Name: tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy
Uploaded: 2014-10-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Den vänlighet och generositet Dr Kent McDonald av UC Berkeley är mycket uppskattat. Vi tackar en anonym granskare för mycket användbara förslag. Den Burch-Smith lab stöds av startpeng från University of Tennessee.

OBS! QFS proceduren kräver extrem försiktighet och försiktighet av användaren och vi lyfta fram dessa säkerhetsåtgärder här som försiktig och Obs förekommande fall. 1.Preparation för HPF Run <ol><li> Innan provberedning, slå på högtrycks frys efter tillverkarens instruktioner. OBS! HPF enhet som används i detta protokoll är en Wohlwend Compact 02 enhet (figur 1 A), och det tar cirka ett till ett och en halv timme av startproceduren innan HPF körs ka...

<ol>
	<li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution.">Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).</li><li>Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing+of+soybean+nodules+leads+to+an+improved+preservation+of+ultrastructure.">High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure.</a> Planta. 188, 155-163 (1992).</li><li>Bowers, B. a. M. M., Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+2.">Ch 2.</a> Artifacts in Biological Electron Microscopy. 2, 13-42 (1988).</li><li>Mollenhauer, H. H., Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+3.">Ch 3.</a> Artifacts in Biological Electron Microscopy. , 43-64 (1988).</li><li>Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+ultrastructure+of+conventionally+fixed+and+high+pressure+frozen/freeze+substituted+root+tips+of+Nicotiana+and+Arabidopsis.">Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis.</a> Protoplasma. 157, 64-74 (1990).</li><li>Moor, H., Steinbrecht, R. A., Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 175-191 (1987).</li><li>Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close-to-native+ultrastructural+preservation+by+high+pressure+freezing.">Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing.</a> Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).</li><li>Dahl, R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing+for+the+preservation+of+biological+structure+theory+and+practice.">High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice.</a> Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).</li><li>McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing+for+preservation+of+high+resolution+fine+structure+and+antigenicity+for+immunolabeling.">High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling.</a> Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).</li><li>Hippe-Sanwald, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+freeze+substitution+on+biological+electron+microscopy.">Impact of freeze substitution on biological electron microscopy.</a> Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).</li><li>Kiss, J. Z., McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+immunocytochemistry+following+cryofixation+and+freeze+substitution.">Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution.</a> Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).</li><li>Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomographic+analysis+of+somatic+cell+plate+formation+in+meristematic+cells+of+Arabidopsis+preserved+by+high-pressure+freezing.">Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing.</a> The Plant cell. 16, 836-856 (2004).</li><li>Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=INCREASED+SIZE+EXCLUSION+LIMIT+encodes+a+putative+DEVH+box+RNA+helicase+involved+in+plasmodesmata+function+during+Arabidopsis+embryogenesis.">INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis.</a> The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).</li><li>Austin, J. R., 2nd, L. A., Staehelin, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+architecture+of+grana+and+stroma+thylakoids+of+higher+plants+as+determined+by+electron+tomography.">Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography.</a> Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).</li><li>McDonald, K. L., Webb, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+substitution+in+3+hours+or+less.">Freeze substitution in 3 hours or less.</a> Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).</li><li>Taiz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Plant+Vacuole.">The Plant Vacuole.</a> The Journal of experimental biology. , 172-1113 (1992).</li><li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes.">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).</li><li>Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substructure+of+freeze-substituted+plasmodesmata.">Substructure of freeze-substituted plasmodesmata.</a> Protoplasma. 169, 28-41 (1992).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Embedding+Methods+into+Epoxy+and+LR+White+Resins+for+Morphological+and+Immunological+Analysis+of+Cryofixed+Biological+Specimens.">Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens.</a> Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).</li><li>McDonald, K. L., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing,+cellular+tomography,+and+structural+cell+biology.">High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology.</a> BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).</li><li>Spiegelhalter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+dynamic+live+cell+imaging+to+3D+ultrastructure+novel+integrated+methods+for+high+pressure+freezing+and+correlative+light-electron+microscopy.">From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy.</a> PloS one. 5, e9014 (2010).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).</li></ol>

Framgången för det protokoll som presenteras här beror mycket på användaren. Först avancerade förberedelser som krävs för att säkerställa att alla nödvändiga material är lätt tillgängliga och i tillräcklig mängd för att fylla en hel HPF-QFS sikt. För det andra måste användaren arbeta snabbt, flytta från steg-för-steg på ett effektivt sätt som minimerar provhantering, vilket minimerar ändringar i det nativa tillståndet av vävnaden. När proverna fryses och innan de är uttorkad är det viktig...

Vår kunskap om cellultra kommer främst från elektronmikroskopi, vilket kan lösa uppgifter i intervallet några nanometer 1. Trots att så kraftfull i upplösning TEM anses inte vara användarvänligt, som provberedning kräver tidskrävande och mödosamma protokoll, och kräver viss expertis från utövaren. Traditionell fixering av prover har kombinerat användningen av aldehyder och osmiumtetroxid innan vidare behandling som inkluderar uttorkning, ingjutning i plast och sedan sektione producera ultratunna sektioner som sedan färgas med tungmetaller. Det är dock känt att kemisk fixering kan producera artefakter inklusive proteinaggregering och förlust av lipider 1, och förändringar till membran som i slutändan drabbar flera cellulära fack 2. Dessa artefakter är till stor del hänföras till den långsamma hastigheten för fixering och dehydratisering vid rumstemperatur 3, 4, 5. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Cryofixation genom högtrycksfrysning (HPF) undviker de flesta av de artefakter som orsakas av kemisk fixering. Principen för cryofixation är att det sänker fryspunkten för vatten vid 20 grader, saktar ner kärnbildning och tillväxt av iskristaller och ökar viskositeten hos vatten i ett biologiskt prov, så att cellulära beståndsdelar är väsentligen immobiliserad 6, 7. HPF minskar en provets temperatur till det av flytande kväve, under mycket högt tryck (210 MPa eller 2.100 bar) i millisekunder. När den görs rätt HPF förhindrar bildning av stora iskristaller som kan orsaka stora skador på cellultra. HPF kan användas för att fixera prover av 100-200 um tjocklek vid typiska koncentrationer av biologiska lösta ämnen 7. Det finns många recensioner på fysik och principer som ligger till grund HPF, t.ex. 1, 7, 8. Efter HPF tas prover inkuberas vid låg temperatur (-78,5 ° C till -90 &amp;# 176; C) i närvaro av flytande organiska lösningsmedel som innehåller kemiska fixeringsmedel som osmiumtetroxid, vanligtvis för ett par dagar. Vid denna låga temperatur, är vattnet i provet ersättas med organiskt lösningsmedel, typiskt aceton eller metanol 1, 9. Således är denna process som kallas fryssubstitution (FS). Provet sedan gradvis värms och under denna tid är fast, oftast med osmiumtetroxid och uranylacetat 9. Tvärbindning vid låga temperaturer har fördelen att fastställande molekyler som är immobiliserade 1. FS därför producerar prover av överlägsen kvalitet jämfört med dem som fastställs genom konventionell kemisk fixering vid rumstemperatur, särskilt det resulterar i förbättrad ultra konservering, bättre bevarande av antigenicitet och minskad förlust av obundna cellulära komponenter 10, 11. De flesta FS genomföres under långa tidsperioder, typiskt upp till flera dagar. Detta är särskilt true Växter proverna 12, 13, 14. En nyligen protokoll utvecklat av McDonald och Webb reducerar kraftigt tiden för FS från några dagar till några timmar 15. I sin snabbt förfarande fryssubstitution (QFS), är FS genomförs under 3 timmar, medan de supersnabba FS (SQFS) prover behandlas i 90 minuter. Kvaliteten på prover som produceras av dessa metoder är jämförbara med de som genereras av traditionella FS-protokoll. Vi har antagit QFS protokoll för efterföljande bearbetning av växtprover efter HPF. Detta har visat sig spara inte bara tid utan också pengar, som QFS och SQFS använder vanliga laboratorieutrustning i stället för de dyra kommersiellt tillgängliga FS maskiner. Växt vävnader är ofta mycket svårt att förbereda sig för TEM. I genomsnitt växtceller är större än både bakteriella eller djurceller. Närvaron av hydrofoba vaxartad nagelband, tjocka cellväggar, stora vattenfyllda vakuoler som innehåller organiska syror, hydrolaser och fenol compounds som kan uppta upp till 90% av den totala cellvolymen 16, och närvaron av kolsyrat utrymmen allvarligt minskar värmeledningsförmågan hos systemet 17. Vidare när det gäller växter, provets tjocklek överstiger nästan alltid 20 pm, gränsen för användning av kemisk fixering. Vid dessa tjocklekar, den låga värmeledningsförmågan hos vattnet förhindrar en fryshastigheten mer än -10.000 ° C / sek i centrum av provet. Denna kurs krävs för att undvika skadlig hexagonal isbildning (iskristaller med lägre densitet och större än 10 till 15 nm) 8. Tillsammans utgör dessa innebär utmaningar för både ordentlig frysning av provet och efterföljande FS. Ändå är cryofixation den bästa metoden för att fastställa växtprover. Här ett protokoll för HPF-QFS av växtvävnadsprover presenteras. Den fokuserar på modell arter Arabidopsis thaliana, men har också använts med Nicotiana benthamiana. De typiska resultat visar att HPF-QFS producerar samples av jämförbar kvalitet med traditionella HPF-FS på en bråkdel av tiden. Med lämpliga justeringar, kan detta protokoll också kan användas för andra relativt tjocka biologiska prover.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1070">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:245px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">HPF02</td>
			<td>With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display&#160; of freezing parameters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">241-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">242-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20</td>
			<td style="width:245px;">Chart</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Baker&#39;s yeast</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Tooth picks</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Thermocouple data logger EL-USB-TC</td>
			<td style="width:245px;">OMEGA Engineering Inc.</td>
			<td style="width:119px;">OM-EL-USB-TC&#160;</td>
			<td>Replacement battery purchased separately</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">34505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Heater block 12/13 mm</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Rotary shaker</td>
			<td style="width:245px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-402-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Leaf punch - Harris Uni-core 2.00</td>
			<td style="width:245px;">Ted-Pella Inc.</td>
			<td style="width:119px;">15076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Pink dental wax</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Cryogenic vials 2 mL</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">61802-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Methanol</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Blow dryer</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Dry ice</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Acetone</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Forceps</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Several pairs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy

Sedan 1940-talet transmissionselektronmikroskop (TEM) har försett biologer med extremt högupplösta bilder av biologiska material. Men på grund av mödosamma och tidskrävande protokoll som även kräver erfarenhet av beredning av artefaktfria prover, TEM anses inte vara en användarvänlig teknik. Traditionell provberedning för TEM använt kemiska fixeringsmedel för att bevara cellstrukturer. Högtrycks frysning är cryofixation av biologiska prover under höga tryck för att producera mycket snabba kylningshastigheter, och därmed begränsar isbildning, vilket är till skada för integriteten i cellultra. Högtrycks frysning och fryssubstitution är för närvarande de metoder för val för att producera högsta kvalitet morfologi i sektioner för TEM harts. Dessa metoder minimera artefakter som normalt förknippas med konventionell behandling för TEM i tunna sektioner. Efter cryofixation det frusna vattnet i provet skall ersättas med vätskaorganiskt lösningsmedel vid låga temperaturer, en process som kallas fryssubstitution. Freeze substitution utförs vanligtvis under flera dagar i hängiven, dyrbar utrustning. En ny innovation gör processen vara klar i tre timmar, i stället för de vanliga två dagarna. Detta är vanligtvis följs av ytterligare flera dagars provberedning som innehåller infiltration och inbäddning i epoxihartser innan snittning. Här presenterar vi ett protokoll som kombinerar högtrycksfrysning och snabb frysa substitution som gör att växtprovet fixering bli genomförda inom timmar. Protokollet kan lätt anpassas för att arbeta med andra vävnader eller organismer. Växtvävnader är ett särskilt problem på grund av förekomsten av kolsyrat utrymmen och vattenfyllda vakuoler som hindrar isfritt frysning av vatten. Dessutom är processen för kemisk fixering särskilt länge i växter på grund av cellväggar som hindrar penetrering av kemikalierna till djupt i vävnaderna. Växtvävnader är därför particbundet utmanande, men detta protokoll är tillförlitlig och ger prov på högsta kvalitet.

Resultat som presenteras nedan har erhållits med en Wohlwend Compact 02 för HPF (Figur 1A). En stor fördel med detta instrument är lätt att använda av proven bärare och dess innehavare. Vid användning av andra instrument, rekommenderar McDonald att två användare bör utföra förberedelserna och HPF, ett prov förbereder proven medan den andra gör frysning och transfer till FS cryovials 9. Men Wohlwend prov bärare och hållare är tillräckligt enkelt för en användare att manipu...

Watch this Scientific Journal Video about Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem Högtrycks Frysning och Quick Freeze Substitution av växtvävnad för transmissionselektronmikroskopi

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Fundamental Teknisk Delar av Freeze-fraktur / Freeze-Etch i biologisk elektronmikroskopi

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Studera den supramolekylära organisationen av foto membran i Freeze-brutna bladvävnader av Cryo-svepelektronmikroskopi

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Plunge Frysning: ett verktyg för Ultra och immunlokalisering Studier av suspensionsceller i transmissionselektronmikroskopi

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Svepelektronmikroskopi (SEM) Protokoll för Problematiskt Plant, Algsvampar, och Svamp Prover

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Flash-and-Freeze: En ny teknik för att fånga Membrane Dynamics med elektronmikroskopi

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Provberedning och avbildning av Exosomes av transmissionselektronmikroskopi

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Miniatyriserade provberedning för transmissionselektronmikroskopi

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiska provberedning genom högtrycks frysning, mikrovågsugn-assisted kontrastförbättring, och Minimal harts inbäddning för volym Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...