Name: mouse fetal liver culture system to dissect target gene functions at the early and late stages of terminal erythropoiesis
Uploaded: 2014-09-09T15:00:00
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इस अध्ययन एनआईएच R00HL102154 द्वारा समर्थित है, और पी जी को रुधिर विद्वान पुरस्कार के एक अमेरिकी समाज था.

इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगों नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया. संस्कृति क?...

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	<li>Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+stem+cell+to+red+cell:+regulation+of+erythropoiesis+at+multiple+levels+by+multiple+proteins,+RNAs,+and+chromatin+modifications.">From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications.</a> Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).</li><li>Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+cells+red:+signal+transduction+mediated+by+erythropoietin.">Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin.</a> Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).</li><li>Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha4beta1+integrin+and+erythropoietin+mediate+temporally+distinct+steps+in+erythropoiesis:+integrins+in+red+cell+development.">Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development.</a> The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).</li><li>Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+by+erythropoietin+of+viability+and+maturation+of+murine+erythroid+precursor+cells.">Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells.</a> Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).</li><li>Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+2+is+required+for+chromatin+condensation+and+subsequent+enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts.">Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts.</a> Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).</li><li>Dumitriu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox6+cell-autonomously+stimulates+erythroid+cell+survival,+proliferation,+and+terminal+maturation+and+is+thereby+an+important+enhancer+of+definitive+erythropoiesis+during+mouse+development.">Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development.</a> Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).</li><li>Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+hematopoietic+stem+cell+isolation+methods.">Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods.</a> Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).</li><li>Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+characterization+and+isolation.">Hematopoietic stem cell characterization and isolation.</a> Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).</li><li>Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+control+of+terminal+erythropoiesis+via+physical+interactions+among+erythroid+cells.">Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells.</a> Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).</li><li>Bhatia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+fatty+acid-mediated+effects+on+erythropoiesis+in+primary+definitive+erythroid+cells.">Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells.</a> Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).</li><li>Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ras+signaling+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+cells:+functional+analysis+by+a+flow+cytometry-based+novel+culture+system.">Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system.</a> Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).</li><li>Socolovsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).</li><li>Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts+requires+Rac+GTPases+and+mDia2.">Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2.</a> Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).</li><li>Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytokine+signaling+molecules+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+hematopoietic+cells:+functional+analysis+of+signaling+molecules+by+retrovirus-mediated+expression.">Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression.</a> Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).</li><li>Patel, V. P., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fibronectin+matrix+is+required+for+differentiation+of+murine+erythroleukemia+cells+into+reticulocytes.">A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes.</a> The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).</li><li>Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin-induced+suppression+of+erythropoiesis:+the+role+of+erythropoietin+and+a+heme+synthesis+stimulating+factor.">Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor.</a> Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).</li><li>Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+erythropoiesis.">New insights into erythropoiesis.</a> Current opinion in hematology. 9 (2), 93-100 (2002).</li></ol>

यहाँ हम कालक्रम के अनुसार माउस भ्रूण जिगर टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस का विश्लेषण करने के लिए एक अनूठी प्रणाली मौजूद है. अलग संस्कृति शर्तों के आवेदन के माध्यम से, हम सफलतापूर्वक जल्दी और देर चरणों में टर्?...

एरिथ्रोपोएसिस एरिथ्रोसाइट्स परिपक्व करने के लिए multipotent hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव की प्रक्रिया है. इस stepwise प्रक्रिया प्रतिबद्ध एर्य्थ्रोइद फट बनाने इकाइयों (BFU-ते), तेजी से विभाजित एर्य्थ्रोइद कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU-ते), और आकृति विज्ञान पहचानने erythroblasts 1,2 के गठन शामिल है. CFU ई पूर्वज कोशिकाओं से टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस अनुक्रमिक erythropoietin निर्भर और स्वतंत्र चरणों 2,3 शामिल है. टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के प्रारंभिक चरण में, एरिथ्रोपीटिन (ईपीओ) कोशिका की सतह पर अपने रिसेप्टर को बांधता है और सेल apoptosis को रोकने और तेजी से कोशिका विभाजन और जीन अभिव्यक्ति 1,4 बढ़ावा कि नीचे की ओर संकेत दे रास्ते की एक श्रृंखला को प्रेरित करता है. टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की देर चरण में, erythroblasts अत्यधिक सघन नाभिक 5 के टर्मिनल सेल चक्र से बाहर निकलें, chromatin और नाभिक संघनन, और बाहर निकालना गुजरना. टर्मिनल की हमारी समझएरिथ्रोपोएसिस बहुत कारण इन विट्रो में कई के सफल प्रयोग करने के लिए और इन विवो माउस मॉडल 6-9 में बड़े पैमाने पर है, जो पिछले कुछ दशकों में सुधार हुआ है. इन मॉडलों के बीच, माउस भ्रूण जिगर erythroblasts के इन विट्रो संस्कृति में सेल शुद्धि, तेजी से प्रसार और भेदभाव की आसानी सहित कई लाभ प्रदान करता है, और मानव एरिथ्रोपोएसिस 10,11 के लिए एक करीब नकल. इस प्रणाली में, माउस भ्रूण यकृत से एर्य्थ्रोइद पूर्वज कोशिकाओं की बड़ी संख्या आसानी से TER119 की भी कदम शुद्धि (परिपक्व erythroid कोशिकाओं के लिए एक मार्कर) नकारात्मक erythroblasts द्वारा अलग किया जा सकता है. Erythroblasts की दो दिवसीय संस्कृति के दौरान, इन कोशिकाओं के भेदभाव transferrin रिसेप्टर (CD71) और TER119 प्रतिजन 12 की सतह अभिव्यक्ति पर आधारित एक प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा नजर रखी जा सकती है. इसके अलावा, टर्मिनली भेदभाव erythroblasts का स्पष्टीकरण 1 एक डीएनए निर्माता (Hoechst 33342) द्वारा पता लगाया जा सकता है3. इसके अलावा, शुद्ध progenitors आनुवंशिक रूप से cDNAs या एरिथ्रोपोएसिस 11,13,14 पर जीन अभिव्यक्ति के कार्यों की यंत्रवत पढ़ाई की सुविधा है, जो ब्याज की जीन, के लिए छोटे बाल के लिये कांटा RNAs (shRNAs) के बहिर्जात अभिव्यक्ति द्वारा संशोधित किया जा सकता है. यह टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के विभिन्न चरणों में जीन कार्यों को चिह्नित करने के लिए मुश्किल है क्योंकि दूसरी ओर, तेजी से कोशिकाओं की वृद्धि दर एक दोधारी तलवार हो सकता है. ज्यादातर मामलों में, यह cDNAs या shRNAs व्यक्त समय से जब से टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के प्रारंभिक चरण में एक विशेष जीन कार्यों, कोशिकाओं पहले से ही प्रारंभिक चरण पारित निर्धारित करने के लिए मुश्किल है. इस समस्या को हल करने के लिए, हम टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की जल्दी और देर चरणों टुकड़े करने के लिए एक अनूठी प्रणाली विकसित की है. टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के प्रारंभिक चरण के लिए, आनुवंशिक रूप से संशोधित TER119 नकारात्मक erythroblasts, ईपीओ मुक्त माध्यम लेकिन युक्त स्टेम सेल कारक (एससीएफ) में आईएल -6 और FLT3 सुसंस्कृत थेligand उनके पूर्वज स्थिति बनाए रखने और अभिव्यक्ति 13 transduced cDNAs या shRNA अनुमति देने के लिए. कोशिकाओं सेल प्रसार और भेदभाव को प्रेरित करने के 12 घंटे के बाद ईपीओ युक्त मध्यम करने के लिए बदल गया. कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू कर दिया है जब इस तरह,, transduced cDNAs या shRNAs पहले ही व्यक्त कर रहे थे. टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की देर चरण के लिए, TER119 नकारात्मक erythroblasts ईपीओ पारगमन के बाद तुरंत मध्यम युक्त में सुसंस्कृत थे. इसलिए, एक टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की देर चरण में ब्याज की जीन के कार्यों का विश्लेषण कर सकते हैं. संक्षेप में, इस प्रणाली का एक व्यापक आवेदन टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के विभिन्न चरणों में काटना जीन कार्यों में मदद मिलेगी.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s MediumIMDM (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GEMINI Bio-product</td>
			<td>700-102P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mecaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>0.1 M in IMDM,&#160; 4&#8451;stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30034.01</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem cell factor (SCF)</td>
			<td>STEMCELL TECH</td>
			<td>2630</td>
			<td>100 ng/ul, -20&#8451; stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L)</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>14-8001-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)&#160;</td>
			<td>GEMINI Bio-product</td>
			<td>300-327P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fibronectin</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>STEMCELL TECH</td>
			<td>9300</td>
			<td>10% stock in IMDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution, human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>4&#8451; stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>holo-transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0665</td>
			<td>50 mg/ml in Water -20&#8451; stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythropoietin(Epo)</td>
			<td>PROCRIT</td>
			<td>NOC 59676-303-00</td>
			<td>3,000 U/ml stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin particles Plus</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL TECH</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse fetal liver culture system to dissect target gene functions at the early and late stages of terminal erythropoiesis

एरिथ्रोपोएसिस तेजी इकाइयों के गठन erythroid कॉलोनी (CFU-ते) विभाजित करके पीछा प्रतिबद्ध एर्य्थ्रोइद फट बनाने इकाइयों (BFU-एस) के साथ शुरू होता है कि एक गतिशील प्रक्रिया शामिल है. CFU-एस के बाद, कोशिकाओं आकृति विज्ञान पहचानने और आम तौर पर टर्मिनल erythroblasts कहा जाता है. टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के अध्ययन के लिए चुनौतियों में से एक एक कालानुक्रमिक ढंग से जीन कार्यों काटना प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की कमी है. इस प्रोटोकॉल में, हम टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की जल्दी और देर चरणों में जीन कार्यों का निर्धारण करने के लिए एक अद्वितीय रणनीति का वर्णन. इस प्रणाली में, माउस भ्रूण जिगर TER119 (परिपक्व erythroid सेल मार्कर) नकारात्मक erythroblasts शुद्ध थे और cDNAs या ब्याज की जीन के लिए छोटे बाल के लिये कांटा RNAs (shRNAs) के बहिर्जात अभिव्यक्ति के साथ transduced. कोशिकाओं बाद में बहिर्जात cDNAs या shRNAs की अनुमति है जबकि 12 घंटा के लिए उनके पूर्वज मंच बनाए रखने के लिए erythropoietin (ईपीओ) के अलावा अन्य मध्यम युक्त वृद्धि कारकों में सुसंस्कृत थेव्यक्त करने के लिए. कोशिकाओं बहिर्जात आनुवंशिक सामग्री पहले ही व्यक्त कर रहे थे, जबकि सेल भेदभाव और प्रसार के लिए प्रेरित करने के 12 घंटे के बाद ईपीओ मध्यम करने के लिए बदल गया. इस प्रोटोकॉल टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के प्रारंभिक चरण में जीन के कार्यों का विश्लेषण की सुविधा. देर चरण टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस का अध्ययन करने के लिए, कोशिकाओं तुरंत पारगमन के बाद ईपीओ माध्यम में सुसंस्कृत थे. Transduced आनुवंशिक सामग्री व्यक्त किया गया है जब इस तरह, कोशिकाओं पहले ही टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की देर चरण के लिए भेदभाव किया गया. हम टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस के विभिन्न चरणों में विस्तृत जीन कार्यों को समझने में मदद मिलेगी कि इस रणनीति का एक सामान्य आवेदन की सलाह देते हैं.

चित्रा 1 प्रयोगात्मक रणनीतियों की रूपरेखा. प्रोटोकॉल टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की जल्दी और देर चरणों में संकेतन अणुओं के कार्यों को लक्षित के लिए दो स्वतंत्र शर्तों के होते हैं. TER119 नकारात्मक भ्रूण...

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Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

हम टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की जल्दी और देर चरणों dissects कि इन विट्रो माउस भ्रूण जिगर erythroblast संस्कृति प्रणाली मौजूद है. इस प्रणाली के विभिन्न विकास के चरणों में विशिष्ट जीन की कार्यात्मक विश्लेषण की सुविधा.

माउस भ्रूण जिगर संस्कृति के लिए सिस्टम टर्मिनल एरिथ्रोपोएसिस की जल्दी और देर चरणों में लक्ष्य जीन कार्य काटना

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

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