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles.</a> Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Zhuang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single-Molecule+Study+of+RNA+Catalysis+and+Folding.">A Single-Molecule Study of RNA Catalysis and Folding.</a> Science. 288 (5473), 2048-2051 (2000).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li></ol>

Fiona er en teknikk for å lokalisere posisjonen til et fluorescerende emitter (organisk fluoroforen eller quantum dot) med nanometer presisjon og tidsmessig oppløsning ned til 1 ms 4- åtte. Når nok fotoner er samlet, gir denne teknikken for å bestemme plasseringen av et fluorescerende emitter mye mer nøyaktig enn diffraksjon grense (~ 200 nm) og dermed denne teknikken åpner en måte å observere hva som ikke har blitt sett med konvensjonell / tradisjonell optisk mikros 4 - 8. Siden oppfinnel...

Rundt 1882, Ernst Abbe fant at oppløsningen på en synlig lys mikroskop er ~ λ / 2NA, eller ~ 200 nm (der λ er bølgelengden og NA er numerisk apertur) 1,2. Derfor hvilket som helst objekt som er mindre enn denne dimensjonen ville fremstå som en diffraksjon-begrenset plass i en optisk mikroskop. Det er imidlertid mulig å bestemme senteret av stedet, det vil si plasseringen av gjenstanden, med en mye høyere presisjon 3. Fluorescens bildebehandling med én nanometer nøyaktighet (FIONA) er en enkel, men nyttig teknikk for lokalisering av enkelt fluoroforene med nanometerpresisjon i xy planet fire. Presisjonen av lokalisering, σ μ (dvs. standardfeilen for gjennomsnittet), avhenger av den totale antall innsamlede fotoner, <img alt="Ligning 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51774/intro_eqn.jpg" width="100" /> , Der N er fotontelling, er s standardavviket for det fluorescerende flekk, er enpikselstørrelse på bildedetektoren, og b er standardavviket av bakgrunnen 3,4. For en Fluoroforen emitting ~ 10.000 fotoner, kan FIONA oppnå ~ 1 nm presisjons fire. Fiona kan brukes til å bestemme den nøyaktige posisjonen til en stasjonær emitter, eller et bevegelig en (forutsatt at bilder kan tas raskt nok). Fiona kan påføres sekvensielt til rammene av filmen og således følge bevegelsen av enkelt molekyl 4- 8. Foto-beskyttende reagenser kan være nødvendig for å sikre at prøven ikke photodegrade. Videre kan den fluorescerende gjenstand i seg selv være av en hvilken som helst størrelse, mindre eller større enn den diffraksjon limit- f.eks, kan det bestå av et organeller (~ 1 mm) med mange fluorescerende proteiner dispergert på sin membran. Bruke FIONA kan fortsatt gi en svært nøyaktig (nanometer) gjennomsnittet av gjennomsnittlig sentrum-of-mass. Den store forbedringen i lokalisering presisjon av Fiona kan løse nanometer-skala bevegelser over tid. Dette har presset mikros inn i den molekylære lengdeskala 4- 8. Siden oppfinnelsen sin, har varianter av FIONA blitt utviklet. For eksempel, lyse-feltet bildebehandling med én nanometer nøyaktighet (bFIONA) 9, en liten variant av FIONA, bilder og lokaliserer tette objekter som melanosomer in vivo (mørke objekter som inneholder pigmentet melanin) med lyset. I tillegg har Fiona blitt benyttet for å løse flere fargestoffer. For eksempel har 12 blitt utviklet single-molekyl bildebehandling med høy oppløsning med fotobleking (reker) 10,11 eller enkelt-molekyl høy oppløsning colocalization (SHREC) for å løse to fargestoffer innenfor ca 10 nm. (Legg merke til at dette er oppløsning, dvs. hvor nøyaktig man kan si identiske fargestoffer fra hverandre.) Mer nylig har FIONA analyse bidratt til lokaliseringsprosessen av visse super-oppløsning mikroskopi som stokastiske optiske anbefanstruction mikroskopi (STORM) 13- 15 og foto-aktivert lokalisering mikroskopi (PALM) 16, i hvilket midlertidige mørke fluoroforer er spent, og fluorescensen er lokalisert. Ved gjentatte ganger spennende en ganske lav densitet av fargestoffer (mindre enn én pr diffraksjon begrenset sted), og deretter oppsamling av fluorescens, analysere hver av dem av Fiona, kan man bygge opp et kart med høy oppløsning. Oppløsningen er da bare begrenset av antallet av fotoner hver fargestoff legger ut, samt ting som å holde prøven i ro (inkludert, for eksempel, objektbordet) i ervervet. I denne utredningen, et sammendrag av FIONA teknikk og kort beskrive eksempler på forskning som er utført ved hjelp av Fiona er rapportert. Først, hvordan sette opp nødvendig utstyr for FIONA eksperimenter, dvs. en total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM), med detaljer om justering av optikk, er beskrevet. Deretter hvordan duutføre en enkel FIONA forsøket på å lokalisere immobilisert Cy3-DNA enkle molekyler ved hjelp av hensiktsmessige protokoller, er illustrert. Etter det, til bruk av FIONA måle 36 nm trinnstørrelsen for en enkelt avkortet myosin Va motor er merket med en prikk quantum er presentert. Myosin Va er en viktig processive motor protein som bærer cellular last mens translocating langs aktin filamenter. Her en myosin Va konstruere avkortede brukes til å fjerne irrelevante domener til trinnstørrelsen, og med en FLAG tag tilsatt til C-terminus for å tillate enkel merking med kvanteprikker funksjon med anti-FLAG-antistoffer. Dette eksperimentet er gjort under lav ATP å forsinke myosin og tillate bruk av lange nok eksponeringstider for å få en god foton teller i hver ramme. Enhver tilstrekkelig sterkt fluorescerende markør kan være substituert i den følgende protokoll. Endelig er siste innsats for å utvide anvendelsen av FIONA til tykke prøver rapportert. Som en proof-of-prinsippet, ble kvanteprikker gjennomvåti sol-gel og kaninøyne hornhinner og deretter avbildes og lokalisert ved hjelp FIONA. For bildebehandling, en 60X vannimmersjonsobjektiv med NA = 1.2 ble brukt fordi dette målet har en lengre arbeidsavstand enn tidligere brukte 100X oljeneddyppingsobjektivet. For å kompensere tapet i forstørrelsen i målet, ble en ekstra forstørrelse objektivet (3,3X eller 4,0X) satt i utslippsbanen. I tillegg, epi-fluorescens (ikke TIR) mikroskopi må brukes for å få tilgang dype områder i de tykke prøver. Det er vist at kvanteprikker dynket dypt i sol-gels og i kaninøyne hornhinner (Z&gt; 200 mikrometer) kan lokaliseres med 2-3 nm presisjon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1083">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:211px;">Company</td>
			<td style="width:211px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:443px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Double-sided tape</td>
			<td style="width:211px;">3M</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td>~ 75 um thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:211px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:211px;">DU-897E-CS0-#BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td style="width:211px;">Branson</td>
			<td style="width:211px;">2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Fluorescence filter set</td>
			<td style="width:211px;">Chroma</td>
			<td style="width:211px;">49016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Actin polymerization buffer&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BSA02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Biotin G-actin</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">AB07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">G-actin&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">AKL95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">General actin buffer&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BSA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Laser shutter (with driver)</td>
			<td style="width:211px;">Electro-Optical Products Corp.&#160;</td>
			<td style="width:211px;">SH-10-MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">IDL</td>
			<td style="width:211px;">Exelis Visual Information Solutions</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Neutravidin&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">PI-31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Coverslip</td>
			<td style="width:211px;">Fisherbrand&#160;</td>
			<td style="width:211px;">22X30-1.5</td>
			<td>0.16-0.19 mm thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Microscope slide</td>
			<td style="width:211px;">Gold Seal Microslides&#160;</td>
			<td style="width:211px;">30103X1</td>
			<td>0.93-1.05 mm thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:211px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:211px;">PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Glass bottom dish&#160;</td>
			<td style="width:211px;">In Vitro Scientific</td>
			<td style="width:211px;">D35-20-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Cy3-DNA oligos</td>
			<td style="width:211px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td>5&#39;-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3&#39;Bio</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Fluorescent beads&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">T-7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Qdot 605-streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q10101MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Qdot605&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q21301MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Qdot705</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q22021MP&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Qdot705 Antibody Conjugation Kit</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q22061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Matlab</td>
			<td style="width:211px;">MathWorks</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Optical table</td>
			<td style="width:211px;">Newport Corp</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td>RS4000 Series</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">60X Objective</td>
			<td style="width:211px;">Nikon</td>
			<td style="width:211px;">Plan Apo VC 60x WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">100X Objective</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:211px;">PlanApo 100X/1.45 Oil &#8734;/0.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">60X Objective</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:211px;">UPlanApo 60X/1.20W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:211px;">IX71/IX70/IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Origin</td>
			<td style="width:211px;">OriginLab</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Anti-FLAG antibody</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">F7425-.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">ATP</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">BME&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">63689-25ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">BSA</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">BSA-biotin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">A8549-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">CK</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">C3755</td>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">CP</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P1937</td>
			<td>Phosphocreatine di(tris) salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">DTT</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">43815</td>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">EGTA</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">E3889</td>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">HCl&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">93363-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">KCl</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">MgCl2</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">NaCl</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">PCA</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">03930590</td>
			<td>Protocatechuic acid&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">PCD</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P8279</td>
			<td>Protocatechuate-3,4-dioxygenase&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">TMOS</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">341436-25G</td>
			<td>Tetramethyl orthosilicate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Tris-HCl&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Trolox</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">238813</td>
			<td>6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">1&#8221; diameter broadband dielectric mirrors with mounts</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BB1-E02, KM100</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">&#189;&#8221; diameter posts</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">TR4</td>
			<td>Quantity &#8805; 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">10x beam expander</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BE10M-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">2&#8221; diameter broadband dielectric mirrors with mounts</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BB2-E02, KM200</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">2&#8221; diameter f = 300 mm lens with mount</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">LA1256-A, LMR2</td>
			<td>TIR lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Fluorescent alignment target&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">VRC2SM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Laser safety goggles</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">LG3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">ND filter(s)</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">FW1AND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Optical beam profiler</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BP209-VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Post-mounted iris diaphragm</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">ID25</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Shearing interferometer</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">SI100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">XYZ translation stage, &#189;&#8221; travel&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">T12XYZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Laser</td>
			<td style="width:211px;">World Star Technologies&#160;</td>
			<td style="width:211px;">TECGL-30</td>
			<td>532 nm, 30 mW</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (fiona)

Fluorescens bildebehandling med én nanometer nøyaktighet (FIONA) er en enkel, men nyttig teknikk for lokalisering av enkelt fluoroforene med nanometerpresisjon i xy-planet. Her en oppsummering av FIONA teknikken er meldt og eksempler på forskning som er utført ved hjelp av FIONA beskrives kort. Først, hvordan sette opp nødvendig utstyr for FIONA eksperimenter, dvs. en total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM), med detaljer om justering av optikk, er beskrevet. Deretter hvordan man kan gjennomføre en enkel FIONA forsøket på å lokalisere immobilisert Cy3-DNA enkle molekyler ved hjelp av hensiktsmessige protokoller, etterfulgt av bruk av FIONA for å måle den 36 nm trinnstørrelsen for en enkelt avkortet myosin Va motor er merket med en prikk kvante, er illustrert. Endelig er siste forsøk på å utvide anvendelsen av FIONA til tykke prøver rapportert. Det er vist at ved hjelp av en vannimmersjonsobjektiv og kvanteprikker dynket dypt i sol-gel og kaninøyne hornhinner (&gt;200 mikrometer), lokaliseringspresisjon på 2-3 nm kan oppnås.

Et typisk mål-type TIRFM oppsettet er vist i figur 3.. Først ble overflate-immobilisert Cy3-DNA-prøven avbildes. Et typisk bilde er vist på figur 4a. Bildet ble tatt med eksponeringstid 0,5 sek, med EM gevinst = 50 og CCD følsomhet = 12.13 for kameraet. Den punkt-spredning-funksjon (PSF) av et enkelt Cy3-DNA-molekylet er vist i figur 4b (fra stedet indikert med pilen i figur 4a), hvor farge-bar viser skalaen piksel intensiteter. Den faktiske foton ...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA at JoVE.com

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Fluorescens Imaging med One-nanometer Nøyaktighet (FIONA)

Enkelt fluoroforene kan lokaliseres med nanometerpresisjon ved hjelp FIONA. Her en oppsummering av FIONA teknikken er rapportert, og hvordan å utføre FIONA eksperimenter er beskrevet.

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Rapid Analyse og Utforskning av fluorescens mikros Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisering Stromule Frequency med Fluorescensmikroskopi

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

Blandede primærkulturer av Murine tynntarmen Beregnet for studier av Gut hormon og Live Cell Imaging av Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescens utvinning etter Photobleaching av gule fluorescerende Protein merket p62 i Aggresome-lignende indusert strukturer

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...