Name: mouse fetal liver culture system to dissect target gene functions at the early and late stages of terminal erythropoiesis
Uploaded: 2014-09-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis at JoVE.com

Denne studien ble støttet av NIH R00HL102154, og en American Society of Hematology lærd prisen til P Ji.

Forsøkene som er beskrevet i denne protokollen ble utført i samsvar med de retningslinjer og forskrifter fastsatt av Northwestern University Institutional Animal Care og bruk komité. 1. Utarbeidelse av Kultur Medium <ol><li> Forbered fibronectin løsning. Tilsett 1 ml vann til en ampulle med humant fibronektin (1 mg). La løsningen i vevskultur hette i 30 minutter uten omrøring. Overfør den samlede væske til 50 ml PBS for å lage en endelig konsentrasjon på 20 pg / ml og forsiktig b...

<ol>
	<li>Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+stem+cell+to+red+cell:+regulation+of+erythropoiesis+at+multiple+levels+by+multiple+proteins,+RNAs,+and+chromatin+modifications.">From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications.</a> Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).</li><li>Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+cells+red:+signal+transduction+mediated+by+erythropoietin.">Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin.</a> Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).</li><li>Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha4beta1+integrin+and+erythropoietin+mediate+temporally+distinct+steps+in+erythropoiesis:+integrins+in+red+cell+development.">Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development.</a> The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).</li><li>Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+by+erythropoietin+of+viability+and+maturation+of+murine+erythroid+precursor+cells.">Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells.</a> Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).</li><li>Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+2+is+required+for+chromatin+condensation+and+subsequent+enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts.">Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts.</a> Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).</li><li>Dumitriu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox6+cell-autonomously+stimulates+erythroid+cell+survival,+proliferation,+and+terminal+maturation+and+is+thereby+an+important+enhancer+of+definitive+erythropoiesis+during+mouse+development.">Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development.</a> Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).</li><li>Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+hematopoietic+stem+cell+isolation+methods.">Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods.</a> Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).</li><li>Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+characterization+and+isolation.">Hematopoietic stem cell characterization and isolation.</a> Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).</li><li>Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+control+of+terminal+erythropoiesis+via+physical+interactions+among+erythroid+cells.">Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells.</a> Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).</li><li>Bhatia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+fatty+acid-mediated+effects+on+erythropoiesis+in+primary+definitive+erythroid+cells.">Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells.</a> Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).</li><li>Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ras+signaling+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+cells:+functional+analysis+by+a+flow+cytometry-based+novel+culture+system.">Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system.</a> Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).</li><li>Socolovsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).</li><li>Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts+requires+Rac+GTPases+and+mDia2.">Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2.</a> Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).</li><li>Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytokine+signaling+molecules+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+hematopoietic+cells:+functional+analysis+of+signaling+molecules+by+retrovirus-mediated+expression.">Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression.</a> Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).</li><li>Patel, V. P., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fibronectin+matrix+is+required+for+differentiation+of+murine+erythroleukemia+cells+into+reticulocytes.">A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes.</a> The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).</li><li>Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin-induced+suppression+of+erythropoiesis:+the+role+of+erythropoietin+and+a+heme+synthesis+stimulating+factor.">Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor.</a> Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).</li><li>Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+erythropoiesis.">New insights into erythropoiesis.</a> Current opinion in hematology. 9 (2), 93-100 (2002).</li></ol>

Her presenterer vi et unikt system for å kronologisk analysere mus fosterets lever terminal erythropoiesis. Gjennom anvendelse av ulike oppdrettsbetingelser, vi lykkes dissekert terminal erythropoiesis i tidlige og sene stadier. Dette er spesielt viktig for å bestemme mekanismene for gener med flere funksjoner. For eksempel Rac GTPases spiller viktige roller i ulike stadier av terminal erythropoiesis. Hemming av Rac GTPases i den tidlige fasen av terminal erytropoiese påvirkninger celledifferensiering og spredning. P...

Erythropoiesis er prosessen med differensiering av multipotente blodkreft stamceller til modne erytrocytter. Dette trinnvis prosess inkluderer dannelsen av engasjerte erythroid burst forming units (BFU-ES), raskt dele erythroide kolonidannende enheter (CFU-ES), og morfologisk gjenkjennelige erytroblaster 1,2. Terminal erythropoiesis fra CFU-E stamceller innebærer sekvensiell erytropoietin-avhengige og uavhengige etapper 2,3. I det tidlige stadium av terminal erytropoese Erytropoietin (EPO) binder seg til sin reseptor på celleoverflaten, og induserer en serie av nedstrøms signalveier som hindrer celle apoptose og fremme hurtig celledelinger og genekspresjon 1,4. På slutten av fasen av terminal erythropoiesis, erytroblaster gjennomgå terminal cellesyklus exit, kromatin og nucleus kondens, og ekstrudering av de svært kondensert atomkjerner 5. Vår forståelse av terminalerythropoiesis har blitt mye bedre de siste tiårene, noe som i stor grad skyldes vellykket bruk av flere in vitro og in vivo musemodeller 6-9. Blant disse modellene, in vitro kultur musefosterlever erytroblaster gir mange fordeler, inkludert den enkle celle rensing, rask spredning og differensiering, og en nærmere etterligner å menneskelige erythropoiesis 10,11. I dette system kan et stort antall erytroide progenitorceller mus føtale lever fra lett bli isolert ved den enkelt trinn rensing av TER119 (en markør for den modne erytroide celler) negative erytroblaster. I løpet av to-dagers kultur av erytroblaster, kan differensiering av disse cellene bli overvåket av en strømningscytometrisk analyse basert på overflaten ekspresjon av transferrin-reseptoren (CD71) og 12 TER119 antigen. I tillegg kan utskraping av de terminalt differensierings erytroblaster bli detektert av en DNA trakter (Hoechst 33342) 13.. Videre, de rensede stamceller kan bli genetisk modifisert ved eksogen ekspresjon av cDNA eller små hårnål RNA (shRNAs) for de gener som er av interesse, noe som letter den mekanistiske undersøkelser av funksjoner av genekspresjon på erytropoese 11,13,14. På den annen side, kan den raske celleveksthastighet være et tveegget sverd siden det er vanskelig å karakterisere genfunksjoner i forskjellige stadier av terminal erytropoese. I de fleste tilfeller er det vanskelig å bestemme om et bestemt gen Funksjonene i den tidlige fasen av terminal erytropoese siden av den tiden cDNA eller shRNAs uttrykt, cellene allerede passert tidlig stadium. For å løse dette problemet, har vi utviklet et unikt system for å dissekere de tidlige og sene stadier av terminal erythropoiesis. For den tidlige fasen av terminal erythropoiesis, genmodifiserte TER119 negative erytroblaster ble dyrket i Epo-free medium, men inneholder stamcellefaktor (SCF), IL-6 og FLT3ligand å opprettholde sin stamfar status og la transduserte cDNAs eller shRNA til uttrykk 13. Cellene ble endret til Epo holdige medium etter 12 timer for å indusere celleproliferasjon og differensiering. På denne måten, når cellene begynte å skille de transduserte cDNA eller shRNAs ble allerede uttrykt. For sent stadium av terminal erythropoiesis, TER119 negative erytroblaster ble dyrket i Epo inneholder medium umiddelbart etter transduksjon. Derfor kan man analysere funksjoner av gener av interesse i sent stadium av terminal erythropoiesis. Oppsummert, vil en bred anvendelse av dette systemet hjelpe dissekere genfunksjoner i forskjellige stadier av terminal erythropoiesis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s MediumIMDM (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GEMINI Bio-product</td>
			<td>700-102P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mecaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>0.1 M in IMDM,&#160; 4&#8451;stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30034.01</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem cell factor (SCF)</td>
			<td>STEMCELL TECH</td>
			<td>2630</td>
			<td>100 ng/ul, -20&#8451; stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L)</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>14-8001-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)&#160;</td>
			<td>GEMINI Bio-product</td>
			<td>300-327P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fibronectin</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>STEMCELL TECH</td>
			<td>9300</td>
			<td>10% stock in IMDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution, human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>4&#8451; stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>holo-transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0665</td>
			<td>50 mg/ml in Water -20&#8451; stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythropoietin(Epo)</td>
			<td>PROCRIT</td>
			<td>NOC 59676-303-00</td>
			<td>3,000 U/ml stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin particles Plus</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL TECH</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse fetal liver culture system to dissect target gene functions at the early and late stages of terminal erythropoiesis

Erythropoiesis innebærer en dynamisk prosess som starter med engasjerte erythroid burst forming units (BFU-Es) etterfulgt av raskt delende erythroid kolonidannende enheter (CFU-Es). Etter CFU-Es, cellene er morfologisk gjenkjennelig og generelt betegnes terminal erytroblaster. En av utfordringene for studiet av terminal erythropoiesis er mangelen på eksperimentelle tilnærminger å dissekere genfunksjoner i en kronologisk måte. I denne protokollen, beskriver vi en unik strategi for å bestemme genfunksjoner i de tidlige og sene stadier av terminal erythropoiesis. I dette systemet, ble mus fosterets lever TER119 (moden erythroid celle markør) negative erytroblaster renset og omformet med eksogene uttrykk for cDNAs eller små hårnål RNA (shRNAs) for genene av interesse. Cellene ble deretter dyrket i medium inneholdende vekst andre enn erytropoietin (EPO) for å opprettholde sin stamcelle stadium i 12 timer samtidig som de eksogene cDNA eller shRNAs faktorerå uttrykke. Cellene ble endret til Epo medium etter 12 timer for å indusere celledifferensiering og proliferasjon mens de eksogene genetiske materialet allerede var uttrykt. Denne protokollen forenkler analyse av genfunksjoner i den tidlige fasen av terminal erythropoiesis. Å studere sent stadium terminal erythropoiesis ble cellene umiddelbart dyrket i Epo medium etter transduksjon. På denne måten ble cellene allerede er differensiert til sent stadium av terminal erytropoese når de transduserte genetiske materialer ble uttrykt. Vi anbefaler en allmenngjøring av denne strategien som ville bidra til å forstå detaljerte genet funksjoner i ulike stadier av terminal erythropoiesis.

Figur 1 skisserer de eksperimentelle strategier. Protokollen består av to selvstendige vilkår for målretting funksjonene til signalmolekyler i de tidlige og sene stadier av terminal erythropoiesis. TER119 negative føtale lever erytroblaster ble renset fra E13.5 mus fosteret. Flowcytometrisk analyse av føtale lever erytroide celler før og etter rensing viste at rensingen var effektiv (figurene 2A og 2B). For tidlig stadium av erytropoese terminalen (Figur 1...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis at JoVE.com

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Vi presenterer en in vitro mus fosterets lever erytroblast kultur system som dissekerer de tidlige og sene stadier av terminal erythropoiesis. Dette systemet forenkler funksjonell analyse av spesifikke gener i ulike utviklingsstadier.

Mus Fetal Liver Kultur System å dissekere Target genfunksjoner på tidlige og sene stadier av Terminal erythropoiesis

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

A Hierarchical Stem-Cell System: Blood Cell Formation

SCIENTISTS IN ACTION

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Bruke BLT humanisert Mouse som en stamcelle basert Gene Therapy Tumor Model

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-til-struktur Fastsettelse av Influensa Polymerase PB2 underenhet

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

En protokoll for Analysere Hepatitt C-virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Vaccinia Reporter virus for å kvantifisere Viral funksjon på alle stadier av Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolering av leukocyttene fra Murine Vev på Maternal Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

Menneskemorkake og decidual orgel kulturer å studere Infeksjoner ved maternal-føtal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Flowcytometri basert analyse for overvåking av NK cellefunksjoner

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Utvikling av en hepatitt B virus Reporter system for å overvåke tidlige stadier av Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generasjon av Escape varianter av nøytralisere influensa Virus monoklonale antistoffer

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...