Name: real-time cytotoxicity assays in human whole blood
Uploaded: 2014-11-07T15:00:00
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Nous remercions programme IMAT National Cancer Institute des NIH pour le financement de ce travail [R33 CA174616-01A1].

1. Préparation cellulaire cible <ol><li> Maintenir (cellules par exemple. Raji du lymphome) Les cellules cibles dans des milieux de croissance (milieu RPMI 1640 de la culture, avec 10% de sérum inactivé par la chaleur bovin fœtal (FBS), 4 nM de L-glutamine et 500 UI / ml de pénicilline / streptomycine) à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon pour former un culot des cellules cibles dans un tube de 15 ml. durée de centrifugation varie en ...

<ol>
	<li>Hutchinson, L., Kirk, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+drug+attrition+rates--where+are+we+going+wrong.">High drug attrition rates--where are we going wrong.</a> Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).</li><li>Moreno, L., Pearson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attrition+rates+be+reduced+in+cancer+drug+discovery.">Attrition rates be reduced in cancer drug discovery.</a> Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).</li><li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+Host+Response+to+Injury,+Large+Scale+Collaborative+Research+Program.+Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).</li><li>Suntharalingam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+storm+in+a+phase+1+trial+of+the+anti-CD28+monoclonal+antibody+TGN1412.">Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412.</a> N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).</li><li>Eastwood, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+TGN1412+trial+failure+explained+by+species+differences+in+CD28+expression+on+CD4++effector+memory+T-cells.">Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells.</a> Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).</li><li>Hsiao, S. 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Y., Weiner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rituximab:+a+review+of+its+use+in+non-Hodgkin&#8217;s+lymphoma+and+chronic+lymphocytic+leukemia.">Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin&#8217;s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia.</a> Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).</li><li>Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+in+clinical+oncology.">Monoclonal antibodies in clinical oncology.</a> Anticancer Agents Med Chem. 8, 523-532 (2008).</li><li>Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. 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B., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening:+seeing+is+believing.">High content screening: seeing is believing.</a> Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).</li><li>Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image+analysis+for+high-content+screening+and+analysis.">Automated image analysis for high-content screening and analysis.</a> J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).</li><li>Sundberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+ultra-high-throughput+screening:+solution-+and+cell-based+approaches.">High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches.</a> Current Opinion in Biotechnology. 11, 47 (2000).</li><li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+is+more+than+genomic+medicine:+confusion+over+terminology+impedes+progress+towards+personalized+healthcare.">Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare.</a> PERS MED. 9, 85 (2012).</li></ol>

AOC est une critique en outil de dépistage anti-cancer in vitro avec une résolution cellulaire unique 12-16, idéalement utilisé après des projections de cibles traditionnels tels que CDC et analyses ADCC 9-11, et avant que les tests précliniques animales. Actuellement, les tests de dépistage de cibles primaires tels que CDC ou ADCC essais sont effectués par un support simplifiés ou un système tampon. Toutefois, les candidats médicaments qui montrent une efficacité dans...

Les progrès récents dans l&#39;industrie pharmaceutique ont conduit à un intérêt accru dans la réalisation des identifications spécifiques des anticorps contre les cellules de la tumeur et des traitements personnalisés du cancer; Toutefois, plusieurs obstacles sont rencontrés dans le processus. Seulement 5% des agents qui ont une activité anticancéreuse en développement préclinique sont autorisés après avoir montré une efficacité suffisante dans la phase des essais II-III 1,2. Les stratégies précliniques (à la fois in vitro et in vivo) sont sous-optimaux comme de nombreux exemples ont montré que les médicaments anti-tumoraux chez les humains se comportent différemment et chez les animaux de laboratoire, principalement en raison de leurs différents composants sanguins 3-5. Pour répondre à la nécessité d&#39;une plate-forme de criblage de médicaments anti-tumorale et de fournir un point de contrôle avant l&#39;expérimentation animale coûteux et des essais cliniques, tout un test de cytotoxicité de sang humain (WCA) est proposé pour évaluer antitumorale l&#39;efficacité des médicaments dans un environnement biologique plus pertinente. Leessai de cytotoxicité de sang total peut être utilisé pour évaluer la réponse de cellules individuelles à des anticorps et d&#39;autres médicaments candidats dans le sang total humain. L&#39;AOC est développé en intégrant la technologie à haut débit positionnement cellulaire avec à haut débit et à haute teneur en imagerie 6. En utilisant un système d&#39;imagerie automatisée, le nombre de deux cellules vivantes et mortes peut être déterminée avec un degré élevé de précision. En raison du fait que les cellules cibles sont immobilisées sur le même plan focal, WCA est capable de fournir une analyse de cytotoxicité quantitative en temps réel sans l&#39;élimination des globules rouges. En outre, le système d&#39;imagerie automatique offre plusieurs avantages tels que que seules les cellules cibles qui ont atteint les critères spécifiques (par exemple, les cellules. Marquées par fluorescence, et la morphologie des cellules) sont bloquées et transformés. De plus, il permet la production de 144 plaques par jour. Par conséquent, cette capacité d&#39;imagerie et de débit permet l&#39;exécution de haute contenu et expériences à haut débit simultanément. En combinant WCA et le système de formation d&#39;image automatisé, à haut débit analyse quantitative de la cytotoxicité cellulaire peut être réalisée dans un environnement plus pertinent biologique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="761">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:135px;">Name/Discription</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:336px;">Cell attachment 96 well plate kits&#160;</td>
			<td style="width:172px;">Adheren</td>
			<td style="width:119px;">AP9601</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:336px;">Suspension Single cell array 8 well chamber slide</td>
			<td style="width:172px;">Adheren</td>
			<td style="width:119px;">SS0801</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:336px;">Adherent Single cell array 8 well chamber slide</td>
			<td style="width:172px;">Adheren</td>
			<td style="width:119px;">SS0802</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Lymphoma cell line CD20+</td>
			<td style="width:172px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-86</td>
			<td style="width:135px;">Raji cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Lymphoma cell line CD20-</td>
			<td style="width:172px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-8083</td>
			<td style="width:135px;">MC/CAR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11875-119</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:172px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">SH30070.01HI</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Peni/Strep</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15070063</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Cytosolic dye</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C7025</td>
			<td style="width:135px;">Cell Tracker Green</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Rituxan (Biosimilar)&#160;</td>
			<td style="width:172px;">Eureka Therapeutics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Human whole blood</td>
			<td style="width:172px;">Allcells</td>
			<td style="width:119px;">WB001</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4170-10MG</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Automatic imaging system</td>
			<td style="width:172px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">Contact Vendor</td>
			<td style="width:135px;">Cell Reporter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Cell counting program</td>
			<td style="width:172px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">Contact Vendor</td>
			<td style="width:135px;">Cell Reporter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time cytotoxicity assays in human whole blood

Un essai de cytotoxicité sang total à base de cellules vivantes (WCA) qui permet l&#39;accès à l&#39;information temporelle de la cytotoxicité cellulaire global est développé avec une technologie de positionnement cellulaire à haut débit. Les populations de cellules tumorales cibles sont d&#39;abord pré-programmés de l&#39;immobilisation dans un format de réseau, et marquées avec des colorants fluorescents verts cytosoliques. Après la formation de la matrice de cellules, des médicaments anticorps sont ajoutés en combinaison avec du sang total humain. L&#39;iodure de propidium (PI) est ensuite ajouté à évaluer la mort cellulaire. Le réseau de cellules est analysée avec un système d&#39;imagerie automatique. Bien que les étiquettes de colorant cytosolique populations de cellules tumorales ciblées, PI étiquettes des populations de cellules tumorales mortes. Ainsi, le pourcentage de cancer de la destruction des cellules cibles peut être quantifiée par le calcul du nombre de cellules survivantes ciblées pour le nombre de cellules cibles mortes. Avec cette méthode, les chercheurs peuvent accéder en fonction du temps et de l&#39;information de la cytotoxicité cellulaire dépendant de la dose. Remarquablement, pas de radio dangereuxproduits chimiques sont utilisés. Le WCA présenté ici a été testée avec le lymphome, la leucémie, et les lignées cellulaires de tumeurs solides. Par conséquent, l&#39;AOC permet aux chercheurs d&#39;évaluer l&#39;efficacité des médicaments dans un état ​​très pertinente ex vivo.

Des anticorps anti-CD20 et des cellules de lymphome (cellules Raji et MC / CAR) a été choisi comme système modèle pour montrer l&#39;ensemble de dosage de cytotoxicité de sang (WCA) 7,8. Cellules Raji eu grand nombre de copies de CD20 sur la surface des cellules, tandis que les cellules MC / CAR avaient un faible nombre de copies de CD20 sur leur membrane. Cellules ciblées ont d&#39;abord été colorées en vert avec des colorants verts fluorescence cytosoliques et disposés sur la plaque de 96 puits. 1...

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Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

L&#39;ensemble du test de cytotoxicité de sang (WCA) est un test de cytotoxicité au point en incorporant la technologie de positionnement cellulaire à haut débit à la microscopie par fluorescence et un traitement d&#39;image automatique. Ici, nous décrivons comment les cellules de lymphomes traitées avec un anticorps anti-CD20 peuvent être analysés en temps réel dans le sang total humain pour fournir une analyse quantitative de la cytotoxicité cellulaire.

En temps réel cytotoxicité dans le sang total humain

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Evaluation de la fixation des nanoparticules dans les tumeurs en temps réel par imagerie intravitale

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Recherche

Médecine

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Le biofeedback IRMf en temps réel ciblage du cortex orbitofrontal contamination pour l&#39;anxiété

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Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

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There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

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Détection MicroRNA dans les tumeurs prostatiques par quantitative PCR en temps réel (qPCR)

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Mouvement recyclage en utilisant rétroaction en temps réel de la performance

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Induits par la chimiothérapie vasculaire Toxicité - en temps réel<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie de déficience navire

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