Name: tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy
Uploaded: 2014-10-13T14:00:00
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A bondade ea generosidade do Dr. Kent McDonald da UC Berkeley são muito apreciados. Agradecemos a um revisor anônimo para sugestões muito úteis. O laboratório de Burch-Smith é apoiado por fundos de arranque da Universidade de Tennessee.

NOTA: O procedimento QFS requer extremo cuidado e cautela por parte do utilizador e destacamos estas precauções de segurança aqui como Precauções e Notas, onde aplicáveis. 1.Preparation para HPF Run <ol><li> Antes de iniciar a preparação da amostra, ligar o congelador de alta pressão, seguindo as instruções do fabricante. NOTA: A unidade HPF utilizado neste protocolo é um Wohlwend Compact 02 unidade (Figura 1A), e leva cerca de uma a uma hora e meia de p...

<ol>
	<li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution.">Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).</li><li>Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing+of+soybean+nodules+leads+to+an+improved+preservation+of+ultrastructure.">High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure.</a> Planta. 188, 155-163 (1992).</li><li>Bowers, B. a. M. M., Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+2.">Ch 2.</a> Artifacts in Biological Electron Microscopy. 2, 13-42 (1988).</li><li>Mollenhauer, H. H., Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+3.">Ch 3.</a> Artifacts in Biological Electron Microscopy. , 43-64 (1988).</li><li>Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+ultrastructure+of+conventionally+fixed+and+high+pressure+frozen/freeze+substituted+root+tips+of+Nicotiana+and+Arabidopsis.">Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis.</a> Protoplasma. 157, 64-74 (1990).</li><li>Moor, H., Steinbrecht, R. A., Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 175-191 (1987).</li><li>Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close-to-native+ultrastructural+preservation+by+high+pressure+freezing.">Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing.</a> Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).</li><li>Dahl, R., Staehelin, L. 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Z., McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+immunocytochemistry+following+cryofixation+and+freeze+substitution.">Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution.</a> Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).</li><li>Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomographic+analysis+of+somatic+cell+plate+formation+in+meristematic+cells+of+Arabidopsis+preserved+by+high-pressure+freezing.">Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing.</a> The Plant cell. 16, 836-856 (2004).</li><li>Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=INCREASED+SIZE+EXCLUSION+LIMIT+encodes+a+putative+DEVH+box+RNA+helicase+involved+in+plasmodesmata+function+during+Arabidopsis+embryogenesis.">INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis.</a> The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).</li><li>Austin, J. R., 2nd, L. A., Staehelin, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+architecture+of+grana+and+stroma+thylakoids+of+higher+plants+as+determined+by+electron+tomography.">Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography.</a> Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).</li><li>McDonald, K. L., Webb, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+substitution+in+3+hours+or+less.">Freeze substitution in 3 hours or less.</a> Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).</li><li>Taiz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Plant+Vacuole.">The Plant Vacuole.</a> The Journal of experimental biology. , 172-1113 (1992).</li><li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes.">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).</li><li>Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substructure+of+freeze-substituted+plasmodesmata.">Substructure of freeze-substituted plasmodesmata.</a> Protoplasma. 169, 28-41 (1992).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Embedding+Methods+into+Epoxy+and+LR+White+Resins+for+Morphological+and+Immunological+Analysis+of+Cryofixed+Biological+Specimens.">Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens.</a> Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).</li><li>McDonald, K. L., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing,+cellular+tomography,+and+structural+cell+biology.">High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology.</a> BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).</li><li>Spiegelhalter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+dynamic+live+cell+imaging+to+3D+ultrastructure+novel+integrated+methods+for+high+pressure+freezing+and+correlative+light-electron+microscopy.">From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy.</a> PloS one. 5, e9014 (2010).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).</li></ol>

O sucesso do protocolo aqui apresentado depende fortemente do utilizador. Em primeiro lugar, a preparação avançada é necessária para garantir que todos os materiais necessários estão prontamente disponíveis e em quantidade suficiente para completar uma corrida HPF-QFS. Em segundo lugar, o utilizador deve trabalhar rapidamente, passando de passo-a-passo de uma forma eficiente que minimiza o manuseamento das amostras, minimizando, assim, alterações no estado do tecido nativo. Uma vez que as amostras são congela...

Nosso conhecimento da ultra-estrutura celular vem principalmente de microscopia eletrônica, que pode resolver detalhes da ordem de alguns nanômetros 1. Apesar de ser tão poderosa na resolução TEM não é considerado user-friendly, como a preparação da amostra requer protocolos laboriosos demorado e, e exige algum conhecimento do praticante. Fixação tradicional das amostras foi combinado o uso de aldeídos e tetróxido de ósmio antes de processamento adicional, que inclui a desidratação, a incorporação em resina e, em seguida, o corte para produzir cortes ultra-finos que são depois coradas com metais pesados. No entanto, é sabido que a fixação química pode produzir artefactos, incluindo a agregação da proteína e a perda de lípidos 1, e muda-se para membranas que, em última instância afectam vários compartimentos celulares 2. Esses artefatos são em grande parte atribuída à baixa taxa de fixação e desidratação à temperatura ambiente 3, 4, 5. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; criofixação por alta pressão congelamento (HPF) evita a maioria dos artefatos causados ​​por fixação química. O princípio de criofixação é que baixa o ponto de congelação da água por 20 graus, retarda a nucleação e crescimento de cristais de gelo e aumenta a viscosidade da água, em uma amostra biológica de modo a que os constituintes celulares são essencialmente imobilizada 6, 7. HPF diminui um temperatura da amostra com a de azoto líquido, sob uma pressão muito elevada (210 MPa ou 2100 bar), em milissegundos. Quando feito corretamente HPF impede a formação de grandes cristais de gelo que podem causar grandes danos à ultra-estrutura celular. HPF pode ser utilizado para fixar as amostras de espessura de 100-200 uM para concentrações típicas de solutos biológicos 7. Existem inúmeros comentários sobre a física e os princípios subjacentes HPF, por exemplo, 1, 7, 8. Após HPF, as amostras são incubadas a uma temperatura baixa (-78,5 ° C a -90 &amp;# 176; C) na presença de solventes orgânicos líquidos contendo fixadores químicos como o tetróxido de ósmio, geralmente durante alguns dias. A esta temperatura baixa, a água na amostra é substituída pelo solvente orgânico, tipicamente acetona ou metanol a 1, 9. Assim, este processo é chamado de substituição congelamento (FS). A amostra é, em seguida, aqueceu-se gradualmente e, durante esse tempo é fixo, geralmente com tetróxido de ósmio e acetato de uranilo 9. A reticulação a baixas temperaturas tem a vantagem de fixar moléculas que são imobilizadas 1. FS, por conseguinte, produz amostras de qualidade superior em comparação com as fixadas por fixação química convencional à temperatura ambiente, em particular, que resulta em melhor preservação ultraestrutural, melhor preservação da antigenicidade e perda de componentes celulares não ligadas 10, 11 reduzida. A maioria dos FS é realizada durante períodos de tempo longos, tipicamente até vários dias. Isto é particularmente true para as plantas amostras 12, 13, 14. Um protocolo recente desenvolvido por McDonald e Webb reduz grandemente o tempo de FS de alguns dias a algumas horas e 15. Em seu procedimento rápido congelamento de substituição (QFS), FS é realizada ao longo de 3 horas, enquanto nos FS super-rápidas (SQFS) amostras são processadas em 90 minutos. A qualidade das amostras produzidas por estes métodos é comparável aos produzidos por protocolos tradicionais FS. Adotamos o protocolo QFS para processamento posterior de amostras de plantas depois de HPF. Isto tem provado para salvar não apenas tempo, mas também dinheiro, como QFS e SQFS usar equipamentos de laboratório comum, em vez das caras máquinas FS disponíveis no mercado. Tecidos vegetais são frequentemente muito difícil de se preparar para TEM. Em média, as células vegetais são maiores do que a utilização de células bacterianas ou animais. A presença da cutícula cerosa hidrofóbico, paredes celulares espessas, de grandes vacúolos cheios de água contendo ácidos orgânicos, hidrolases e fenólico compounds que podem ocupar cerca de 90% do volume total da célula 16, e a presença de espaços gaseificadas diminui severamente a condutividade de calor do sistema 17. Além disso, no caso de plantas, a espessura da amostra quase sempre superior a 20 um, o limite para a utilização da fixação química. A estas espessuras, a baixa condutividade térmica da água impede uma taxa de congelamento mais de -10.000 ° C / s no centro da amostra. Essa taxa é necessária para evitar a formação de gelo hexagonal prejudicial (cristais de gelo com uma menor densidade e maior do que 10 a 15 nm) 8. Juntos, estes apresentam desafios para ambos congelação adequada da amostra e FS subsequentes. No entanto, criofixação é o melhor método para a fixação de amostras de plantas. Aqui, um protocolo de HPF-QFS de amostras de tecido de plantas é apresentada. Centra-se na Arabidopsis thaliana espécies modelo, mas também tem sido usado com Nicotiana benthamiana. Os resultados demonstram que os típicos HPF-QFS produz samples de qualidade comparável às tradicionais HPF-FS em uma fração do tempo. Com ajustes apropriados, este protocolo pode também ser utilizado para outras amostras biológicas relativamente espessas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1070">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:245px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">HPF02</td>
			<td>With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display&#160; of freezing parameters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">241-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">242-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20</td>
			<td style="width:245px;">Chart</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Baker&#39;s yeast</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Tooth picks</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Thermocouple data logger EL-USB-TC</td>
			<td style="width:245px;">OMEGA Engineering Inc.</td>
			<td style="width:119px;">OM-EL-USB-TC&#160;</td>
			<td>Replacement battery purchased separately</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">34505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Heater block 12/13 mm</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Rotary shaker</td>
			<td style="width:245px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-402-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Leaf punch - Harris Uni-core 2.00</td>
			<td style="width:245px;">Ted-Pella Inc.</td>
			<td style="width:119px;">15076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Pink dental wax</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Cryogenic vials 2 mL</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">61802-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Methanol</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Blow dryer</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Dry ice</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Acetone</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Forceps</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Several pairs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy

Uma vez que a microscopia eletrônica de transmissão de 1940 (TEM) tem vindo a fornecer os biólogos com imagens ultra-alta resolução de materiais biológicos. No entanto, por causa de protocolos trabalhosas e demoradas, que também exigem experiência na preparação de amostras, sem efeitos artificiais, TEM não é considerado uma técnica de fácil utilização. Preparação de amostras para TEM tradicional usado fixadores químicos para preservar estruturas celulares. Congelamento de alta pressão é o criofixação de amostras biológicas sob pressões elevadas para produzir velocidades de arrefecimento muito rápido, restringindo, assim, a formação de gelo, o que é prejudicial para a integridade da ultra-estrutura celular. Congelamento de alta pressão e congelamento de substituição é o método de escolha para produzir a morfologia mais alta qualidade em seções de resina para TEM. Estes métodos minimizar os artefatos normalmente associadas com o processamento convencional para TEM de seções finas. Após criofixação a água congelada nas amostras é substituído por líquidosolvente orgânico a temperaturas baixas, de um processo chamado de substituição congelamento. Substituição por congelação é tipicamente levada a cabo ao longo de vários dias em dedicado, equipamento dispendioso. Uma inovação recente permite que o processo seja concluído em três horas, em vez dos habituais dois dias. Isso normalmente é seguida por vários dias de preparação da amostra, que inclui infiltração e inclusão em resinas epóxi antes do corte. Aqui apresentamos um protocolo que combina congelamento de alta pressão e rápida substituição de congelamento que permite fixação amostra da planta a ser realizado em poucas horas. O protocolo pode ser facilmente adaptado para trabalhar com outros tecidos ou organismos. Tecidos de plantas são de interesse especial devido à presença de espaços gaseificadas e vacúolos cheios de água, que possam impedir o congelamento livre de gelo de água. Além disso, o processo de fixação química é especialmente longa em plantas devido às paredes celulares que impedem a penetração dos produtos químicos para dentro dos tecidos profundos. Tecidos de plantas são, por conseguinte, particcularmente difícil, mas este protocolo é confiável e produz amostras de alta qualidade.

Os resultados apresentados a seguir foram obtidas utilizando um Wohlwend Compact 02 para HPF (Figura 1A). Uma das principais vantagens deste instrumento é a facilidade de utilização dos portadores de amostra e os seus suportes. Ao usar outros instrumentos, McDonald recomenda que dois usuários devem realizar a preparação de amostras e HPF, uma preparação das amostras, enquanto o outro faz o congelamento ea transferência para o FS criotubos 9. No entanto, o espécime Wohlwend operadora...

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Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem congelamento de pressão alta e rápida substituição em congelamento dos tecidos vegetais por Microscopia Eletrônica de Transmissão

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