Name: generation of enterobacter sp. ysu auxotrophs using transposon mutagenesis
Uploaded: 2014-10-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis at JoVE.com

Автор хотел бы поблагодарить всех моих студентов Независимый исследовательский студентов и всех моих Микробная физиологии аспирантов, протестированных мои транспозонов мутагенеза идеи в течение 2010-2014 весенних семестра. Эта работа финансировалась Департаментом биологических наук в государственном университете Янгстауна.

1. Электропорация компетентных клеток 5,11 <ol><li> Развести в O / N LB культуру Enterobacter зр. ЕГУ 1/20 в 50 мл свежей LB среде и расти при встряхивании при 120 оборотах в минуту и ​​30 ° C до оптической плотности (600 нм) между 0,4 и 0,6. При желании, растут другие бактериальные штаммы в их оптимально?...

<ol>
	<li>Kim, B. H., Gadd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial physiology and metabolism. , (2008).</li><li>Hayes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-based+strategies+for+microbial+functional+genomics+and+proteomics.">Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics.</a> Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).</li><li>Hoffman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+chromosomal+gene+disruption+in+vivo+using+transposomes.">Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes.</a> Methods in molecular biology. 765, 55-70 (2011).</li><li>Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+transposon+mutagenesis+by+electroporation+of+released+Tn5+transposition+complexes.">Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes.</a> Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Transformation+of+E.+coli+by+High+Voltage+Electroporation.">High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+rep+technique+for+allele+replacement+to+construct+new+Escherichia+coli+hosts+for+maintenance+of+R6K&#947;+origin+plasmids+at+different+copy+numbers.">Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6K&#947; origin plasmids at different copy numbers.</a> Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).</li><li>Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Sch&#228;ffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Database+indexing+for+production+MegaBLAST+searches.">a Database indexing for production MegaBLAST searches.</a> Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).</li><li>Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences.">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).</li><li>Holmes, A., Vinayak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+multimetal+resistant+bacterial+strains:+Enterobacter+sp.+YSU+and+Stenotrophomonas+maltophilia+OR02.">Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02.</a> Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).</li><li>Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposome+insertional+mutagenesis+and+direct+sequencing+of+microbial+genomes.">Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes.</a> Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).</li><li>Ausubel, F., Brent, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1997).</li><li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, (1992).</li><li>Gibson, M. I., Gibson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+studies+on+the+isolation+and+metabolism+of+an+intermediate+in+aromatic+biosynthesis:+chorismic+acid.">Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid.</a> The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).</li><li>Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).</li><li>Reznikoff, W., Winterberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-Based+Strategies+for+the+Identification+of+Essential+Bacterial+Genes.">Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes.</a> Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).</li><li>Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+genome+deletion+methods+applicable+to+prokaryotes.">Random genome deletion methods applicable to prokaryotes.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).</li><li>Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knowledge-making+distinctions+in+synthetic+biology.">Knowledge-making distinctions in synthetic biology.</a> BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).</li><li>Zheng, Y. -. N., Li, L. -. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Problems+with+the+microbial+production+of+butanol.">Problems with the microbial production of butanol.</a> Journal of industrial microbiolog., &amp; biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).</li></ol>

Транспозонов мутагенеза, используя transposome является эффективным инструментом для создания ауксотрофов в Enterobacter зр. ЕГУ и других видов грамотрицательных и грамположительных бактерий 3,4. Процесс был инициирован введения Tn ​​5 -derived transposome в хозяина путем электропорации. Д...

Прототрофных бактерии растут в М-9 минимальную солевую среду, содержащую глюкозу (М-9 среде), превращение глюкозы через центральные путей метаболизма углерода генерировать предшественники, такие как аминокислот, нуклеиновых кислот и витамины, для биосинтеза 1. М-9 среда содержит хлорид аммония в качестве источника азота, натрия и фосфат калия в качестве буфера и источника фосфора, сульфата магния в качестве источника серы и глюкозы в качестве источника углерода и энергии. Лурия-Bertani (LB) среда богата аминокислотами из триптона и в витаминах и ростовых факторов из дрожжевого экстракта. Он поддерживает рост ауксотрофов, что не может синтезировать аминокислоты, витамины и другие факторы роста, необходимые для роста на М-9 среде. Таким образом, прототрофов вырастет в LB и М-9 среде, в то время как ауксотрофы вырастет в LB среде, но не в М-9 среде. Вводя мутации в прототрофным популяции бактерий и идентификации мутантных генов, которые вызывают ауксотрофные фенотипы, это роssible, чтобы получить лучшее представление о метаболизме в бактериальном штамме. Транспозонов мутагенез может быть использован для идентификации многих генов, необходимых для роста на глюкозе в М-9 среде. Транспозоны включить себя случайно в геном хозяина 2. К пятнистость транспозона трансформантов на LB чашках с агаром и их реплик на М-9 средних чашках с агаром, можно показать на экране для ауксотрофов. Прерванный гены идентифицированы через гена спасения. Это исследование использует имеющиеся в продаже Tn 5 -derived transposome который поставляется в качестве решения линейного сегмента транспозонов ДНК смешивается с транспозазы белка. Сегмент ДНК отсутствует ген транспозазы, но содержит ген устойчивости к канамицину, на γ начала репликации R6K и две мозаичные мотивы, которые Последовательности ДНК для связывания транспозазы на каждом конце сегмента 3,4. Поскольку белок транспозаза добавляют непосредственно к ДНК, ДНК-фрагмента в одиночкуопределяется как транспозона, и белковый комплекс ДНК / транспозаза определяется как transposome. Transposome преобразуется путем электропорации в 5 чувствительного к канамицину хоста (фиг.1А). Колонии, которые растут на чашках с агаром LB, содержащей канамицин (LB-кан) имеют транспозона вставок (рис 1б), и реплики покрытием трансформантов, которые не расти на М-9 средних пластин агара, содержащей канамицин (М-9-кан) являются ауксотрофы (Figire 1С). Геномную ДНК из мутанта очищают и частично переваривают с 4-щелочного рестрикции эндонуклеазы резки, BFU CI (рис 1D). Сшита ДНК трансформируют в штамм Escherichia coli (E.coli), который содержит ген PIR (рис 1E). Этот ген позволяет новую плазмиду, содержащую транспозона и фланговые области хромосомы хозяина для репликации в E. палочка 6. Ген устойчивости к канамицину служит в качествеelectable маркер для новой плазмиды. Наконец, секвенирования с использованием праймеров, комплементарных каждом конце транспозонов и Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) анализа 7,8 полученной последовательности используются для определения идентичности прерванной генов. Эта стратегия transposome мутагенеза обеспечивает три преимущества 3. Во-первых, так как этот белок связывается транспозаза непосредственно к транспозона, вставка не зависит от экспрессии гена транспозазы в хосте. После того, как транспозона включает себя в геном хозяина, транспозаза ухудшается, предотвращая дополнительное движение транспозона. Однако, дополнительное движение не может быть предотвращено, если хост имеет эндогенный Tn 5 транспозиционные элемент. Во-вторых, введение transposome путем электропорации дает возможность использовать его в различных хостов. Это также устраняет необходимость введения транспозон бактериальной конъюгации или В.И.RAL инфекция. Оба процесса требуют восприимчивость хозяина. В-третьих, включение гена устойчивости к канамицину и γ репликации происхождения R6K в transposome делает его легче идентифицировать прерванный ген. Транспозона-прерывается регионы могут быть сохранены и секвенировали как плазмиды, устраняя необходимость использования обратной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации генов. Протокол, представленные в этом видео описывается каждый шаг для транспозонов мутагенеза Enterobacter зр. ЕГУ 9 использованием transposome от его введения в бактериальных клеток к идентификации предполагаемого гена он прервал. В дополнение к ранее опубликованным протоколам 3,4,10, подробные способы использования реплик для скрининга ауксотрофов представлены. Эта техника мутагенеза может быть использован для исследования других фенотипы, например, антибиотиков и металлических сопротивлений, в различных видов бактерий, для идентifying минимальное число генов, необходимых для роста при определенных условиях культивирования в синтетических исследований биологии, или для обучения лабораторный компонентом генетики или микробной физиологии конечно.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="707">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EZ-Tn5 R6K&#947;ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">TSM08KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir+ Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">ECP09500</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a low copy number</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">EC6P095H</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a high copy number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5X M-9 Salts</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">DF048517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lennox LB Broth</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1427-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J637-1KG</td>
			<td style="width:227px;">Solid media contained 1.6% (w/v) agar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kanamycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0408-25G</td>
			<td style="width:227px;">When required, media contained 50 &#956;g/ml kanamycin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D-Glucose Monohydrate</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J850-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J859-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">X190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgSO2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:227px;">0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BfuC I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0636S</td>
			<td>Partial digestion of genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xho I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td>Plasmid digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nuclease Free Water</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">E476-1L</td>
			<td style="width:227px;">For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GenomeLab DTCS - Quick Start Kit</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">608120</td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1120A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1460</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replica Plating Block</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Velveteen Squares</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-2</td>
			<td>Replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PetriStickers</td>
			<td style="width:145px;">Diversified Biotech</td>
			<td style="width:119px;">PSTK-1100</td>
			<td>Grid for replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Pulser II</td>
			<td style="width:145px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Electroporation Cuvettes &#8211; 2 mm</td>
			<td style="width:145px;">BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">E-5010-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CentriVap DNA Vacuum Concentrator</td>
			<td style="width:145px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970010</td>
			<td>Drying DNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CEQ 2000XL DNA Analysis System</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vector NTI Advance 11.5.0</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12605099</td>
			<td>DNA sequence analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of enterobacter sp. ysu auxotrophs using transposon mutagenesis

Прототрофных бактерии растут на М-9 минимальную солевую среду, дополненную глюкозы (М-9 среде), который используется в качестве источника углерода и энергии. Ауксотрофов могут быть получены с использованием transposome. Коммерчески доступны, Tn 5 -derived transposome используется в данном протоколе состоит из линейного сегмента ДНК, содержащей γ начала репликации R6K, ген устойчивости к канамицину и две мозаики последовательности концах, которые служат в качестве сайтов связывания транспозазу. Transposome, предоставляется в качестве белкового комплекса ДНК / транспозазы, вводится путем электропорации в прототрофных в штамме Enterobacter, уд. ЕГУ, и случайным образом включает себя в геном этого хозяина. Трансформанты реплика была помещена на Лурии-Бертани агаром, содержащих канамицин, (LB-KAN) и с агаром, М-9-среды, содержащей канамицин (M-9-KAN). Трансформанты, которые растут на LB-кан пластин, но не на M-9-кан пластин считаются ауксотрофы. Очищенная геномнаяДНК из ауксотроф частично переваривается, лигирована и преобразован в PIR + кишечной палочки (E.coli) штамма. Репликация Происхождение R6Kγ позволяет плазмиды повторить в PIR + E. штаммы кишечной палочки, а также резистентность к канамицину маркер позволяет выбрать плазмиды. Каждый трансформант обладает новую плазмиду, содержащую транспозона фланкированную прерванного хромосомной области. Сэнгер секвенирования и Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) предложить предполагаемый личность прерванной гена. Есть три преимущества использования этой transposome стратегию мутагенеза. Во-первых, она не зависит от экспрессии гена транспозазы хостом. Во-вторых, transposome вводится в целевом узле путем электропорации, а не путем конъюгации или трансдукции и, следовательно, является более эффективным. В-третьих, репликация происхождение R6Kγ позволяет легко идентифицировать мутантный ген, который частично восстановлены в рекомбинантной плазмиде. Этот метод может быть использован, чтобы исследовать гены, участвующие в других характеристик Enterobacter SP. ЕГУ или более разнообразных бактериальных штаммов.

Трансформация Enterobacter зр. ЕГУ путем электропорации с transposome инициирован случайную вставку генома в геном хозяина (рис 1а, б). Успешный электропорации дали несколько тысяч трансформантов, которые росли на LB-кан пластин. Чтобы получить 300-400, хорошо разнесены колоний на чашку, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis at JoVE.com

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter зр. ЕГУ растет в глюкозе минимальную солевую среду. Ауксотрофов генерируются путем преобразования его с transposome которые случайно вставляет себя в геном хозяина. Мутанты найден реплик из сложной среды в минимальной среде. Прерванный гены обозначаются гена спасения и секвенирования.

Создание<em&gt; Enterobacter</em&gt; Зр. ЕГУ ауксотрофов Использование транспозонный мутагенез

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Домашний сайт направленного мутагенеза Всего Плазмиды

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Генерация РНК / ДНК гибридов в геномной ДНК с помощью преобразования с помощью РНК-содержащих олигонуклеотидов

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Мутагенеза и функционального анализа ионных каналов Heterologously Выраженный в клетках млекопитающих

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

Введение в Worm Лабораторная работа: от культивирования червей для мутагенеза

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Мутагенеза и функциональные Выбор протоколов для направленной эволюции белков в Е. палочки</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Одноместный мутагенеза бисульфит ооцитов

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Быстрое и эффективное данио рерио Генотипирование Использование ПЦР с высоким разрешением расплава анализа

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

Эффективное плюрипотентных клеток поколения от крови Использование эписом и HDAC ингибиторов

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Протокол для функциональной оценки цельного белка Насыщенность мутагенеза библиотек Использование высокого секвенирования

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...