Name: using the overlay assay to qualitatively measure bacterial production of and sensitivity to pneumococcal bacteriocins
Uploaded: 2014-09-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins at JoVE.com

This work has been supported by Elizabeth E. Kennedy Research Award.

1. إعداد منتج سلالة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط سلالة المكورات الرئوية لفحصها لإنتاج مبيد جرثومي على 5٪ الأغنام الدم الصويا زيتية لوحة أجار من -80 ° C الأسهم الفريزر. ملاحظة: استخدام لوحات الدم للنمو الأولي من سلالة لفحصها لتثبيط يزيد كثيرا م...

<ol>
	<li>Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blp+bacteriocins+of+Streptococcus+pneumoniae+mediate+intraspecies+competition+both+in+vitro+and+in+vivo.">The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo.</a> Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).</li><li>Sawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+enterocin+W,+a+novel+two-peptide+lantibiotic+produced+by+Enterococcus+faecalis+NKR-4-1.">Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).</li><li>Kochan, T. J., Dawid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HtrA+protease+of+Streptococcus+pneumoniae+controls+density-dependent+stimulation+of+the+bacteriocin+blp+locus+via+disruption+of+pheromone+secretion.">The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion.</a> J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).</li><li>Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+bacteriocins+and+activity+spectrum+in+Streptococcus+pneumoniae.">Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae.</a> J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).</li><li>Reichmann, P., Hakenbeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+a+peptide-inducible+two-component+system+of+Streptococcus+pneumoniae.">Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae.</a> FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).</li><li>Saizieu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray-based+identification+of+a+novel+Streptococcus+pneumoniae+regulon+controlled+by+an+autoinduced+peptide.">Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide.</a> J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).</li><li>Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+production,+purification,+characterization+and+mechanism+of+action+of+salivaricin+9+lantibiotic+produced+by+Streptococcus+salivarius+NU10.">Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10.</a> PLoS One. 8 (10), 77751 (2013).</li><li>Wladyka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+biochemical+characterization,+and+cloning+of+a+bacteriocin+from+the+poultry-associated+Staphylococcus+aureus+strain+CH-91.">Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).</li><li>Shea, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bactofencin+a,+a+new+type+of+cationic+bacteriocin+with+unusual+immunity.">Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity.</a> 4 (6), 00498-00413 (2013).</li><li>Son, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mutations+in+the+pneumococcal+bacteriocin+transporter+gene,+blpA,+result+in+a+complex+population+consisting+of+producers+and+cheaters.">Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li><li>Kochan, T. J., Dawid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HtrA+protease+of+Streptococcus+pneumoniae+controls+density-dependent+stimulation+of+the+bacteriocin+blp+locus+via+disruption+of+pheromone+secretion.">The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion.</a> J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).</li><li>Widdick, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+engineering+of+the+cinnamycin+biosynthetic+gene+cluster+from+Streptomyces+cinnamoneus+cinnamoneus+DSM+40005.">Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).</li><li>Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+two-peptide+lantibiotic,+lichenicidin,+following+rational+genome+mining+for+LanM+proteins.">Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).</li></ol>

هذا الاختبار تراكب هو وسيلة سريعة لتحديد نطاق النشاط للمنتجين مبيد جرثومي وإظهار التفاعلات التنافسية التي قد تحدث بين سلالات المكورات الرئوية. الفحص تراكب يمكن تكييفها لاستخدامها لفحص سلالات متعددة لإنتاج مبيد جرثومي على لوحة واحدة. قمنا بنجاح فحص مجموعات سلالة كب...

العقدية الرئوية، وهي المستعمر المشترك للمجتمع متعدد المكروبات من البلعوم الأنفي، غير قادرة على المنافسة مع الآخرين، والمكورات الرئوية وثيقي الصلة من خلال إنتاج الببتيدات المضادة للميكروبات أنتجت البكتريا (bacteriocins). كل سلالة المكورات الرئوية التسلسل بالكامل بحثت حتى الآن يحتوي على نسخة من ب acteriocin- ل آيك ص eptide موضع، BLP. وقد تجلى إنتاج مبيد جرثومي من المكورات الرئوية إلى أن تكون مهمة في نتائج سواء في المختبر وفي الجسم الحي المنافسة 1-4. وتتأثر ديناميكية تنافسية من خلال التعبير عن bacteriocins المتنوعة جنبا إلى جنب مع البروتينات الحصانة وما شابه ذلك ردا على الببتيد فرمون محددة. يتم التحكم تحريض موضع BLP عن طريق نظام الاستشعار عن النصاب فيه فرمون الببتيد، BlpC، بربط كيناز الاستشعار، BlpH، ويبدأ شلال يشير مما أدى إلىالنسخ من موضع 5،6 BLP. هناك أربعة اختلافات أليلية من BlpC أن كل مأزق لBlpH المشابهة لها 6. للخلية من أجل البقاء آثار مبيد جرثومي الخاص بها، ونسخه الجينات التي تشفر البروتينات الحصانة وما شابه ذلك على نفس الاوبرون حيث أن كل من الجينات مبيد جرثومي. يحدث إذا قتل سلالة منافس غير قادر على upregulate موضع BLP ردا على فرمون خارجي أو، إذا كان يفتقر إلى سلالة الجين الحصانة معين المطلوبة للحماية. مجمع نقل، مطلوب BlpAB عن إفراز وتجهيز فرمون الببتيد والببتيدات مبيد جرثومي 2،4. في الآونة الأخيرة، فقد تبين أن نسبة كبيرة من سلالات المكورات الرئوية هي &quot;الغشاشون&quot; يعني لديهم طفرة في الجين الحفظ blpA مما يجعلها غير قادرة على إفراز الفيرمونات وbacteriocins 1،2. هذه السلالات هي قادرة على الاستجابة لBlpC خارجية المنشأ 2 يفرزها صهيلسلالات مملة السماح لإنتاج البروتينات الحصانة. وعلى الرغم من الاستعدادات الخام من bacteriocins من supernatants يمكن إعداد من سلالات منتج باستخدام أساليب الخطوات البيوكيميائية لتحقيق النقاء، وهذا النهج ليس مفيدا لفحص مجموعات كبيرة من العزلات وإذا كان مستوى التعبير مبيد جرثومي منخفضة في مرق نمت الثقافات 2،7- 9. يستخدم الفحص تراكب كوسيلة سريعة للتحقيق في الديناميات التنافسية بين السلالات التي قد تكون موجودة في المختبر. للقيام بذلك، سلالة المكورات الرئوية هو على لوحة آغار وسمح لتنمو لتحقيق تركيزات البكتيرية محلية كافية لتحريض موضع BLP تلقيح مسبقا. ثم يتم تلقيح سلالة الثاني في حل أجار لينة المنصهر التي يتم بعد ذلك تطبيقها على سلالة تلقيح قبل لاختبار حساسية. لتقييم لنشاط موضع BLP (مستقلة عن النشاط المثبطة)، سلالات يمكن مضافين مع سلسلة من عشرالعناصر الأرضية النادرة التي سبق وصفها سلالات مراسل BlpC. شيدت هذه السلالات لاحتواء واحد من ثلاثة blpH الأليلات المختلفة التي تستجيب لالفيرومونات BlpC الثلاثة الأكثر شيوعا التي يفرزها المكورات الرئوية. سلالات مراسل لها الجين lacZ المتكاملة التي هي تحت سيطرة المروج يعتمد BlpH وتحمل الحذف في الجينات blpC يمنع التحفيز الذاتي 10،11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:351px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">B21261X&#160;</td>
			<td>For growth from freezer cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Catalase</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C100-500mg</td>
			<td>4,741 Units per plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">DF0492-17-6&#160;</td>
			<td>30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH20 autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">B11768&#160;</td>
			<td>30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH20 autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">5-Bromo-4-chloro-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside (X-gal)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B4252-50MG</td>
			<td>Dissolve in dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Spectrophometer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Measures the OD620 of cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">37 &#176;C water bath</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">37 &#176;C incubator with 5% CO2</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">15 ml conical tube</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the overlay assay to qualitatively measure bacterial production of and sensitivity to pneumococcal bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

هناك نوعان من النتائج المحتملة في مقايسة تراكب. يجب أن يكون من الممكن أن نرى النمو من سلالة طعن بعد الحضانة بين عشية وضحاها. في الشكل 1A، سلالة تراكب حساس لbacteriocins التي يتم إنتاجها. منطقة التخليص يمكن تصور المحيطة سلالة طعن. بالإضافة إلى ذلك، دوامات من سلالة طع?...

Watch this Scientific Journal Video about Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins at JoVE.com

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

باستخدام تراكب الفحص لقياس نوعيا الإنتاج الجرثومي من والحساسية للالرئوية Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Luciferase به لالتهابات جرثومية في صورة الفئران

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

وظيفية فحص الدم لقياس الجامعة صلاحية مايكوباكتيريا ، وذلك باستخدام الجينات المرتبطة دلاليا مراسل بي سي جي إم أو السل (BCG لوكس / M. التربيوم لوكس)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

A الفحص المرئي لمراقبة T6SS بوساطة المسابقة الجرثومي

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

باستخدام الكيمياء فوق لقياس تأثير عدوى فيروسية في خلية المضيف RNA التجميعي

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

التحقيق في آثار البروبيوتيك على المكورات الرئوية الاستعمار باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; الالتزام الفحص

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

المحفظة المصلي من<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; باستخدام تفاعل الانتباج

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

المحفظة المصلي من<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; من جانب تراص اللاتكس

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

طرق لمنع البكتيرية Pyomelanin الإنتاج وتحديد الزيادة المقابلة في الحساسية للإجهاد التأكسدي

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...