Name: an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents
Uploaded: 2014-09-24T13:00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

Relevante nationale og institutionelle etik bør indhentes, før du udfører dyreforsøg. 1. Fjernelse af EDL muskel og nerve <ol><li> Afvejes og dybt bedøver en voksen mus med inhaleret isofluoran ved hjælp af en fordamper med 5% isofluoran plus en 1,5 l / min ilt strømningshastighed eller en glasklokke med isofluoran gennemvædet bomuld på bunden. </li><li> Sørg for, at musen er dybt bedøvet, og reagerer ikke på en tå knivspids. Hurtigt halshugge hjælp af store, skarpe saks eller en guillotine. </li><li> Lav en ventral midterlinjen snit gennem ribbenene med en saks og fjerne de indre organer. </li><li> Skin dyret ved at tage fat i huden fra halsen området og trække den forbi fødderne. </li><li> Fjern benene ved at skære over hofterne og placere flået ben i en skål med afkølet (4 ° C), carbogenated (95% O2, 5% CO 2) lav calcium, høj magnesium bicarbonat-pufret saltopløsning containing i mM: 128 NaCI, 1,9 KCI, 1,2 KH 2 PO4 26. NaHCO3, 0,85 CaCl2, 6,5 MgSO4 og 10 glucose (pH på 7,4 ± 0,05) 16. Den lave calcium, høj magnesium opløsning inhiberer synaptisk transmission under dissektion. </li><li> Placer benene dorsalsiden op i skålen og sæt benene og hofter ned med nåle eller insekt ben, så knæ og ankelled er på en 90 ° vinkel. Sæt en nål i hver ende af fødder og et ben på hver af de forreste og bageste lår til at holde væv på plads. </li><li> Brug Castroviejo foråret saks, løft op det øverste lag af muskler på lår og lave en midterlinjen skæres at eksponere iskiasnerven direkte nedenfor. Ischiasnerven er placeret lige under den øverste muskel lag og løber over lårbenet fra dens udgang nær hofterne, indtil det grene i den fælles peroneal og tibiale nerve lige før knæleddet. </li><li> Tag musklen over iskiasnerven, indtil point, hvor de dybe peronealnerve gren dykker ned i flexor hallucis longus (FHL) muskel er synlig. </li><li> Brug af # 55 pincet, dissekere bindevævet omkring peroneal gren for at frigøre det fra gastrocnemius og soleus muskler, som på den mediale side af skinnebenet. Skær sener af gastrocnemius og soleus muskler og omhyggeligt fjerne dem fra under nerve. </li><li> Tag den overfladiske muskel på den laterale side af skinnebenet at eksponere tre forskellige sener bundter på ankelleddet-fra medialt for laterale: FHL, EDL, og tibialis anterior (TA), med EDL skjult under TA. </li><li> Skær TA senen på fodleddet, løft TA op og væk fra EDL, og skære musklen nær knæet at fjerne det. </li><li> Skær FHL senen ved anklen og løft den tilbage for at nå det område, hvor nerve ind i FHL. Skær lige under dette punkt og fjern • 2/3 af FHL musklen. </li><li> Skær iskiasnerven så tæt på hofteleddet som posligt og forsigtigt strimler væk alle nerve grene bortset fra den dybe peroneal gren. </li><li> Skær EDL sener på både ankel og knæled ved hjælp af store foråret saks. </li><li> Ved hjælp af en skarp saks, fjern EDL, de resterende FHL og nerve fra det omgivende væv ved at skære gennem skinnebenet knoglen ved knæet og halvvejs gennem låret. Skær væk den resterende tibiaknoglen så bare EDL, en del af FHL og nerve tilbage. </li></ol> 2. Montering af EDL muskel og nerve i vævsbadet (figur 1A) <ol><li> Før starten af ​​eksperimentet forberede vævsbadet. Konstant perfundere badet med iltet (100% O 2) syntetisk interstitiel væske (SIF) indeholdende (i mM) 123 NaCI, 3,5 KCI, 0,7 MgSO4, 1,7 NaH 2 PO4, 2,0 CaCl2, 9,5 NAC 6 H 11 O ( natriumgluconat), 5,5 glucose, 7,5 saccharose og 10 N -2-hydroxyethylpiperazine- N -2-ethanesulfonic syre (HEPES); pH 7,4 ± 0,05 17. En strømningshastighed på 15-30 ml / min anbefales. Vist er en kommercielt tilgængelig bad på 25 ml med to stimulerende elektroder fastgjort til bunden af ​​badet, en monteret væv post og en holder til en kraft og længde controller (ca. bad dimensionerne 8,5 cm x 3 cm x 1 cm, for specifikationer se tabel Materialer / udstyr). </li><li> Brug resterende FHL væv til at håndtere den isolerede muskel-nerve og placere den i vævsbadet. Placer en lille stykke Sylgard på bunden af ​​skålen og bruge et insekt stift gennem den resterende FHL væv at stabilisere musklen. </li><li> Brug 6-0 silkesuturer at binde begge sener og anbringer den ene ende til vævet post og den anden til løftearm på den kraft og længde controller (se tabel Materialer / Udstyr til specifikationer). Brug mindste sutur længde, der er praktisk. Fjern insekt pin og Sylgard efter du har bundet sener. BEMÆRK: For at gøre det nemtforbindelse til vægtstangsarmen et lille stykke ledning kan bøjes i en &quot;J&quot; formet krog og fastgøres i vægtstangsarmen med epoxy. Suturen kan derefter bindes til ledningen stedet skruet ind i det lille hul på vippearmen. </li><li> Gør sugeelektroder fra SA 16 glas ved først at bruge en glasmikropipette aftrækker (Heat = 286, Pull = 0, Velocity = 150, Time = 200); bryde spidsen tilbage og manuelt male det på en slibesten, indtil der er omkring en 3 mm taper. Smelt spidsen ved hjælp af en microforge til den ønskede spids indvendig diameter på mellem 10 til 100 um afhængigt af det område af nerve man ønsker at prøve fra (se figur 1B-1C til elektrode skematisk og tabel for Materialer / Udstyr til produktoplysninger). </li><li> Fyld en premade glas sugning elektrode til den indre sølvtråd med SIF. </li><li> Suge den afskårne ende af nerven i elektroden og forbindelse til den positive porten på en differensforstærker. Wrap elektrode med en chlorided sølvledning, der forbinder til den negative port hovedtrin. Jordforbinde SIF badet ved at køre en anden chlorided sølvtråd fra badet til hovedtrin hjemmebane port. Også jorde perfusionsslange til Faradays bur på flere punkter at afbøde elektrisk støj indføres via perfusionen pumper. </li><li> Stimulering musklen via elektroder monteret på hver side af musklen i vævsbadet for at fremkalde en trækning sammentrækning. Alternativt placeres en stimulerende elektrode på den afskårne ende af nerve. Øg stimulerende spænding, indtil der observeres et højdepunkt kontraktile kraft, og derefter øge spændingen med yderligere 15% for at nå supramaksimal spænding (0,5 msek puls bredde). Fortsæt trækningsreaktionerne sammentrækninger ved supramaksimal spænding med 10 sekunders hvile i mellem, men variere længden af musklen, indtil en maksimal kontraktil kraft er nået at finde den optimale længde (L o) musklen. Alle længde ramper og vibrationer vil begynde med muskler på denne Length. </li><li> Tillad muskel-nerve præparat forbliver i badet i mindst 1 time før efterfølgende indsamling af data for at tillade væv at nå badtemperatur og til normal synaptisk transmission at genvinde efter dissektion i en lav calciumopløsning. </li><li> At indsamle data på et andet sted end stuetemperatur temperatur, placere en temperatur sonde ind vævsbadet nær musklen. Langsomt bringe bad op til temperatur ved at pumpe opvarmet vand gennem vævsbadet bundpladen. Wrap ler microwavable varmepuder rundt SIF reservoir til at hjælpe med at opretholde en stabil temperatur. </li></ol> 3. Dataindsamling <ol><li> For at identificere en afferent som en spindel afferente, registrerer den neuronale aktivitet under gentagne ryk sammentrækninger produceret af en 0,5 msek supramaksimal spænding stimulus leveret en gang hvert sekund. BEMÆRK: Muskel spindel afferenter skal stoppe under spjæt sammentrækning 18,19 (figur 2). </li><li> Brug data erhvervelse software til at anvende længdeændringer ved forskellige hastigheder og forskellige længder. Brug et brugerdefineret script til at automatisere denne opgave (se supplerende oplysninger om et screenshot af manuskriptet og anvisninger på, hvordan du tilpasser strækninger i skemaet). Påfør rampe og hold strækninger af 4 sek ved stræk længder på 2,5%, 5%, og 7,5% L o og strække hastigheder på 20, 40 eller 60% L o / sek 15. BEMÆRK: Se brugervejledningen for specifik kraft og længde controller til nødvendige spænding-til-millimeter omregningsfaktor. </li><li> Ved afslutningen af ​​forsøget, fastlægge muskel sundhed ved 24 ° C under anvendelse af maksimale isometriske tetaniske kontraktioner (500 msek tog, 120 Hz tog frekvens, 0,5 msek impulsbredde, supramaksimal spænding). Sammenlign peak kontraktile kraft til tidligere rapporterede værdier (~ 24 N / cm 2 9,20). </li></ol>

<ol>
	<li>Matthews, P. B. C., Brookes, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+1,+The+Nervous+System,+Motor+Control.">Section 1, The Nervous System, Motor Control.</a> Handbook of Physiology. , 189-228 (1981).</li><li>Houk, J., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Golgi+tendon+organs+to+forces+applied+to+muscle+tendon.">Responses of Golgi tendon organs to forces applied to muscle tendon.</a> J Neurophysiol. 30, 1466-1481 (1967).</li><li>Jankowski, M. P., Rau, K. K., Ekmann, K. M., Anderson, C. E., Koerber, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotyping+of+group+III+and+IV+muscle+afferents+in+mouse.">Comprehensive phenotyping of group III and IV muscle afferents in mouse.</a> J Neurophysiol. 109, 2374-2381 (2013).</li><li>Nichols, T. R., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-bridge+mechanisms+underlying+the+history-dependent+properties+of+muscle+spindles+and+stretch+reflexes.">Cross-bridge mechanisms underlying the history-dependent properties of muscle spindles and stretch reflexes.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82, 569-576 (2004).</li><li>Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociception+from+skeletal+muscle+in+relation+to+clinical+muscle+pain.">Nociception from skeletal muscle in relation to clinical muscle pain.</a> Pain. 54, 241-289 (1993).</li><li>Proske, U., Gandevia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proprioceptive+Senses:+Their+Roles+in+Signaling+Body+Shape,+Body+Position+and+Movement,+and+Muscle+Force.">The Proprioceptive Senses: Their Roles in Signaling Body Shape, Body Position and Movement, and Muscle Force.</a> Physiol Rev. 92, 1651-1697 (2012).</li><li>Close, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force:+velocity+properties+of+mouse+muscles.">Force: velocity properties of mouse muscles.</a> Nature. 206, 718-719 (1965).</li><li>McCully, K. K., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+to+skeletal+muscle+fibers+of+mice+following+lengthening+contractions.">Injury to skeletal muscle fibers of mice following lengthening contractions.</a> J Appl Physiol. 59, 119-126 (1985).</li><li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young,+adult+and+aged+mice.">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J Physiol. 404, 71-82 (1988).</li><li>Barclay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diffusive+O(2)+supply+to+isolated+preparations+of+mammalian+skeletal+and+cardiac+muscle.">Modelling diffusive O(2) supply to isolated preparations of mammalian skeletal and cardiac muscle.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 26 (2), 225-235 (2005).</li><li>Taguchi, T., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscular+thin-fiber+receptors+in+aged+rats+recorded+in+vitro.">Augmented mechanical response of muscular thin-fiber receptors in aged rats recorded in vitro.</a> European Journal of Pain. 15, 351-358 (2011).</li><li>Simon, A., Shenton, F., Hunter, I., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride-sensitive+channels+are+a+major+contributor+to+mechanotransduction+in+mammalian+muscle+spindles.">Amiloride-sensitive channels are a major contributor to mechanotransduction in mammalian muscle spindles.</a> J Physiol. 588, 171-185 (2010).</li><li>Wenk, H. N., McCleskey, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+skeletal+muscle-nerve+preparation+and+in+vitro+model+of+ischemia.">A novel mouse skeletal muscle-nerve preparation and in vitro model of ischemia.</a> J Neurosci Methods. 159, 244-251 (2007).</li><li>Bullinger, K. L., Nardelli, P., Wang, Q., Rich, M. M., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaliplatin+neurotoxicity+of+sensory+transduction+in+rat+proprioceptors.">Oxaliplatin neurotoxicity of sensory transduction in rat proprioceptors.</a> J Neurophysiol. 106, 704-709 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+muscle+spindle+afferents+in+the+adult+mouse+using+an+in+vitro+muscle-nerve+preparation.">Characterization of muscle spindle afferents in the adult mouse using an in vitro muscle-nerve preparation.</a> PLoS One. 7, e39140 (2012).</li><li>Shreckengost, J., Calvo, J., Quevedo, J., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicuculline-sensitive+primary+afferent+depolarization+remains+after+greatly+restricting+synaptic+transmission+in+the+mammalian+spinal+cord.">Bicuculline-sensitive primary afferent depolarization remains after greatly restricting synaptic transmission in the mammalian spinal cord.</a> J Neurosci. 30, 5283-5288 (2010).</li><li>Koltzenburg, M., Stucky, C. L., Lewin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptive+properties+of+mouse+sensory+neurons+innervating+hairy+skin.">Receptive properties of mouse sensory neurons innervating hairy skin.</a> J Neurophysiol. 78, 1841-1850 (1997).</li><li>Matthews, B. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+muscle.">Nerve endings in mammalian muscle.</a> J Physiol. 78, 1-53 (1933).</li><li>Hunt, C. C., Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+receptor+discharges+during+muscle+contraction.">Stretch receptor discharges during muscle contraction.</a> J Physiol. 113, 298-315 (1951).</li><li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myo-mechanical+analysis+of+isolated+skeletal+muscle.">Myo-mechanical analysis of isolated skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Hoheisel, U., Rein&#246;hl, J., Unger, T., Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+and+capsaicin+activate+mechanosensitive+group+IV+muscle+receptors+in+the+rat.">Acidic pH and capsaicin activate mechanosensitive group IV muscle receptors in the rat.</a> Pain. 110, 149-157 (2004).</li><li>Taguchi, T., Sato, J., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscle+thin-fiber+sensory+receptors+recorded+from+rat+muscle-nerve+preparations+in+vitro+after+eccentric+contraction.">Augmented mechanical response of muscle thin-fiber sensory receptors recorded from rat muscle-nerve preparations in vitro after eccentric contraction.</a> J Neurophysiol. 94, 2822-2831 (2005).</li><li>Xu, J., Gu, H., Brennan, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensitivity+of+group+III+and+group+IV+afferents+from+incised+muscle+in+vitro.">Increased sensitivity of group III and group IV afferents from incised muscle in vitro.</a> Pain. 151, 744-755 (2010).</li></ol>

The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

Målet med denne artikel var at beskrive en metode til optagelse fra muskel spindel afferenter i et isoleret præparat mus muskel-nerve. Vi har fundet, at mus spindel afferente reagere på samme måde at strække som dem fra rotter, katte og mennesker 15 og andre laboratorier har anvendt mus som modelorganismer at studere sensoriske neuroner i både muskel og hud in vitro (for eksempel 3,13) . Muskel sensoriske afferente kan optages i mindst 6-8 timer ved både 24 ° C og 34 ° C. For at minimere håndtering EDL og nerve, bruge den resterende del af FHL at håndtere væv når det er muligt. Efter dissektion, vente mindst 1 time for at starte dataindsamlingen at tillade væv afbalancere til bad temperatur og til normal synaptisk transmission at komme sig. Tidligere blev muskel sundhed kontrolleret på en delmængde af muskler, der bruges i dette præparat ved at fastslå, at den maksimale tetanisk contractile kraft, der genereres af musklerne er den samme som rapporteret af andre ved begyndelsen og slutningen af eksperimentet 15. Muskel spindel afferente blev identificeret funktionelt i dette præparat ved at lede efter en karakteristisk pause i fyring som reaktion på spjæt sammentrækning (figur 2), samt de forventede øjeblikkelige frekvens stigninger i respons på længdeændringer (Figur 3). Det er vores erfaring, de fleste afferenter at brand i kontrolforanstaltninger opfylder muskel spindel afferenter. Længden af nerve bevaret i dette præparat (~ 7 mm maksimum) er ikke lang nok til at bruge afferente ledningshastighed forskelle identificere muskel afferente undertyper 13. Derudover, i modsætning til hos katte og mennesker, foranstaltninger af dynamisk følsomhed ikke var i stand til klart at skelne gruppe IA og II afferenter i mus (for yderligere diskussion se Wilkinson et al. 15). Andre undertyper af afferente (dvs.., Gruppe III og IV) kan identificeres ved hjælp af yderligere funktionelle tests i dette præparat, for eksempel ved at tilsætte stoffer som capsaicin, ATP, eller bradykinin, faldende bad pH, udsætter musklen til iskæmi mv 3,13,21-23 Brug sugeelektroder tillader aktivitet fra flere sensoriske neuroner, der skal optages på én gang, som øger mængden af ​​data, der kan indsamles fra en enkelt muskel. Dette præparat kan anvendes til at måle den samlede effekt af en forstyrrelse på sensoriske neuron befolkningsgrupper responser eller responser identificerede afferenter. Hvis spike figurer er unikke nok, kan op til 4 sensoriske neuroner blive diskrimineret af software (både Spike2 (Cambridge Electronic Design) og LabChart Pro (AD instrumenter) har udført på samme måde). I tilfælde, hvor neuroner kan ikke blive diskrimineret, kan ændringer i placering af elektroder eller spids diameter nemt implementeres. Sammenfattende musemusklen-nerven in vitro preparation er en simpel eksperimentel tilgang, der kan bruges til at undersøge respons egenskaber af muskel sensoriske afferenter til forskellige fysisk-kemiske forstyrrelser, skader og sygdomsmodeller. Derudover er dette præparat velegnet til at drage fordel af de stærke genetiske værktøjer til rådighed i mus, herunder transgene dyr og optogenetic værktøj.

Skeletmuskulatur er innerverede af sensoriske neuroner, der giver det centrale nervesystem med vigtige oplysninger om muskel miljø. Muskel spindler er stærkt specialiserede indkapslede strukturer sammensat af intrafusal muskelfibre, der er placeret parallelt med extrafusal muskelfibre. Spindler er innerverede af gruppe IA og II afferenter der koder ændringer i muskel længde og intrafusal fiber tone dynamisk reguleret af innerverer gamma motoriske neuroner 1. Gruppe Ib afferente er anbragt mellem muskelfibre og deres sener insertioner og er følsom over for ændringer i muskel kraft, for eksempel under muskelsammentrækning 2. Koncernen Ia, Ib og II afferenter giver proprioceptive feedback, der hjælper i passende motorstyring. Yderligere populationer af muskel afferente placeret overalt i musklen (gruppe III og IV) tjener til at signalere metabolit oprustning, tilstedeværelsen af ​​nociceptive stimuli, og muskel temperatur <sup&gt; 3. Denne muskel sensorisk information er nødvendig for at opretholde homeostase og forebygge muskelskader og modulerende bevægelse. Muskel afferenter kan ændre deres fyring mønstre baseret på tidligere erfaringer 4. Aktivering af nociceptorer kan føre til induktion af kroniske smertetilstande 5 og afvigende signalering fra muskel proprioceptorer kan føre til problemer med balancen eller bevægelse 6. Vi bruger en isoleret muskel-nerve in vitro forberedelse til at studere svar af muskel sensorisk neuron receptor endelser fra voksne mus af begge køn (vist er svar 2-4 måneder gammel C57BI / 6 mus). Musen er den model genetiske arter af pattedyr. Dette præparat kræver isoleringen af ​​den dybe peroneal gren af ​​iskiasnerven og extensor digitorum longus (EDL) muskel, et hurtigt ryk muskel i peroneal gruppe findes i den laterale del af underbenet. EDS er ofte bruges til at studere muskel kontraktile egenskaber 7-9, har tendons der er lette at isolere og er lille nok til at tillade tilstrækkelig diffusive iltforsyning i hvile og med rimelige sammentrækning duty cycles 10. Andre muskler i dette område (f.eks soleus og tibialis anterior) er af samme størrelse, og denne forberedelse kan let ændres til at optage fra afferenter fra disse muskler. En suge elektrode placeres på den afskårne ende af nerven til at optage muskel sensorisk afferent fyring. Individuelle neuroner kan identificeres og analyseres på grundlag af deres spids form ved hjælp af spike sortering software. Stimulering elektroder i badet eller på nerven kan anvendes til at fremkalde muskelkontraktion. Muskel længde og kraft kan styres og måles under anvendelse af kommercielt tilgængelige systemer. Lignende in vitro præparater er blevet anvendt i gnavere til at studere Gruppe III og IV muskel afferenter i rotter EDL 11, gruppe IA og II spindel afferenter hos rotter fjerde lumbrical tå muskel 12 og gruppe III og IV muskel afferenter ithan mus plantar muskel 13. Et in vitro-system har fordelene farmakologisk tilgængelighed og direkte styring af Perfusatprøver og fysiokemiske variabler som temperatur og pH. En in vitro-fremgangsmåde eliminerer potentiale in vivo forvirrer af anæstesi og muskel perfusion status. Mens muskel-nerve præparat giver mulighed for undersøgelse af den direkte reaktion på en forstyrrelse på afferente, evnen til at studere gamma efferente modulering af spindel følsomhed og andre integrerede reaktioner, der er muligt med in vivo 14 eller ex vivo tre præparater ofres som der er ingen nervecellelegemer i dette præparat. Dette præparat blev tidligere brugt til at karakterisere respons musemusklen spindel afferenter til et batteri af rampe og hold strækninger og vibrationer, og det blev fastslået, at mus spindel afferente responses svarede til dem rapporteret i andre arter, såsom rotter, katte og mennesker. Mus spindel afferente responser blev fundet at være ens på både 24 ° C og 34 ° C-badet temperaturer, selv ved 34 ° C absolut fyring satser var hurtigere og de ​​afferente var bedre i stand til at reagere hurtigere længde ændringer 15. Vi beskriver nedenfor, hvordan dette præparat kan bruges til at identificere og studere muskel spindel afferenter. Endvidere kan dette præparat let modificeres til at undersøge reaktionen af andre muskel afferente undertyper 13, for at sammenligne egenskaberne af sensoriske afferenter som reaktion på et lægemiddel eller sygdomstilstand eller diverse andre variable (fx alder, køn, gen-knockout).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Force and Length Controller &#38; Tissue Bath</td>
			<td>Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>300C-LR &#38; 809B-IV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &#38; Easy Load II Pump Head</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07523-80 &#38; EW-77200-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &#38; Headstage Amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 1800; 700000 &#38; 700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simulator</td>
			<td>Grass 
			OR 
			Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>S88 
			OR 
			701 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>892070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Fiberlite</td>
			<td>Model 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog to Digital Board</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition &#38; Analysis Software</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>LabChart Pro 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Glass</td>
			<td>Dagan</td>
			<td>SA16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-80/PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflourane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>18627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14014-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF 
			(Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

Muskel sensoriske neuroner innerverer muskel spindler og Golgi sene organer indkode længde og tvinge ændringer er vigtige for proprioception. Yderligere afferente fibre overvåge andre egenskaber musklen miljøet, herunder metabolit opbygning, temperatur og nociceptive stimuli. Samlet set kan unormal aktivering af sensoriske neuroner føre til lidelser i bevægeapparatet eller kroniske smerter syndromer. Vi beskriver isoleringen af extensor digitorum longus (EDL) muskel og nerve til in vitro-undersøgelse af stræk-fremkaldte afferente reaktioner i den voksne mus. Sensorisk aktivitet er optaget fra nerven med en suge elektrode og individuelle afferenter kan analyseres ved hjælp af spyd sortering software. In vitro præparater giver mulighed for velkontrollerede undersøgelser af sensoriske afferenter uden de potentielle forvirrer af bedøvelse eller ændret muskel perfusion. Her beskriver vi en protokol til at identificere og teste responsen af ​​muskel spindel afferente at strække. Vigtigere er det,dette præparat understøtter også undersøgelse af andre undertyper af muskel afferente, respons egenskaber efter narkotika ansøgning og indarbejdelse af kraftige genetiske metoder og sygdomsmodeller i mus.

Reaktion muskel afferente kan optages efter en række forstyrrelser, afhængigt af hvilket afferente undertype bliver undersøgt. Repræsentative reaktioner muskel spindel afferenter til muskel sammentrækning og rampe og hold strækning er vist her. For at identificere en afferent som en spindel afferent, spjæt sammentrækninger er givet én gang hver anden (0,5 msek puls bredde) for at se, om der er en pause i fyring under sammentrækning 18,19. Figur 2 viser et repræsentativt spor af neuronal aktivitet og muskelspændinger i løbet af disse ryk sammentrækninger. Der er ikke observeret neuronal aktivitet under ryk sammentrækninger, som forventet for spindel afferenter. Hvis optaget afferente var en gruppe Ib Golgi senen orgel afferente, en stigning i skudhastighed under sammentrækning ville forventes. Under kontrolbetingelser fleste afferenter med en regulær fyring mønster (~ 12 impulser / sek ved 24 ° C og ~ 32 impulser / sek ved 34 ° C) Er muskel spindel afferente. En undergruppe af spindel afferente vil kun brand under strækning (i vores hænder ~ 11% af spindel afferente) 15 Figur 3A viser et repræsentativt rå spor af to muskel spindel afferenter reagerer på en rampe og hold strækning produceret af kraft og længde controller.. Spike Histogram træk LabChart bruges til at identificere og analysere den øjeblikkelige fyring hyppigheden af de to individuelle neuroner separat (3B-3C). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1. Isoleret Muskel Forberedelse A) extensor digitorum longus (EDS) og innerverer iskiasnerven er monteret i en isoleret vævsbad perfunderet med iltet syntetisk interstitiel væske (SIF). En ekstracellulær forstærker forbundet til en sugepå elektroden registrerer neurale aktivitet. En dobbelt kraft og længde controller-med passende software-kontrol og foranstaltninger muskel kraft og længde. Vævsbadet elektroder levere stimuli til at producere spjæt eller tetaniske veer. Pumpning opvarmet vand gennem interne bad pladekanaler styrer vævsbadet temperatur. B) Trukket glas suge elektrode med ~ 3 mm tilspidset spids. C) Forstørret skildring af den ideelle spids form for sug elektrode, der er fremstillet ved hjælp af en microforge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større udgave af dette tal.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2. Spindel afferente Reaktion på Twitch sammentrækning. Neuronal Aktivitety (øverste spor) og muskelspændinger (nederst spor) fra 30 twitch sammentrækninger overlejres med top overlappende spor i sort. Afferent aktivitet pauser i løbet af sammentrækning induceret spænding stigning, hvilket er en karakteristisk reaktion af muskel spindel afferenter. Beslag og pil over det øverste spor betegne tiden under sammentrækning når aktivitet er sat på pause. <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> Figur 3. Spindel afferente Reaktion på rampen og hold Stræk a) rå neurale aktivitet af to afferenter (top trace) i løbet af en rampe og hold strækning anvendes til EDL (muskel længde vist i nederste spor). B) Momentan fyring frekvens (Inst. Fr., impulser per sekund) af enheden udviser aktivitet ved L o fra A (vist med blåt). C) Instantaneskellige fyring frekvensen af ​​den mindre enhed, at kun brande i løbet af strækningen (vist i orange). Begge enheder udviser tilpasning spike frekvens under strækning, der er karakteristisk for muskel spindel afferenter 1.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Voksen Mouse Muskel-nerve Forberedelse til at studere affyringen Egenskaber af Muscle afferenter

Muskel sensoriske neuroner er involveret i proprioceptor signalering og også rapportere om metaboliske tilstand og skade relaterede begivenheder. Vi beskriver en voksen mus in vitro forberedelse muskel-nerve til undersøgelser af stræk-aktiverede muskel afferenter.

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

En<em&gt; In vitro</em&gt; Udarbejdelse af Isolerede Enteriske neuroner og glia fra plexus myentericus af Voksen Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende plasticitet astrocytisk receptorer ved manipulation af neuronfyring priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Udarbejdelse af Primære Mixed Glia kulturer fra Voksen Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En simpel en-trin Dissektion Protokol for Whole-mount Forberedelse af Voksen<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Udarbejdelse af horisontale Skiver af Voksen Mouse Retina for Elektrofysiologiske Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

In Vitro Karakterisering af de elektrofysiologiske egenskaber af Colon afferente fibre i rotter

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

Musen baghjernen som en Model til at studere embryonale neurogenese

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Analysen til at studere en sammenlægning af Tau Protein og stof Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Forberedelse af rytmisk-aktiv i Vitro Neonatal gnaver hjernestammen-rygmarven og tynd skive

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...