Name: olfactory assays for mouse models of neurodegenerative disease
Uploaded: 2014-08-25T14:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease at JoVE.com

This protocol follows any and all animal care and use guidelines and regulations set by IACUC at the University of Cincinnati. This work is funded by NIH/NINDS NS07722 and the Gardner Family Center for Parkinson&#8217;s Disease and Movement Disorders.

프로토콜의 모든 단계는 동물 보호를 수행 신시내티 대학의 IACUC가 설정 한 가이드 라인과 규정을 사용합니다. 1 일반 고려 사항 <ol><li> 가능하면 어두운 사이클에서의 활성 단계에서 쥐를 테스트합니다. 일반적으로 어두운주기에 낮은 조명 적어도 1 시간에서 테스트를 수행합니다. 어둠 사이클 시험이 가능하지 않을 경우, 광주기 동안 모두 세 가지 테스트를 수행. 쥐가 자신의 수면주기 동안 시험 때 시간을 스니핑 감소시킬 수 있음을 알아 두셔야합니다. 참고 : 테스트는 수면주기 동안 수행 될 수 있지만 마우스가 묻혀 펠렛, 블록, 또는 향기 카트리지에 덜 관심을 표시 할 수 있습니다. </li><li> 외부 후각 큐들의 영향을 줄이기 각 시험 내내 항상 장갑의 염기쌍을 착용하고 각 마우스를 각각의 시험에 대한 염기쌍 장갑 위에 깨끗한 쌍을 배치하기 위하여. 의심의 장갑 깨끗한 세트에 넣어 원칙적으로. 장갑 한 상자가 읽게그들이 자주 변경되기 때문에 ILY 가능합니다. 참고 : 우리는 모든 동물 처리를 위해 니트릴 장갑을 사용합니다. </li><li> 시험 물질 및 살균제와 피사체 사이의 케이지를 클리닝 / 살균제도 질병 확산 가능성을 감소시킬뿐만 아니라 후각 원하지 않는 신호를 제거하기 위해이 테스트 전지의 중요한 단계이다. </li></ol> 2 매장 펠렛 테스트 <ol><li> 적어도 이일 실험 전에, 각 마우스의 무게를 기록하고 음식은 체중의 90 %로 제한한다. 시험 전에 및 음식 제한 동안 마우스에게 각 시험 동안 사용되는 펠릿의 1-2 개를 제공 (예를 들면, 청량 시리얼 편). 쥐가 음식 neophobic 그리고 그들은 이전에 알약을 먹게하지 않은 경우 시험 중에 펠렛를 검색 할 수 있기 때문에이 단계를 생략하지 마십시오. </li><li> 모든 테스트 일에, 아니 물 한 병 또는 공급 장치 B를 테스트 룸에서 자신의 새장을 배치하여 시험을하기 전에 1 시간 동안 마우스를 길들인치 필터 만 상단 뚜껑을 자신의 홈 케이지에서 그들을 집. </li><li> 습관화하는 동안, ~ 깨끗한 침구 침구 균일하게 케이지에 걸쳐 분산되어 특정 만들기 높은 3cm를 깨끗한 마우스 케이지를 입력합니다. 5 분 동안 타이머를 설정합니다. </li><li> 이 표시되지 않도록 습관화의 1 시간 후, 침대 아래에 하나 가당 시리얼 펠렛 0.5 cm 묻어. </li><li> 그 홈 케이지에서 테스트 마우스를 제거 테스트 케이지의 중앙에 배치, 케이지에 필터 상단 덮개를 놓고 타이머를 시작합니다. </li><li> 마우스가 펠렛을 폭로하고 그것을 먹고 시작하면 타이머를 중지합니다. 매장 펠렛을 발견하는 시간이 있습니다. </li><li> 마우스는 5 분 내에 펠렛을 찾지 못하는 경우, 시험을 종료하고 해당 마우스의 300 초 점수를 참고. 마우스가에 액세스 할 수 있도록 침대의 상단에 펠렛을 이동하고 마우스 펠렛을 먹을 수 있습니다. </li><li> 재판에 따라, 자신의 홈 케이지에 마우스를 반환합니다. </li><li> 테스트 케이지에서 침대를 비우고 C를 청소동물 방 청소 솔루션을 세. </li><li> 반복 각 마우스 2.9에 2.4 단계, 그리고 전에 각 마우스 후 장갑을 변경합니다. </li><li> 모든 생쥐는 실험 후, 그들에게 90 % 체중에서 그들을 유지하기에 충분한 음식을 제공한다. </li><li> 한 가지 예외가 시험 당일 1로 2-5 일에 같은 방법으로 테스트를 수행; 각 시험에 대한 케이지에서 다른 자리에 펠렛을 묻어. </li><li> 테스트 일 6 일, 표면 펠릿 시험을 수행합니다. </li><li> 표면 펠릿 시험의 경우, 대신에 침대 위에 이불 대신 그 아래에 펠렛을 매장의 테스트 일 1의 절차를 따릅니다. 마우스가 찾아 펠렛을 먹고 시작하는 시간을 기록한다. </li></ol> 3 블록 테스트 <ol><li> 개별적으로 깨끗한 케이지에 마우스를 수용하고 각 케이지를 설정하기 전에 장갑을 변경 (AE로 표시) 케이지에서 5 블록을 배치합니다. </li><li> 나중에 시험 24 시간을 수행합니다. , 시험 영역 시험 마우스를 이동 물 병 및 공급 장치 함을 제거하고 알을 배치리터 동물의 식별 표지 비닐 봉지에 침구의 소수와 함께 케이지에서 5 블록. 마우스의 홈 케이지의 상단에 밀봉 된 비닐 봉투를 놓습니다. </li><li> 시험을하기 전에 1 시간 동안 물 병, 피더 함없이 자신의 홈 케이지에 동물, 그리고 블록을 길들. </li><li> 냄새가 동물 / 블록 사이에 교환되지 않도록 각 케이지 사이에 장갑을 변경합니다. </li><li> 각 케이지 사이에 최소 10cm가있는 테이블에 서로 옆에 마우스 케이지를 라인업. 케이지 (되지 케이지의 긴 변)의 전면은 깨끗한 시야에 있도록 비디오 카메라를 배치. </li><li> 30 초 동안 타이머를 설정하고 중요한 실험 정보 (날짜, 마우스 ID, 재판 등) 카드를 레이블을 붙입니다. 비디오 테이프 2 ~ 3 초 동안 레이블입니다. </li><li> 그 마우스의 식별과 플라스틱 가방에서 블록 광고를 제거하고 명확하게 비디오 카메라에 볼 수 있도록 케이지의 중앙에 배치합니다. 확인이 ~ 1cm 오 확인각 블록 사이에 F 공간입니다. 케이지에 필터 상단을 다시 배치합니다. 30 초 동안 타이머와 비디오 테이프를 시작합니다. </li><li> 30 초 후, 녹음을 중지하고 케이지에서 블록을 제거하고 다시 비닐 봉지에 배치합니다. </li><li> 장갑을 변경 한 후 첫 번째 시험에 사용 된 것과 동일한 절차를 반복, 다음 마우스로 이동합니다. 각 마우스 ~ 5 분 간 시험 간격이 있는지 만들기위한 여섯 시험의 총에 대해이 작업을 수행합니다. </li><li> 일곱 번째 재판에서 대신 마우스에서 A, B, 그리고 C 블록에 노출되도록 다른 마우스의 케이지에서 블록 E를 추가 마우스 자신의 케이지에서 블록 D를 배치하는 것을 제외하고 시험 1-6에 대해 동일한 절차에 따라 그 다른 마우스의 케이지에서의 자신의 가정 케이지와 블록 E. 그 블록 E 각 마우스가 블록 E 각 마우스의 케이지 (예를 들어, ABCE 또는 AEBC)에 배치됩니다 및 대체에 노출되는 실험실 책에 있습니다. 원래 cagemate에서 동성하지만의 마우스에서 블록 E를 가져 가라. 바이올렛30 초 동안 deotape. </li><li> 7 시련에 따라, 원래 cagemates으로 새로운 깨끗한 케이지에 동물을 반환합니다. 청소 블록은 중성 세제와 물 시험에 사용하고 나중에 테스트에 사용하기 위해 공기 건조 할 수 있습니다. </li></ol> 4 요법 이니 / Dishabituation <ol><li> 블록 테스트와 유사한 방식으로 습관화 / dishabituation 테스트를 수행하는 대신 마우스의 냄새가 블록을 사용하는 추출물의 다른 쌍 향도면 채 조직 카트리지를 사용한다. </li><li> 대신 블록의 단일, 무향 조직 카트리지를 사용 단계 3.1-3.4를 수행합니다. </li><li> 테스트 룸에서 쥐를 길들. </li><li> 별도의 방에서 냄새가 조직 카트리지를 준비합니다. 깨끗한 카트리지에 작은 목화 공을 배치 한 다음면으로 추출물의 5 μL (예를 들어, 아몬드 추출물)를 추가합니다. 그 향기가 표시된 전용 상자 나 가방에면과 장소를 통해 카트리지 상단을 스냅. </li><li> 동일한 절차 F를 수행또는 초 향기 (예를 들어, 아니스 추출물). 서로 다른 냄새를 처리하는 사이에 장갑을 변경합니다. 목화 공을 완전히 조직 카트리지 쌌다되어 있는지 확인합니다. 참고 : 목화 공에서 노출 된 섬유는 동물이 중첩 목적이 아닌 향기 자체에 대한 목화 공에 관심이 될 수 있습니다. </li><li> 그런 다음 한 첫​​ 번째 여섯 시험에 대한 향수 조직 카트리지, 그리고 일곱 번째 재판에 대한 두 번째 향수 조직 카트리지를 사용하는 단계 3.6-3.10를 따릅니다. </li></ol> 비디오 테이프의 5 분석 <ol><li> 블록 및 습관화 / dishabituation 시험의 경우, 실험 조건에 레이터 블라인드가 블록 코 접점으로 정의 스니핑과 각 블록을 스니핑 소요되는 시간을 측정한다. 원하는 경우, 이러한 재판 (7) 및 전체 실험 기간 동안 활동 각 (길이 및 홈 케이지의 폭을 따라 만들어진 이동 횟수) 중에 신규 블록 (E)에 접근하는 시간에 따라 다른 동작을 측정한다. 스니핑 소요되는 시간을 점수D 시간은 스톱워치를 사용하여 비디오 테이프에서 접근합니다. </li><li> 마찬가지로, 습관화 / dishabituation 시험에, 실험 조건에 레이터 블라인드 카트리지 및 운동 활성 접근하는 카트리지, 시간 스니핑 소요되는 시간을 측정한다. </li></ol> 6 통계 <ol><li> 대기 시간 점수 분산 얼룩이 보여 경향 펠렛을 알 수 있기 때문에 비모수 통계를 이용하여 매립 된 펠릿을 시험 분석. 맨 - 휘트니 U-test를 이용하여 쥐의 그룹 간 비교 후 3-5 일에 걸쳐 펠렛을 찾아 할 수있는 대기 시간을 평균. 마찬가지로, 테스트 표면 펠릿의 경우, 유전자형과 비교 만 - 휘트니 (Mann-Whitney) U-test를 이용하여 펠렛을 찾는 지연을 분석한다. </li><li> 블록 시험의 경우, 시험 칠 (소설 냄새가 블록의 소개)의 데이터를 분석 할 수 있습니다. 일반적으로, 분산의 이질성을 설명하기 위해 비모수 적 분석을 사용한다. 시간의 차이를 분석하기 위해 제 스니핑 보냈다전자 소설 블록은 물론 다른 실험군에 대해 블록을 접근하는 시간으로서, 맨 - 휘트니 U 시험을 사용한다. 친숙한 블록을 스니핑 소요되는 시간에 새로운 블록을 스니핑 소요되는 시간을 비교하기 위해 윌 콕슨 부호 순위 테스트를 사용합니다. </li><li> 습관화 / dishabituation의 테스트를 위해 실시 파라 메트릭 시험 이전의 연구 (20)과 유사 하나, 6, 7에 분석합니다. 마우스가 더 스니핑 (sniffing)에 조금 보이면, 비모수 분석을 사용합니다. </li></ol>

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We have no conflicts of interest.

이 연구에 기술 된 시험의 각 마우스에서 후각 기능의 다양한 측면을 측정한다. 매장 펠릿 시험은 침대 밑에 매장 가당 시리얼의 입에 조각을 진단 (제한 음식이 아닌 음식 박탈) 배고픈의 능력 쥐를 테스트, 후각의 음식 동기 부여 측면을 측정합니다. 블록 테스트 자신 향기 conspecific의 구별하는 마우스의 능력을 시험, 후각 기능의 사회적 형태를 더 측정한다. 습관화 / dishabituation 테스트, 친숙하고 새로운 무해한 냄새를 구별 할 수있는 마우스의 능력을 평가한다. 음식 동기 부여 공포에 이상이 대조군에 비해 돌연변이 생쥐에서 관찰 된 차이에 기여할 수 있기 때문에 새 모델을 특성화 여러 테스트를 사용하는 것이 중요합니다. 단 블록 테스트가 수행되고 다른 마우스의 악취는 관찰했다 블록의 냄새 감소하는 경우, 예를 들어, 그것은 olfact가 있는지 불분명모리 적자 또는 블록의 회피로 이어질 수 conspecific에 강화 된 공포 반응. 여러 테스트를 수행하고 적자가 모든 시험에서 관찰 할 때, 강하게 후각 장애의 해석을 지원합니다. 차이가 있지만 다른 하나의 시험에서 관찰되는 경우, 다음이 더 미묘한 후각 장애의 경우가 있습니다 만, 그것은 다른 설명을 배제하는 것이 필수적이 될 것이다 (즉, 강화 된 두려움이나 감소 식품 동기 부여). 후각 기능 쥐를 테스트 할 때 명심해야 할 추가 중요한 요소는 마우스의 배경 변형, 성별을 포함한다. 다른 유전 적 배경 균주 (예, C57BL / 6, DBA 등)이 전체 실험을 수행하기 전에 같은 배경의 야생형 마우스의 각 프로토콜을 적용하는 것이 좋습니다 따라서 마우스의 행동에 지대한 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 남성 후각 시스템이 높기 때문에 그 암수 마우스는 서로 별개로 테스트 될 권장발정에서 여성의 발정과 후각 탐지 여성에 민감한 LY는 세 가지 테스트에서 성능을 방해 할 수 있습니다. 일부 단계는 마우스의 후각을 테스트 할 때 따라야 할 절대적으로 중요하다. 이 실험은 동물에게 소개하고 냄새를 인식하는 것이 중요합니다. 절차 장갑을 착용하는 것은 동물 사이의 장갑 필수적이고 자주 변화가 필요하다. 항상 후각 테스트 일에 향수 또는 향수를 착용하지 않는 실험을위한 좋은 방법입니다. 절차의 일부가 유연성이있는 반면, 검사의 유효성 또는 감도를 저하시키지 않고 수정되고 적응 될 수있는 다른 부분이있다. 예를 들어 습관화 된 시도 횟수가 증가 될 수 또는 마우스의 변형에 따라 시험되고 감소하는 속도가 자극에 길들. 이러한 테스트의 주요 제한은 그들은 모두 동기 부여의 형태에 의해 주도된다는 것입니다, 그것을 음식 또는 사회 만들기를 할 수변경된 응답을 관찰 할 때 어려운 완전히 설명으로 의욕에 이상 현상을 배제합니다. 이것은 테스트 및 자극을 접근하는 동안 이러한 활동과 같은 추가 파라미터를 분석함으로써 최소화 될 수있다. 마스터 일단 테스트 용이 신경 퇴행성 질환의 신규 한 마우스 모델의 표현형 검사에 사용될 수있다. 또한, 가장 높은 능력을 가지고 테스트를 테스트 잠재적 치료제 전임상 연구에 포함될 수있다 (예컨대 REF 참조. 25).

후각 장애는 파킨슨 병 (PD), 알츠하이머 병 및 헌팅 톤병을 포함 하나 신경 퇴행성 질환의 수에 연결된다. PD에서 후각 장애는 냄새 식별, 탐지 및 차별의 적자를 포함하고 환자 2-5 70 내지 95 %까지에서 발견된다. 이러한 적자는 후각 장애는 PD 6-10의 초기 단계 신호를 수 있음을 나타내는 최대 4 년까지 PD의 추기경 운동 증상에 선행 할 수 있습니다. PD의 후각 적자의 초기 발생은 후각 기능 장애에 관심과 참여 기전을 주도하고있다. 설치류에 전임상 연구에서 후각 장애는 새로운 치료 전략의 치료 가능성을 예측하는 중요한 결과 측정 될 수있다. 많은 실험 설계 및 광범위 PD의 설치류 모델과 TES에 감각 손상을 특성화하는데 사용되어왔다소설 치료 11-15의 치료 가능성을 t. 후각 적자가 잘 PD에 설명되어 있지만, 후각 기능은 일상적으로 많은 모델에서 측정되지 않았습니다. 이보기는 PD의 유전 양식의 발견과 PD 단지 감각 기능 이상에 영향을 미치는 전신 질환이 있음을 더 허용 개념과 불구하고 변화하고 있습니다. 현재, 지금 특성화 16-24에서 후각의 분석을 포함 PD 및 기타 신경 퇴행성 질환의 유전 마우스 모델에서 많은 연구가있다. 신경 퇴행성 질환에서 후각 장애의 관심 증가를 감안 전임상 연구에서 신경 퇴행의 신규 모델뿐만 아니라 시험 전위 질병 변경 요법을 특성화하는데 사용될 수있는 후각 시험 전지를 조립하기 위해 노력했다. 본 연구에 설명 된 테스트가 특성화 및 전임상 연구 18,25 모두에서 사용되어왔다. 테스트 highl본 연구에서 ighted 파킨슨 병 (18)의 자주 이용 알파 시누 클레인 과발현 마우스 모델에서 후각 장애 검출에 민감한 것으로 나타났다. 그들은 매장 펠릿 시험 (26, 27), 블록 테스트 23,24,28,29의 적응 버전 및 습관화 / dishabituation 테스트 (30)을 포함한다. 그것은 생쥐의 후각 기능의 중요한 조치 아르 본 연구에 설명 된 테스트의 몇 가지 적응이 있다는 것을 주목하는 것이 중요하다,이 연구에서 강조하는 사람이 시험은 실험실이 함께 가장 경험이 일상적으로 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="352">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Cap&#39;n Crunch</td>
			<td style="width:88px;">Quaker Oats</td>
			<td align="right" style="width:88px;">3E+10</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Wooden Blocks</td>
			<td style="width:88px;">Lara&#8217;s Crafts</td>
			<td align="right" style="width:88px;">10144</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="379" rowspan="6" style="height:379px;width:88px;">Flavor Extracts</td>
			<td rowspan="6" style="width:88px;">Kroger</td>
			<td style="width:88px;">Almond: 011110664716</td>
			<td rowspan="6" style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Anise: 011110615619</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Banana: 011110669919</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Coconut: 011110669889</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Lemon: 011110669957</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:88px;">Orange: 0011110669964</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="59" rowspan="2" style="height:59px;width:88px;">Tissue Cartridges</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Z672122-500EA</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Manufactured by Simport no: M490-2</td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Cotton Balls</td>
			<td style="width:88px;">Kroger</td>
			<td align="right" style="width:88px;">1.1111E+10</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Mouse Cages</td>
			<td style="width:88px;">Ancare</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;">19 x 29 x 12.7 cm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Camcorder</td>
			<td style="width:88px;">Sony</td>
			<td style="width:88px;">&#160;HDR-HC9</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">MiniDV Tapes</td>
			<td style="width:88px;">Sony DVC premium</td>
			<td align="right" style="width:88px;">2.7243E+10</td>
			<td style="width:88px;">60 minute long play&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

olfactory assays for mouse models of neurodegenerative disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

매장 펠렛, 블록, 및 습관화 / dishabituation 테스트는 모든 생쥐의 후각의 매우 유리 평가입니다. 이 테스트를 사용하여, 우리는 알파 - 시누 클레인의 과발현 (Thy1-aSyn) 18 Atp13a2 녹아웃 마우스를 포함하여 파킨슨 병의 여러 유전자 ​​마우스 모델에서 후각에 큰 변화를 발견했다. 두 Thy1-aSyn 및 Atp13a2 녹아웃 마우스는. 컨트롤 (18)보다 매장 펠렛을 검색하는 데 시간이 오래 걸릴 야생형 및 Atp13a2 녹아웃 마우스에서 수집 1-3은 데이터를 수치입니다. 매장 펠릿 테스트에서, Atp13a2 녹아웃 마우스는 야생형 제어 마우스 (그림 1)에 비해 매장 펠렛을 찾기 위해 대기 시간은 커지고있다. 블록 테스트에서 야생형 및 Atp13a2 녹아웃 마우스는 모두 자신의 홈 케이지 (그림 2)에서 블록에 비해 다른 마우스의 케이지에서 새로운 블록을 도청. 습관화 / dishabituation 테스트 야생형 생쥐에서 한 냄새에 습관화를 표시하고<html> 다음 소설 냄새가 (그림 3)을 도입 할 때 스니핑 증가했다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51804/51804fig1highres.jpg" width="500" /> 펠릿 시험. 대기 시간 매장 그림 1은 야생형에서 (N = 10)와 Atp13a2 KO (N = 14) 나이 20-27미터에서 펠렛을 찾을 수 있습니다. * P &lt;0.05, 맨 - 휘트니 U. <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51804/51804fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2 블록 테스트 시간은 야생형에 블록 시험에서 새로운 블록 (E)를 스니핑 (N = 10)와 Atp13a2 KO (N = 12) 20에서 여성 마우스 -. 나이 27 남성. ΔΔ 동일 유전자형에서 블록 A, B 및 C에 비해 P는 &lt;0.01 나타낸다. 맨 - 휘트니 U. &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 51,804 / 51804fig3highres.jpg &quot;너비 =&quot;500 &quot;/&gt; 그림 3 습관화 / dishabituation 테스트. (= 7 N 세 9m)에서 6 시련과 시험 7에 새로운 향기 카트리지의 도입을 시간 야생형 마우스의 향기 카트리지를 스니핑 평균.

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Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

신경 퇴행성 질환의 마우스 모델에 대한 후각 분석 실험

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

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Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature infants and the most common antecedent of cerebral palsy. PVL is characterized by periventricular white matter damage with prominent oligodendroglial injury. Hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation are the primary causes of PVL. We use P6 mice to create models of neonatal brain injury by the induction of hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation with unilateral carotid ligation followed by exposure to hypoxia with or without injection of the endotoxin lipopolysaccharide (LPS). Immunohistochemistry of myelin basic protein (MBP) or O1 and electron microscopic examination show prominent myelin loss in cerebral white matter with additional damage to the hippocampus and thalamus. Establishment of mouse models of PVL will greatly facilitate the study of disease pathogenesis using available transgenic mouse strains, conduction of drug trials in a relatively high throughput manner to identify candidate therapeutic agents, and testing of stem cell transplantation using immunodeficiency mouse strains.

We established mouse models of periventricular leukomalacia (PVL), the predominant brain injury in premature infants characterized by periventricular white matter lesions. Hypoxia/ischemia with/without systemic infection are the primary causes of PVL. Unilateral carotid ligation and hypoxia exposure with/without lipopolysaccharide injection creates PVL-like lesions in P6 mice.

Periventricular Leukomalacia의 마우스 모델

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature ...

연구

신경과학

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

내생 NADH 형광의 2 광자 이미징에 의한 마우스 대뇌 피질의 Microregional Hypoxia의 탐지

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

에 신약 표현형을 평가<em&gt; 초파리</em&gt; 등산 분석 실험에 의한 도파민 뉴런과 뇌 전체의 면역 염색

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

의 시냅틱 변조 분석<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 장시간 빛에 노출 후 광수

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay between perturbed BBB homeostasis and the pathogenesis of brain disorders needs further investigation, the development and validation of a reliable procedure to accurately detect BBB alterations may be crucial and represent a useful tool for potentially predicting disease progression and developing targeted therapeutic strategies.
Here, we present an easy and efficient procedure for evaluating BBB leakage in a neurodegenerative condition like that occurring in a preclinical mouse model of Huntington disease, in which defects in the permeability of BBB are clearly detectable precociously in the disease. Specifically, the high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin, which is able to cross the BBB only when the latter is impaired, is acutely infused into a mouse jugular vein and its distribution in the vascular or parenchymal districts is then determined by fluorescence microscopy.
Accumulation of green fluorescent-albumin in the brain parenchyma functions as an index of aberrant BBB permeability and, when quantitated by using Image J processing software, is reported as Green Fluorescence Intensity.

In this study, we present an easy and efficient procedure for evaluating the disruption of the blood-brain barrier under neurodegenerative conditions. To achieve our objective, we infused high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin into mouse jugular vein and evaluated its leakage into the brain parenchyma by fluorescence microscopy.

FITC 표시 된 알 부 민 신경 질환의 마우스 모델에서의 정 맥 주입에 의해 혈액-뇌 장벽 침투성의 평가

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

초파리 에서 신경 돌기 Arborization 복잡성의 정량 분석

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...