Name: mouse fetal liver culture system to dissect target gene functions at the early and late stages of terminal erythropoiesis
Uploaded: 2014-09-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis at JoVE.com

Denna studie stöddes av NIH R00HL102154 och en American Society of Hematology lärd utmärkelse till P Ji.

De experiment som beskrivs i detta protokoll har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av Northwestern University Institutional Animal Care och användning kommittén. 1 Beredning av odlingsmedium <ol><li> Förbered fibronektinlösningen. Tillsätt 1 ml vatten till en flaska med humant fibronektin (1 mg). Lämna lösningen i vävnadsodling huva i 30 minuter utan att röra. Överför den totala vätskan till 50 ml PBS för att göra en slutlig koncentration av 20 | ig /...

<ol>
	<li>Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+stem+cell+to+red+cell:+regulation+of+erythropoiesis+at+multiple+levels+by+multiple+proteins,+RNAs,+and+chromatin+modifications.">From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications.</a> Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).</li><li>Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+cells+red:+signal+transduction+mediated+by+erythropoietin.">Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin.</a> Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).</li><li>Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha4beta1+integrin+and+erythropoietin+mediate+temporally+distinct+steps+in+erythropoiesis:+integrins+in+red+cell+development.">Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development.</a> The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).</li><li>Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+by+erythropoietin+of+viability+and+maturation+of+murine+erythroid+precursor+cells.">Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells.</a> Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).</li><li>Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+2+is+required+for+chromatin+condensation+and+subsequent+enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts.">Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts.</a> Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).</li><li>Dumitriu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox6+cell-autonomously+stimulates+erythroid+cell+survival,+proliferation,+and+terminal+maturation+and+is+thereby+an+important+enhancer+of+definitive+erythropoiesis+during+mouse+development.">Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development.</a> Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).</li><li>Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+hematopoietic+stem+cell+isolation+methods.">Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods.</a> Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).</li><li>Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+characterization+and+isolation.">Hematopoietic stem cell characterization and isolation.</a> Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).</li><li>Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+control+of+terminal+erythropoiesis+via+physical+interactions+among+erythroid+cells.">Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells.</a> Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).</li><li>Bhatia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+fatty+acid-mediated+effects+on+erythropoiesis+in+primary+definitive+erythroid+cells.">Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells.</a> Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).</li><li>Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ras+signaling+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+cells:+functional+analysis+by+a+flow+cytometry-based+novel+culture+system.">Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system.</a> Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).</li><li>Socolovsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).</li><li>Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts+requires+Rac+GTPases+and+mDia2.">Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2.</a> Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).</li><li>Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytokine+signaling+molecules+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+hematopoietic+cells:+functional+analysis+of+signaling+molecules+by+retrovirus-mediated+expression.">Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression.</a> Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).</li><li>Patel, V. P., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fibronectin+matrix+is+required+for+differentiation+of+murine+erythroleukemia+cells+into+reticulocytes.">A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes.</a> The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).</li><li>Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin-induced+suppression+of+erythropoiesis:+the+role+of+erythropoietin+and+a+heme+synthesis+stimulating+factor.">Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor.</a> Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).</li><li>Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+erythropoiesis.">New insights into erythropoiesis.</a> Current opinion in hematology. 9 (2), 93-100 (2002).</li></ol>

Här presenterar vi ett unikt system för att kronologiskt analysera musfosterlever terminal erytropoes. Genom tillämpningen av olika odlingsbetingelser, framgångsrikt dissekerade vi terminal erytropoes i tidiga och sena stadier. Detta är särskilt viktigt för att bestämma mekanismerna i gener med flera funktioner. Exempelvis Rac GTPases spelar viktiga roller i olika stadier av terminal erytropoes. Hämning av Rac GTPases i det tidiga stadiet av terminal erytropoesstimulerande påverkar celldifferentiering och prol...

Erytropoes är processen för differentiering av multipotenta hematopoetiska stamceller till mogna erytrocyter. Denna stegvisa process omfattar bildandet av engagerade erytroid burst bildande enheter (BFU-Es), de snabbt delande erytroida kolonibildande enheter (CFU-Es) och morfologiskt igenkännliga erytroblaster 1,2. Terminal erytropoesen från CFU-E progenitorceller involverar sekventiell erytropoietin-beroende och oberoende steg 2,3. I det tidiga skedet av terminal erytropoes Erytropoietin (Epo) binder till dess receptor på cellytan och inducerar en serie nedströms signalvägar som förhindrar cell apoptos och befrämja snabb celldelning och genuttryck 1,4. I sent skede av terminal erytropoes erytroblaster genomgår terminal cellcykel exit, kromatin och nucleus kondens, och extrudering av de mycket kondenserade kärnor 5. Vår förståelse av terminalerytropoes har förbättrats avsevärt under de senaste decennierna, vilket till stor del beror på den framgångsrika användningen av flera in vitro och in vivo musmodeller 6-9. Bland dessa modeller, in vitro-kultur av musfosterlever erytroblaster ger många fördelar inklusive enkel cellrening, snabb proliferation och differentiering, samt en närmare härma människors erytropoes 10,11. I detta system kan ett stort antal erytrocyternas stamceller från mus fetala levrar lätt isoleras genom den enda steg reningen av TER119 (en markör för de mogna erytroidceller) negativa erytroblaster. Under tvådagarskultur erytroblasterna, kan differentiering av dessa celler att övervakas av en flödescytometrisk analys baserad på ytan uttryck för transferrinreceptorn (CD71) och TER119 antigen 12. Dessutom kan enucleation av de terminalt differentierings erytroblaster detekteras genom en DNA kokare (Hoechst 33342) 13. Dessutom de renade stamceller kan genetiskt modifieras genom exogen expression av cDNA eller små hårnål RNA (shRNAs) för gener av intresse, vilket underlättar mekanistiska studier av funktioner genuttryck på erytropoies 11,13,14. Å andra sidan, kan den snabba celltillväxthastigheten vara ett dubbeleggat svärd, eftersom det är svårt att karakterisera genfunktioner i olika stadier av terminal erytropoes. I de flesta fall är det svårt att avgöra om en specifik gen fungerar i det tidiga stadiet av terminal erytropoes sedan när cDNA eller shRNAs uttryckt, de celler som redan passerat tidigt stadium. För att lösa detta problem har vi utvecklat ett unikt system för att dissekera de tidiga och sena stadier av terminal erytropoes. För det tidiga stadiet av terminal erytropoes genmodifierade TER119 negativa erytroblaster odlades i Epo-fritt medium men innehållande stamcellsfaktor (SCF), IL-6 och FLT3ligand att behålla sin stamfader status och låta de omvandlade cDNA eller shRNA till uttryck 13. Cellerna byttes till Epo innehållande medium efter 12 h för att inducera cellproliferation och differentiering. På detta sätt, när cellerna började att differentiera, de transducerade cDNA-sekvensema eller shRNAs redan uttrycks. För sent skede av terminal erytropoes TER119 negativa erytroblaster odlades i Epo innehållande medium omedelbart efter transduktion. Därför kan man analysera funktionerna hos gener av intresse i det sena stadiet av terminal erytropoes. Sammanfattningsvis skulle en bred tillämpning av detta system hjälpa dissekera genfunktioner i olika stadier av terminal erytropoes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s MediumIMDM (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GEMINI Bio-product</td>
			<td>700-102P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mecaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>0.1 M in IMDM,&#160; 4&#8451;stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30034.01</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem cell factor (SCF)</td>
			<td>STEMCELL TECH</td>
			<td>2630</td>
			<td>100 ng/ul, -20&#8451; stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L)</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>14-8001-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)&#160;</td>
			<td>GEMINI Bio-product</td>
			<td>300-327P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fibronectin</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>STEMCELL TECH</td>
			<td>9300</td>
			<td>10% stock in IMDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin solution, human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>4&#8451; stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>holo-transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0665</td>
			<td>50 mg/ml in Water -20&#8451; stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythropoietin(Epo)</td>
			<td>PROCRIT</td>
			<td>NOC 59676-303-00</td>
			<td>3,000 U/ml stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin particles Plus</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL TECH</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse fetal liver culture system to dissect target gene functions at the early and late stages of terminal erythropoiesis

Erytropoes innebär en dynamisk process, som börjar med engagerade erytroid skurbildande enheter (BFU-Es) följt av snabbt delande erytroid kolonibildande enheter (CFU-Es). Efter CFU-Es, cellerna morfologiskt igenkännliga och allmänt benämns terminal erytroblaster. En av utmaningarna för att studera terminal erytropoes är bristen på experimentella metoder för att dissekera genfunktioner i kronologisk sätt. I detta protokoll, beskriver vi en unik strategi för att bestämma genen fungerar i de tidiga och sena stadier av terminal erytropoes. I detta system var musfosterlever TER119 (mogna erytroid cellmarkör) negativa erytroblaster renades och transducerades med exogen expression av cDNA-sekvenser eller små hårnåls RNA (shRNAs) för generna av intresse. Cellerna därefter odlas i medel innehåller andra än erytropoietin (Epo) att behålla sin stamfader scen för 12 timmar samtidigt som de exogena cDNA eller shRNAs faktorer tillväxtatt uttrycka. Cellerna ändrades till Epo mediet efter 12 h för att inducera celldifferentiering och proliferation medan de exogena genetiska material redan uttryckt. Detta protokoll underlättar analys av genfunktioner i ett tidigt skede av terminal erytropoes. För att studera sent skede terminal erytropoes cellerna omedelbart odlas i Epo mediet efter transduktion. På detta sätt cellerna redan differentierade för det sena stadiet av terminal erytropoes när de omvandlade genetiskt material uttrycktes. Vi rekommenderar en allmän tillämpning av denna strategi som skulle hjälpa att förstå detaljerade genfunktioner i olika stadier av terminal erytropoes.

Figur 1 visar vilka experimentella strategier. Protokollet består av två oberoende villkor för inriktning funktionerna hos de signalmolekyler i de tidiga och sena stadier av terminal erytropoes. TER119 negativa fetala lever erytroblaster renades från E13.5 mus foster. Flödescytometrisk analys av fetala lever erytroida celler före och efter reningen visade att reningen var effektiv (figurerna 2A och 2B). För det tidiga stadiet av terminal erytropoes (fig 1...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis at JoVE.com

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Vi presenterar en in vitro musfosterlever erytroblast kultursystem som dissekerar de tidiga och sena stadier av terminal erytropoes. Detta system underlättar funktionsanalys av specifika gener i olika utvecklingsstadier.

Musfosterlever Culture System att dissekera målgen funktioner på tidiga och sena stadier av Terminal Erythropoiesis

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

A Hierarchical Stem-Cell System: Blood Cell Formation

SCIENTISTS IN ACTION

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Använda BLT Humaniserad Pigg som en stamcell baserad genterapi tumörmodell

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Multi-mål Parallel Processing Approach för Gene-till-struktur Fastställande av influensa polymeras PB2 Subenhet

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Ett protokoll för Analysera hepatit C-virus replikering

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Vaccinia Reporter Virus för kvantifiering Viral funktion i alla skeden av genuttryck

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolering av leukocyter från Murina vävnader på Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

Human placenta och decidual Organ kulturer att studera Infektioner hos moder och foster gränssnitt

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Flödescytometri-baserad analys för övervakning av NK cellfunktioner

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Utveckling av en hepatit B-virus Reporter system för att övervaka de tidiga stadierna av replikationscykeln

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generation av Escape varianter av neutraliserande influensa Virus monoklonala antikroppar

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...