Name: mouse fetal liver culture system to dissect target gene functions at the early and late stages of terminal erythropoiesis
Uploaded: 2014-09-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis at JoVE.com

Это исследование было поддержано NIH R00HL102154, и Американского общества гематологии ученого премии в P Джи.

Эксперименты, описанные в этом протоколе были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Северо-Западного университета Уходу за животными и использованию комитета. 1 Получение культуральной среде <ol><li> Подготовьте фибронектина ре?...

<ol>
	<li>Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+stem+cell+to+red+cell:+regulation+of+erythropoiesis+at+multiple+levels+by+multiple+proteins,+RNAs,+and+chromatin+modifications.">From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications.</a> Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).</li><li>Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+cells+red:+signal+transduction+mediated+by+erythropoietin.">Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin.</a> Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).</li><li>Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha4beta1+integrin+and+erythropoietin+mediate+temporally+distinct+steps+in+erythropoiesis:+integrins+in+red+cell+development.">Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development.</a> The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).</li><li>Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+by+erythropoietin+of+viability+and+maturation+of+murine+erythroid+precursor+cells.">Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells.</a> Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).</li><li>Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+2+is+required+for+chromatin+condensation+and+subsequent+enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts.">Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts.</a> Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).</li><li>Dumitriu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox6+cell-autonomously+stimulates+erythroid+cell+survival,+proliferation,+and+terminal+maturation+and+is+thereby+an+important+enhancer+of+definitive+erythropoiesis+during+mouse+development.">Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development.</a> Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).</li><li>Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+hematopoietic+stem+cell+isolation+methods.">Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods.</a> Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).</li><li>Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+characterization+and+isolation.">Hematopoietic stem cell characterization and isolation.</a> Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).</li><li>Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+control+of+terminal+erythropoiesis+via+physical+interactions+among+erythroid+cells.">Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells.</a> Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).</li><li>Bhatia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+fatty+acid-mediated+effects+on+erythropoiesis+in+primary+definitive+erythroid+cells.">Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells.</a> Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).</li><li>Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ras+signaling+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+cells:+functional+analysis+by+a+flow+cytometry-based+novel+culture+system.">Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system.</a> Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).</li><li>Socolovsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).</li><li>Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts+requires+Rac+GTPases+and+mDia2.">Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2.</a> Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).</li><li>Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytokine+signaling+molecules+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+hematopoietic+cells:+functional+analysis+of+signaling+molecules+by+retrovirus-mediated+expression.">Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression.</a> Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).</li><li>Patel, V. P., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fibronectin+matrix+is+required+for+differentiation+of+murine+erythroleukemia+cells+into+reticulocytes.">A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes.</a> The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).</li><li>Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin-induced+suppression+of+erythropoiesis:+the+role+of+erythropoietin+and+a+heme+synthesis+stimulating+factor.">Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor.</a> Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).</li><li>Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+erythropoiesis.">New insights into erythropoiesis.</a> Current opinion in hematology. 9 (2), 93-100 (2002).</li></ol>

Здесь мы представляем уникальную систему, чтобы хронологически проанализировать мыши плода терминала печени эритропоэз. За счет применения различных условиях культивирования, мы успешно расчлененный терминала эритропоэз в ранних и поздних стадиях. Это особенно важно, чтобы определ?...

Эритропоэза является процесс дифференциации мультипотентных гемопоэтических стволовых клеток в зрелые эритроциты. Это поэтапный процесс включает в себя формирование привержены эритроидная пакетных единиц (БОЕ-ES), быстро делящиеся эритроидные колониеобразующих единиц (КОЕ-Эс), и морфологически распознаваемых эритробластов 1,2. Терминал эритропоэз из клеток-предшественников CFU-E включает в себя последовательную эритропоэтин-зависимые и независимые этапы 2,3. На ранней стадии терминального эритропоэза, эритропоэтин (ЕРО) связывается со своим рецептором на поверхности клетки и индуцирует серию последующих сигнальных путей, которые предотвращают апоптоз клеток и способствуют быстрому клеточных делений и экспрессию гена 1,4. В поздней стадии терминального эритропоэза, эритробласты пройти выход терминал клеточного цикла, хроматин и ядра конденсации, и экструзию высоко конденсированных ядер 5. Наше понимание терминалаэритропоэз значительно улучшилась за последние несколько десятилетий, что во многом благодаря успешному использованию нескольких в пробирке и в естественных мышиных моделях 6-9. Среди этих моделей, в пробирке культуру мыши плода эритробластов печени предоставляет много преимуществ, включая простоту очистки клеток, быстро пролиферации и дифференцировки, и ближе имитировать человеческой эритропоэза 10,11. В этой системе, большое количество клеток-предшественников эритроидного от мыши печени плода может быть легко изолированы от одной стадии очистки Ter119 (маркер для зрелых эритроидных клеток) негативных эритробластов. В течение двух дней культуры эритробластов, дифференцировки этих клеток можно контролировать с помощью проточной цитометрии анализа, основанного на поверхностной экспрессии рецептора трансферрина с (CD71) и Ter119 антигена 12. Кроме того, энуклеации из терминальной дифференцировки эритробластов могут быть обнаружены с помощью ДНК-производителя (Hoechst 33342) 13. Кроме того, очищенные предшественники могут быть генетически модифицированы экзогенного выражения кДНК или малых РНК шпильки (shRNAs) для интересующих генов, что облегчает механистические исследования функций экспрессии генов на эритропоэз 11,13,14. С другой стороны, высокая скорость роста клеток может быть обоюдоострым оружием, так как трудно характеризуют функции генов в различных стадиях терминала эритропоэза. В большинстве случаев, трудно определить, является ли конкретные функции генов в ранней стадии терминального эритропоэза так как по времени кДНК или shRNAs выраженной, клетки уже прошли раннюю стадию. Чтобы решить эту проблему, мы разработали уникальную систему, чтобы вскрыть ранние и поздние этапы терминала эритропоэза. Для ранней стадии терминала эритропоэза, генетически модифицированные Ter119 отрицательные эритробластов культивировали в EPO-свободного среды, но содержащий фактор стволовых клеток (SCF), ИЛ-6 и FLT3лиганд сохранить свой ​​статус предшественников и позволяют трансдуцированных кДНК или ShRNA выражению 13. Клетки были изменены на Epo, содержащей среду после 12 часов, чтобы индуцировать пролиферацию и дифференцировку клеток. Таким образом, когда клетки начали дифференцироваться, уже выразили трансдуцированных кДНК или shRNAs. Для поздней стадии терминального эритропоэза, Ter119 отрицательные эритробласты культивировали в ЭПО сразу среде, содержащей после трансдукции. Таким образом, можно проанализировать функции генов, представляющих интерес в поздней стадии терминального эритропоэза. Таким образом, широкое применение этой системы поможет рассекать функций генов в различных стадиях терминала эритропоэза.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s MediumIMDM (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GEMINI Bio-product</td>
			<td>700-102P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mecaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>0.1 M in IMDM,&#160; 4&#8451;stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30034.01</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem cell factor (SCF)</td>
			<td>STEMCELL TECH</td>
			<td>2630</td>
			<td>100 ng/ul, -20&#8451; stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L)</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>14-8001-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)&#160;</td>
			<td>GEMINI Bio-product</td>
			<td>300-327P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fibronectin</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>STEMCELL TECH</td>
			<td>9300</td>
			<td>10% stock in IMDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution, human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>4&#8451; stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>holo-transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0665</td>
			<td>50 mg/ml in Water -20&#8451; stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythropoietin(Epo)</td>
			<td>PROCRIT</td>
			<td>NOC 59676-303-00</td>
			<td>3,000 U/ml stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin particles Plus</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL TECH</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse fetal liver culture system to dissect target gene functions at the early and late stages of terminal erythropoiesis

Эритропоэз включает динамический процесс, который начинается с решимости эритроидная пакетных единиц (БОЕ-ES) с последующим быстро делящиеся эритроидного колониеобразующих единиц (КОЕ-ES). После КОЕ-Эс, клетки морфологически узнаваемым и обычно называют терминальные эритробласты. Одна из проблем для изучения терминала эритропоэза является отсутствие экспериментальных подходов рассекать функций генов в хронологическом порядке. В этом протоколе, мы описываем уникальную стратегию, чтобы определить функции генов в ранних и поздних стадиях терминального эритропоэза. В этой системе, мышь плода Ter119 печени (маркер зрелых эритроидных клеток) отрицательные эритробластов очищали и трансдуцированных экзогенной экспрессии кДНК или малых РНК шпильки (shRNAs) для интересующих генов. Затем клетки культивировали в среде, содержащей факторы роста других, чем эритропоэтин (ЕРО), чтобы поддерживать их предшественников этап в течение 12 часов, позволяя экзогенные кДНК или shRNAsвыразить. Клетки были изменены на Epo среды после 12 часов, чтобы индуцировать дифференцировку и пролиферацию клеток, а экзогенные генетические материалы были уже выражены. Этот протокол облегчает анализ генных функций в ранней стадии терминального эритропоэза. Для изучения поздно терминала эритропоэз стадии, клетки немедленно культивировали в Эпо среду после трансдукции. Таким образом, эти клетки уже дифференцированы в поздней стадии эритропоэза терминала, когда были выражены трансдуцированных генетические материалы. Мы рекомендуем общее применение этой стратегии, которая помогла бы понять подробные функций генов в различных стадиях терминала эритропоэза.

Рисунок 1 описывает экспериментальные стратегии. Протокол состоит из двух независимых условий для таргетинга функции сигнальных молекул в ранних и поздних стадиях терминального эритропоэза. Ter119 отрицательные плода эритробласты печени были очищены от E13.5 мыши плода. Проточн?...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis at JoVE.com

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Мы представляем в пробирке мыши плода систему культуры эритробласт печени, что рассекает ранние и поздние этапы терминала эритропоэза. Эта система облегчает функциональный анализ специфических генов в разных стадиях развития.

Мышь фетальной печени Культура Система рассекать гена-мишени Функции на ранних и поздних стадиях терминала эритропоэза

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

A Hierarchical Stem-Cell System: Blood Cell Formation

SCIENTISTS IN ACTION

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Использование BLT Humanized мышь в качестве стволовых клеток на основе модели генной терапии опухолей

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Многоцелевой параллельный подход для обработки Гена на элемент структуры Определение гриппа с использованием полимеразной PB2 субъединицы

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Протокол для анализа вируса гепатита С репликации

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Коровьей оспы Reporter Вирусы для Количественная Вирусный функции на всех этапах экспрессии генов

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Выделение лейкоцитов из мышиного тканей на матери и плода интерфейс

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

Человеческие Культуры плацентарной и децидуальной Орган по изучению инфекций на материнской плода интерфейс

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Проточной цитометрии на основе анализа на мониторинге NK клеточных функций

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Разработка системы Вирус Reporter гепатита B для мониторинга на ранних стадиях цикла репликации

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Поколение побег вариантов нейтрализующих антител моноклональных вирус гриппа

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...