Name: organotypic slice cultures to study oligodendrocyte dynamics and myelination
Uploaded: 2014-08-25T15:00:00
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This work was funded by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG4179 to A.N.), the National Institutes of Health (NIH R01NS073425 and R01NS074870 to A.N.) and the National Science Foundation (A.N.). We thank Dr. Frank Kirchhoff (University of Saarland, Homburg Germany) for providing PLPDsRed transgenic mice. We thank Youfen Sun for her assistance in maintaining the transgenic mouse colony.

नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं दिशा निर्देशों का पालन कर रहे हैं और कनेक्टिकट विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है. नोट: YFP रिपोर्टर 20 (JAX # 006148) लाइनों क्रमशः इस्?...

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	<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).</li><li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures+for+long-term+live+imaging.">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine:+a+neuron-glial+transmitter+promoting+myelination+in+the+CNS+in+response+to+action+potentials.">Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials.</a> Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).</li><li>Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+local+protein+synthesis+and+initial+events+in+myelination+by+action+potentials.">Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials.</a> Science. 333 (6049), 1647-1651 (2011).</li><li>Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+geometric+and+spatial+constraints+of+the+microenvironment+induce+oligodendrocyte+differentiation.">The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).</li></ol>

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में myelination कुशल न्यूरोनल संचार और axonal अस्तित्व 22 के लिए आवश्यक है. 25 - सबसे मस्तिष्क क्षेत्रों 16,23 में एक निवासी आबादी को बनाए रखते हुए NG2 कोशिकाओं लगातार वयस्कता में myelinating ...

4 - केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की Organoytpic टुकड़ा संस्कृतियों एक semiintact प्रणाली 1 में न्यूरॉन और glial कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए अत्यंत उपयोगी साबित किया है. 9 - इन संस्कृतियों को अपनाने और ऐसे बाह्य वातावरण के हेरफेर और दोहराया लंबे समय तक जीना सेल इमेजिंग के लिए आसान पहुँच और electrophysiological रिकॉर्डिंग के रूप में 5 प्राथमिक अलग सेल संस्कृतियों के कई लाभ को बनाए रखने के लिए अपेक्षाकृत आसान है. इसके अलावा, टुकड़ा संस्कृतियों 3 आयामी ऊतक cytoarchitecture, क्षेत्रीय तंत्रिका कनेक्टिविटी बनाए रखने, और सबसे प्रमुख प्रकार की कोशिकाओं प्रणाली में मौजूद हैं. इन गुणों के सेलुलर और पर्यावरण बातचीत के साथ एकल कक्ष व्यवहार और शरीर विज्ञान की जांच के लिए इन संस्कृतियों एक अद्वितीय और सुविधाजनक प्रणाली बनाने. NG2 कोशिकाओं पैदा करना और एम उत्पन्न करने के लिए जारी है कि स्तनधारी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में glial कोशिकाओं की आबादी हैंभ्रूण और प्रसव के बाद विकास 10 के दौरान oligodendrocytes yelinating. वे बड़े पैमाने पर अलग प्राथमिक सेल संस्कृतियों में अध्ययन किया गया है, और फ्लोरोसेंट प्रोटीन का NG2 सेल विशिष्ट अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की हाल ही में विकास तीव्र टुकड़ा तैयारी में विवो भाग्य मानचित्रण और electrophysiological रिकॉर्डिंग में मदद की है. यहां तक ​​कि इन अध्ययनों के साथ, थोड़ा NG2 सेल प्रसार और oligodendrocyte भेदभाव का लौकिक गतिशीलता के बारे में जाना जाता है. अलग सेल संस्कृति को व्यापक रूप से औषधीय और आनुवंशिक जोड़तोड़ में रिश्तेदार की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जाता है, यह यह सेलुलर microenvironment के संदर्भ बनाए रखने के लिए वांछनीय है, विशेष रूप से जब अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में इन कोशिकाओं के कार्यात्मक मतभेद पूछताछ के लिए उपयुक्त नहीं है. टुकड़ा संस्कृतियों, सेल औषधीय जोड़तोड़ करने के लिए उत्तरदायी है और oligodendrocyte myelination 11,12 जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक सरल विकल्प प्रदान(LPC) lysolecithin या एंटीबॉडी औषधीय उपचार 15 के माध्यम से demyelination 13,14, और remyelination की प्रेरण प्रेरित बाद ular प्रतिक्रिया. एक विधि की जांच और लाइव इमेजिंग और तय ऊतक (या postfixation) अग्रमस्तिष्क और सेरिबैलम दोनों से लिया organotypic टुकड़ा संस्कृतियों में NG2 सेल प्रसार और oligodendrocyte भेदभाव का विश्लेषण वर्णित है प्रदर्शन करने के लिए. इस डिवीजन 16 के बाद ही NG2 कोशिकाओं के सेल भाग्य का अध्ययन करने और वृद्धि कारक प्रेरित NG2 सेल प्रसार 17 में region- और उम्र पर निर्भर मतभेदों को खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक शक्तिशाली तरीका है. यह अपेक्षाकृत सरल तकनीक आगे आंतरिक और / या पर्यावरण इन glial कोशिकाओं के शरीर विज्ञान और neuronal गतिविधि या माइलिन क्षति के लिए उनकी प्रतिक्रिया को विनियमित तंत्र सेल की जांच के लिए व्यापक रूप से सुलभ है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Slice Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11090</td>
			<td>50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14175</td>
			<td>25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-4034</td>
			<td>25mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
			<td>1mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6634</td>
			<td>1mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-0278</td>
			<td>0.4mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30074.03</td>
			<td>25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissection Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>124mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td>3.004mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>1.25mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 (anhydrous)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>4.004mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>26mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-0278</td>
			<td>2.0mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4036</td>
			<td>0.075mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Other Reagents and Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-hydroxy tamoxifen (4OHT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904</td>
			<td>100nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>19200</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-6027</td>
			<td>0.1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Metaperiodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-1878</td>
			<td>0.01M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti NG2 antibody</td>
			<td>Chemicon (Millipore)</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti CC1 antibody</td>
			<td>Calbiochem (Millipore)</td>
			<td>OP80</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti Ki67 antibody</td>
			<td>Vision Biosystems</td>
			<td>NCL-Ki67-MM1</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti NeuN antibody</td>
			<td>Chemicon (Millipore)</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Species specific secondary antibodies</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture membrane inserts 0.45&#956;m pore size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-25E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2 5% CO2 gas mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile six well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual or automatic tissue chopper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm and 60mm sterile Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Phase Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microcope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic slice cultures to study oligodendrocyte dynamics and myelination

NG2 व्यक्त कोशिकाओं (polydendrocytes, oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में चौथा प्रमुख glial सेल आबादी हैं. भ्रूण और प्रसव के बाद विकास के दौरान वे सक्रिय रूप से पैदा करना और myelinating oligodendrocytes उत्पन्न करते हैं. इन कोशिकाओं को आमतौर पर प्राथमिक अलग संस्कृतियों, न्यूरॉन cocultures में अध्ययन किया, और तय ऊतक में किया गया है. का प्रयोग नव उपलब्ध ट्रांसजेनिक माउस लाइनों संस्कृति प्रणालियों अग्रमस्तिष्क और सेरिबैलम के दोनों ग्रे और सफेद पदार्थ क्षेत्रों में oligodendrocyte वंश कोशिकाओं के प्रसार और भेदभाव की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता टुकड़ा. टुकड़ा संस्कृतियों जल्दी प्रसव के बाद चूहों से तैयार कर रहे हैं और 1 महीने तक के लिए संस्कृति में रखा जाता है. ये स्लाइस सेलुलर व्यवहार और बातचीत की जांच के लिए संस्कृति की अवधि में कई बार imaged किया जा सकता है. इस विधि NG2 कोशिका विभाजन के दृश्य और का विस्तृत विश्लेषण को सक्षम करते हुए oligodendrocyte भेदभाव के लिए प्रमुख कदम क्षेत्रवार निर्भर अनुमति देता हैईएनटी NG2 सेल और oligodendrocyte कार्यात्मक विविधता. इस बारीकी से vivo में पाया कि जैसा एक सेलुलर वातावरण में समय के साथ इन कोशिकाओं को प्रभावित आंतरिक और बाह्य संकेत जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक शक्तिशाली तकनीक है.

प्रतिनिधि डेटा के उदाहरण नीचे दिए गए हैं P8 NG2cre के अग्रमस्तिष्क और सेरिबैलम दोनों से टुकड़ा संस्कृतियों का उपयोग कर प्राप्त किया गया है कि: ZEG, NG2creER: YFP और ट्रांसजेनिक माउस लाइनों PLPDsRed. NG2 कोशिकाओं अग्रमस्तिष्?...

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Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotypic स्लाइस संस्कृति Oligodendrocyte गतिशीलता और myelination अध्ययन

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Neuronal चोट की जांच करने के लिए Organotypic hippocampal स्लाइस संस्कृति मॉडल

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypic hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic अनुमस्तिष्क संस्कृति: apoptotic चुनौतियां और जांच

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

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Neocortex की एक Organotypic स्लाइस तैयारी से पूरे सेल रिकॉर्डिंग

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

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The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

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Oligodendrocyte संस्कृति समृद्ध और Oligodendrocyte न्यूरॉन / डाक प्रसव murine ऊतकों से सह संस्कृतियों Myelinating की व्युत्पत्ति

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

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The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

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में neurovascular remodeling के विश्लेषण Entorhino-हिप्पोकैम्पस Organotypic स्लाइस संस्कृति

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic हिप्पोकैम्पस एक मॉडल के रूप में Neuroprotection और ट्यूमर कोशिकाओं की इनवेसिव अध्ययन के लिए संस्कृतियों स्लाइस

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...