Name: an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents
Uploaded: 2014-09-24T13:00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

Passende nationale en institutionele ethiek moet worden verkregen voordat dierproeven. 1 Verwijdering van EDL Spier en Nerve <ol><li> Weeg en diep verdoven een volwassen muis met geïnhaleerde isofluorane met een verdamper met 5% isofluorane plus een 1,5 L / min zuurstof stroomsnelheid of een stolp met isofluorane gedrenkt katoen aan de onderzijde. </li><li> Zorg ervoor dat de muis is diep verdoofd en niet reageert op een teen knijpen. Snel onthoofden met behulp van grote, geslepen schaar of een guillotine. </li><li> Maak een ventrale middellijn snede door de ribben met een schaar en verwijder de interne organen. </li><li> Huid van het dier door het grijpen van de huid van de nek en het verleden van de voeten te trekken. </li><li> Verwijder de benen door het snijden boven de heupen en plaats de huid benen in een schaal met gekoelde (4 ° C), carbogenated (95% O2, 5% CO2) laag calcium, hoog magnesium bicarbonaat gebufferde zoutoplossing containing in mM: 128 NaCl, 1,9 KCl, 1,2 KH 2PO 4, 26 NaHCO3, 0.85 CaCl2, 6,5 MgSO4 en 10 glucose (pH 7,4 ± 0,05) 16. De lage calcium, magnesium hoge oplossing remt synaptische transmissie tijdens de dissectie. </li><li> Leg de benen dorsale zijde naar boven in de schaal en speld de benen en heupen naar beneden met behulp van naalden of insect pinnen, zodat de knie-en enkelgewrichten zijn in een hoek van 90 °. Plaats een pin op elk uiteinde van de voeten en een pin op elk van de voorste en achterste dijen om het weefsel op zijn plaats te houden. </li><li> Met Castroviejo spring schaar, til de bovenste spierlaag op de dijen en een middellijn gesneden om de heupzenuw direct onder blootstellen. De heupzenuw ligt net onder de bovenste spierlaag en loopt boven de femur van de uitgang bij de heupen tot het vertakt in de gemeenschappelijke peroneale en tibialis net voor het kniegewricht. </li><li> Verwijder de spier boven de heupzenuw totdat de point waarop de diepe peroneus tak duikt in de flexor hallucis longus (FHL) spier zichtbaar is. </li><li> Gebruik # 55 tang, ontleden het bindweefsel rond de peroneale branch te bevrijden van de gastrocnemius en soleus spieren, die op de mediale zijde van de tibia. Snijd de pezen van de gastrocnemius en soleus spieren los en verwijder voorzichtig van onder de zenuw. </li><li> Verwijder de oppervlakkige spier aan de laterale zijde van de tibia drie verschillende pees bundels ondergaan bij het enkelgewricht-van mediaal naar lateraal: FHL, EDL en tibialis anterior (TA), met de EDL verborgen onder de TA. </li><li> Snijd de TA pees aan het enkelgewricht, tilt u de TA omhoog en weg van de EDL, en snijd de spier in de buurt van de knie om het te verwijderen. </li><li> Snijd de FHL pees aan de enkel en til het terug naar het gebied waar de zenuw komt in de FHL bereiken. Juist onder dat punt en verwijder ~ 2/3 van het FHL spier. </li><li> Snijd de heupzenuw zo dicht mogelijk bij het heupgewricht als poswoordelijk en voorzichtig ontdoen van alle zenuw takken behalve de diepe peroneale tak. </li><li> Snijd de EDL pezen op zowel de enkel-en kniegewrichten met grote veer schaar. </li><li> Met behulp van een scherpe schaar, verwijder de EDL, de resterende FHL en zenuwen van het omringende weefsel door te snijden door de tibia bot bij de knie en halverwege de dij. Knip de resterende tibia bot zodat enkel de EDL, een deel van de FHL en zenuw blijven. </li></ol> 2 Montage van de EDL spier en zenuw in de Tissue bad (figuur 1A) <ol><li> Voor de start van het experiment bereiden weefselbad. Voortdurend perfuseren het bad met zuurstof (100% O2) synthetische interstitiële vloeistof (SIF) bevattende (in mM) 123 NaCl, 3,5 KCl, 0,7 MgSO4, 1,7 NaH 2PO 4, 2,0 CaCl2, 9,5 NaCl 6 H 11 O ( natriumgluconaat), 5.5 glucose, sucrose 7,5, en 10 N -2-hydroxyethylpiperazine- N &#39;-2-ethanesulfonic zuur (HEPES); pH 7.4 ± 0.05 17. Een stroomsnelheid van 15-30 ml / min wordt aanbevolen. Getoond wordt een commercieel verkrijgbaar bad van 25 ml met twee stimuleren de bodem van het bad, een gemonteerde tissue post en een steun voor een kracht en lengte controller (approximate bad vaste afmetingen elektroden 8,5 cm x 3 cm x 1 cm, voor specificaties zie tabel van Materialen / Equipment). </li><li> Gebruik de resterende FHL weefsel om de geïsoleerde spier-zenuw moet plaatsen en het in het weefsel bad. Plaats een klein stukje van Sylgard op de bodem van de schaal en gebruik een insect pin door de resterende FHL weefsel om de spier te stabiliseren. </li><li> Gebruik 6-0 zijde hechtingen aan beide pezen te binden en aan te brengen een einde te maken aan het weefsel post en de andere aan de arm van de kracht en de lengte-controller (zie tabel van Materialen / Apparatuur voor specificaties). Gebruik de kleinste hechtdraad lengte die praktisch. Verwijder het insect pin en Sylgard nadat u de pezen hebben vastgebonden. OPMERKING: Om te zorgen voor een eenvoudigeverbinding met de hefboomarm een ​​klein stuk draad kan worden gebogen in een &quot;j&quot; vormige haak en bevestigd in de hefboomarm met epoxy. De hechting kan dan op de draad worden gekoppeld in plaats van schroefdraad in het gaatje van de hefboomarm. </li><li> Maak zuigkracht elektroden van SA 16 glas door eerst met behulp van een glazen micropipet trekker (Warmte = 286, Pull = 0, Velocity = 150, Tijd = 200); breek het topje heen en handmatig slijpen het op een slijpsteen tot er ongeveer een 3 mm conus. Smelt de spuitkop en een microforge om het gewenste punt binnendiameter van tussen de 10-100 micrometer afhankelijk van het gebied van de zenuw die men wenst te proeven van (zie figuren 1B-1C voor elektrode-schema en de tabel van Materialen / Apparatuur voor productinformatie). </li><li> Vul een premade glas zuig-elektrode om de innerlijke zilverdraad met SIF. </li><li> Zuig het afgesneden uiteinde van de zenuw in de elektrode en op de positief haven van een verschilversterker. Wikkel de elektrode met een gechloreerde zilverdraad die wordt aangesloten op de negatieve aansluiting van de headstage. Aard de SIF bad door het uitvoeren van een tweede gechloreerde zilveren draad van het bad aan de grond-poort van de headstage&#39;s. Ook de grond van de perfusie slang aan op de kooi van Faraday op meerdere punten aan elektrische ruis geïntroduceerd via de perfusie pompen te beperken. </li><li> Stimuleren spier via de elektroden aangebracht aan weerszijden van de spier in het weefselbad een twitch contractie te induceren. Anderzijds plaatst een stimulerende elektrode op het afgesneden uiteinde van de zenuw. Verhoog de stimulerende spanning tot een piek contractiekracht wordt waargenomen en verhoog de spanning met nog eens 15% tot supramaximale spanning (0,5 msec pulsbreedte) bereikt. Verdere twitch contracties bij supramaximale spanning met een 10 seconden rust tussenin, maar varieert de lengte van de spier tot een piek samentrekkingskracht wordt bereikt om de optimale lengte (Lo) van de spier vinden. Alle lengte ramps en trillingen zal beginnen met de spieren in deze lengTh. </li><li> Laat de spier-zenuw bereiding in het bad gedurende ten minste 1 uur voor verder gegevensverzameling om het weefsel de badtemperatuur te bereiken en voor normale synaptische transmissie te herstellen na dissectie in een lage calcium oplossing. </li><li> Om gegevens te verzamelen op een andere dan de kamertemperatuur temperatuur, plaats een temperatuursensor in het weefsel bad in de buurt van de spier. Langzaam breng het bad op temperatuur door het pompen verwarmde water via weefselbad basisplaat. Wikkel klei microwavable verwarming pads rond de SIF reservoir voor het behoud van een stabiele temperatuur. </li></ol> 3 Data Collection <ol><li> Om een ​​afferente identificeren als een spindel afferente, noteer de neuronale activiteit tijdens herhaalde twitch contracties geproduceerd door een 0,5 msec supramaximale spanning stimulans geleverd eenmaal per seconde. OPMERKING: Muscle spindle afferentia moet pauzeren tijdens de twitch samentrekking 18,19 (figuur 2). </li><li> Gebruik data-acquisitie software op lengte wijzigingen toe te passen op verschillende snelheden en in verschillende lengtes. Gebruik een aangepast script om deze taak te automatiseren (zie aanvullende informatie voor een screenshot van het script en aanwijzingen over hoe de stukken gegeven aanpassen). Breng ramp-and-hold stukken 4 sec bij stuk lengte van 2,5%, 5% en 7,5% L o en rek snelheid van 20, 40 of 60% L o / sec 15. OPMERKING: Zie de handleiding voor specifieke kracht en lengte controller voor nodig voltage-to-millimeter omrekeningsfactor. </li><li> Na afloop van het experiment bepalen spieren gezondheid bij 24 ° C met maximale isometrische tetanische contracties (500 msec train, 120 Hz frequentie van treinen, 0,5 msec pulsbreedte, supramaximale spanning). Vergelijk de piek contractiekracht met eerder gerapporteerde waarden (~ 24 N / cm 2 9,20). </li></ol>

<ol>
	<li>Matthews, P. B. C., Brookes, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+1,+The+Nervous+System,+Motor+Control.">Section 1, The Nervous System, Motor Control.</a> Handbook of Physiology. , 189-228 (1981).</li><li>Houk, J., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Golgi+tendon+organs+to+forces+applied+to+muscle+tendon.">Responses of Golgi tendon organs to forces applied to muscle tendon.</a> J Neurophysiol. 30, 1466-1481 (1967).</li><li>Jankowski, M. P., Rau, K. K., Ekmann, K. M., Anderson, C. E., Koerber, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotyping+of+group+III+and+IV+muscle+afferents+in+mouse.">Comprehensive phenotyping of group III and IV muscle afferents in mouse.</a> J Neurophysiol. 109, 2374-2381 (2013).</li><li>Nichols, T. R., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-bridge+mechanisms+underlying+the+history-dependent+properties+of+muscle+spindles+and+stretch+reflexes.">Cross-bridge mechanisms underlying the history-dependent properties of muscle spindles and stretch reflexes.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82, 569-576 (2004).</li><li>Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociception+from+skeletal+muscle+in+relation+to+clinical+muscle+pain.">Nociception from skeletal muscle in relation to clinical muscle pain.</a> Pain. 54, 241-289 (1993).</li><li>Proske, U., Gandevia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proprioceptive+Senses:+Their+Roles+in+Signaling+Body+Shape,+Body+Position+and+Movement,+and+Muscle+Force.">The Proprioceptive Senses: Their Roles in Signaling Body Shape, Body Position and Movement, and Muscle Force.</a> Physiol Rev. 92, 1651-1697 (2012).</li><li>Close, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force:+velocity+properties+of+mouse+muscles.">Force: velocity properties of mouse muscles.</a> Nature. 206, 718-719 (1965).</li><li>McCully, K. K., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+to+skeletal+muscle+fibers+of+mice+following+lengthening+contractions.">Injury to skeletal muscle fibers of mice following lengthening contractions.</a> J Appl Physiol. 59, 119-126 (1985).</li><li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young,+adult+and+aged+mice.">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J Physiol. 404, 71-82 (1988).</li><li>Barclay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diffusive+O(2)+supply+to+isolated+preparations+of+mammalian+skeletal+and+cardiac+muscle.">Modelling diffusive O(2) supply to isolated preparations of mammalian skeletal and cardiac muscle.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 26 (2), 225-235 (2005).</li><li>Taguchi, T., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscular+thin-fiber+receptors+in+aged+rats+recorded+in+vitro.">Augmented mechanical response of muscular thin-fiber receptors in aged rats recorded in vitro.</a> European Journal of Pain. 15, 351-358 (2011).</li><li>Simon, A., Shenton, F., Hunter, I., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride-sensitive+channels+are+a+major+contributor+to+mechanotransduction+in+mammalian+muscle+spindles.">Amiloride-sensitive channels are a major contributor to mechanotransduction in mammalian muscle spindles.</a> J Physiol. 588, 171-185 (2010).</li><li>Wenk, H. N., McCleskey, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+skeletal+muscle-nerve+preparation+and+in+vitro+model+of+ischemia.">A novel mouse skeletal muscle-nerve preparation and in vitro model of ischemia.</a> J Neurosci Methods. 159, 244-251 (2007).</li><li>Bullinger, K. L., Nardelli, P., Wang, Q., Rich, M. M., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaliplatin+neurotoxicity+of+sensory+transduction+in+rat+proprioceptors.">Oxaliplatin neurotoxicity of sensory transduction in rat proprioceptors.</a> J Neurophysiol. 106, 704-709 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+muscle+spindle+afferents+in+the+adult+mouse+using+an+in+vitro+muscle-nerve+preparation.">Characterization of muscle spindle afferents in the adult mouse using an in vitro muscle-nerve preparation.</a> PLoS One. 7, e39140 (2012).</li><li>Shreckengost, J., Calvo, J., Quevedo, J., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicuculline-sensitive+primary+afferent+depolarization+remains+after+greatly+restricting+synaptic+transmission+in+the+mammalian+spinal+cord.">Bicuculline-sensitive primary afferent depolarization remains after greatly restricting synaptic transmission in the mammalian spinal cord.</a> J Neurosci. 30, 5283-5288 (2010).</li><li>Koltzenburg, M., Stucky, C. L., Lewin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptive+properties+of+mouse+sensory+neurons+innervating+hairy+skin.">Receptive properties of mouse sensory neurons innervating hairy skin.</a> J Neurophysiol. 78, 1841-1850 (1997).</li><li>Matthews, B. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+muscle.">Nerve endings in mammalian muscle.</a> J Physiol. 78, 1-53 (1933).</li><li>Hunt, C. C., Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+receptor+discharges+during+muscle+contraction.">Stretch receptor discharges during muscle contraction.</a> J Physiol. 113, 298-315 (1951).</li><li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myo-mechanical+analysis+of+isolated+skeletal+muscle.">Myo-mechanical analysis of isolated skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Hoheisel, U., Rein&#246;hl, J., Unger, T., Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+and+capsaicin+activate+mechanosensitive+group+IV+muscle+receptors+in+the+rat.">Acidic pH and capsaicin activate mechanosensitive group IV muscle receptors in the rat.</a> Pain. 110, 149-157 (2004).</li><li>Taguchi, T., Sato, J., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscle+thin-fiber+sensory+receptors+recorded+from+rat+muscle-nerve+preparations+in+vitro+after+eccentric+contraction.">Augmented mechanical response of muscle thin-fiber sensory receptors recorded from rat muscle-nerve preparations in vitro after eccentric contraction.</a> J Neurophysiol. 94, 2822-2831 (2005).</li><li>Xu, J., Gu, H., Brennan, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensitivity+of+group+III+and+group+IV+afferents+from+incised+muscle+in+vitro.">Increased sensitivity of group III and group IV afferents from incised muscle in vitro.</a> Pain. 151, 744-755 (2010).</li></ol>

The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

Het doel van dit artikel was om een ​​methode te beschrijven voor het opnemen van de spier spindel afferentia in een geïsoleerde muis spier-zenuw voorbereiding. Wij hebben gevonden dat muis spindel afferente reageren gelijk te strekken als die van ratten, katten en mensen 15 en andere laboratoria muizen gebruikt als model organismen sensorische neuronen in zowel de spieren en de huid in vitro onderzoeken (bijvoorbeeld 3,13) . Muscle sensorische afferenten kan worden opgenomen voor ten minste 6-8 uur bij zowel 24 ° C en 34 ° C. Om behandeling van de EDL en zenuw minimaliseren, gebruikt het resterende deel van de FHL om het weefsel te behandelen waar mogelijk. Naar aanleiding van de dissectie, wacht minstens 1 uur om het verzamelen van gegevens te starten, zodat het weefsel in evenwicht te badtemperatuur en voor de normale synaptische transmissie te herstellen. Voorheen werd spieren gezondheid gecontroleerd op een subset van spieren in dit preparaat door te bepalen dat de maximale tetanische contractile kracht die door de spieren vergelijkbaar met die gerapporteerd door anderen aan het begin en einde van het experiment 15. Spierspoel afferenten werden geïdentificeerd functioneel in dit preparaat door te zoeken naar een karakteristieke pauze vuren in reactie op contractie trillen (figuur 2) en de te verwachten instantane frequentie toe bij lengteveranderingen (figuur 3). In onze ervaring, de meeste afferentia dat het vuur onder controle omstandigheden zijn spier spindel afferenten. De lengte van de zenuw vastgehouden in dit preparaat (~ mm maximaal 7) is niet lang genoeg om afferente geleidingssnelheid verschillen om spier afferente subtypes 13 identificeren. Bovendien, in tegenstelling tot katten en mensen, maatregelen dynamische gevoeligheid niet duidelijk kunnen onderscheiden groep Ia en II afferenten in muizen (voor verdere bespreking zie Wilkinson et al. 15). Andere subtypen van afferenten (dwz., Groep III en IV) kunnen worden geïdentificeerd door extra functionele tests in dit preparaat, bijvoorbeeld door toevoeging van stoffen als capsaicin, ATP of bradykinine, bad afnemende pH, waardoor de spier ischemie, etc. 3,13,21-23 Met zuigkracht elektroden kan de activiteit van verschillende sensorische neuronen tegelijk op te nemen, waarbij de hoeveelheid data die kan worden vanuit een enkele spier verhoogt. Dit preparaat kan worden gebruikt om het algehele effect van een verstoring op responsen sensorische neuron bevolking of de reacties van geïdentificeerde afferenten meten. Als de piek vormen zijn uniek genoeg tot 4 sensorische neuronen kunnen worden onderscheiden door software (zowel Spike2 (Cambridge Electronic Design) en LabChart Pro (AD Instruments) zijn eveneens uitgevoerd). In gevallen waarin de neuronen niet kan worden onderscheiden, kunnen veranderingen in de plaatsing van de elektroden of tip diameter eenvoudig worden geïmplementeerd. Samengevat, de muis spier-zenuw in vitro preparatie is een eenvoudige experimentele benadering die kan worden gebruikt om de responseigenschappen van spier sensorische afferenten verschillende fysisch verstoringen, schade en ziektemodellen onderzoeken. Tevens wordt dit preparaat ideaal om te profiteren van de krachtige genetische gereedschap in muizen, zoals transgene dieren en optogenetic gereedschappen.

Skeletspieren worden geïnnerveerd door sensorische neuronen die het centrale zenuwstelsel te voorzien van belangrijke informatie over de spier milieu. Muscle spindels zijn gespecialiseerd ingekapselde structuren samengesteld intrafusal spiervezels die zich parallel aan extrafusal spiervezels. Spindels worden geïnnerveerd door de groep Ia en II afferenten die coderen veranderingen in spierlengte en intrafusal fiber toon wordt dynamisch geregeld door innerveren gamma motorneuronen 1. Groep Ib afferente vezels liggen tussen spiervezels en hun peesaanhechtingen en gevoelig zijn voor veranderingen in spierkracht, bijvoorbeeld tijdens spiercontractie 2. De groep Ia, Ib en II afferenten bieden proprioceptieve feedback die helpt bij de juiste motor control. Aanvullende populaties spier afferentia verspreid de spier (groep III en IV) dienen om metaboliet opbouw, de aanwezigheid van nociceptieve stimuli en spiertemperatuur signaal <sup&gt; 3. Deze spier sensorische informatie is essentieel voor homeostase, voorkomen spierschade en modulerende beweging. Muscle afferentia kunnen hun afvuren patronen te veranderen op basis van eerdere ervaring 4. Activatie van nociceptoren kan leiden tot de inductie van chronische pijnen 5 en afwijkende signalering van de spier proprioceptoren kan leiden tot problemen met het evenwicht of beweging 6. We gebruiken een geïsoleerde spier-zenuw in vitro bereiding van antwoord van spier sensorische neuron receptor uiteinden van volwassen muizen van beide geslachten bestuderen (voorbeeld reacties 2-4 maanden oude C57BL / 6 muizen). De muis is het model genetische soorten studies bij zoogdieren. Deze voorbereiding moet de isolatie van de diepe peronealis tak van de ischiadicus en extensor digitorum longus (EDL) spier, een snel samentrekkende spier van de peroneale groep in de zijkant van het onderbeen. De EDL wordt vaak gebruikt om spieren contractiele eigenschappen 7-9 te bestuderen, heeft tendons die gemakkelijk te isoleren en klein genoeg is om voldoende diffusie zuurstof in rust en met voldoende krimp bedrijfscycli 10 mogelijk. Andere spieren in dit gebied (bijvoorbeeld soleus en tibialis anterior) van gelijke grootte zijn en deze bereiding kan gemakkelijk worden aangepast voor het opnemen van afferente van deze spieren. Een zuig-elektrode geplaatst op het afgesneden uiteinde van de zenuw spier sensorische afferente afvuren opnemen. Individuele neuronen kunnen worden geïdentificeerd en geanalyseerd op basis van hun spike vorm middels spike sorteren software. Prikkelelektroden in bad of op de zenuw kan worden om spiercontractie te roepen. Spierlengte en werking kunnen worden gecontroleerd en gemeten met commercieel beschikbare systemen. Vergelijkbaar in zijn vitro voorbereidingen zijn gebruikt bij knaagdieren groep III en IV spier afferentia studeren in de rat EDL 11, groep Ia en II spindel afferentia in de rat vierde lumbricale teen spier 12 en groep III en IV spier afferenten in thij muis plantaire spieren 13. Een in vitro systeem heeft de voordelen van farmacologische toegankelijkheid en directe controle perfusievloeistof en fysiochemische variabelen zoals temperatuur en pH. Een in vitro benadering elimineert het potentieel in vivo verwart van anesthesie en spier-perfusie-status. Terwijl de spier-zenuw voorbereiding maakt de studie van de directe reactie van een verstoring op de afferenten, de mogelijkheid gamma efferente modulatie van as gevoeligheid en andere geïntegreerde respons studie die kan met in vivo of ex vivo 14 3 preparaten wordt opgeofferd als er zijn geen neuronale cellichamen in dit preparaat. Dit preparaat is eerder gebruikt om de respons van de muis spierspoel afferente een batterij helling karakteriseren ingedrukt rekt en trillingen en werd vastgesteld dat muis spindel afferente responses waren vergelijkbaar met die in andere soorten zoals ratten, katten en mensen. Muis spindel afferente reacties gevonden die lijken op zowel 24 ° C en 34 ° C bad temperaturen te zijn, hoewel bij 34 ° C absolute afvuren tarieven sneller waren en de afferentia waren beter in staat om te reageren op een snellere lengte verandert 15. Wij beschrijven hieronder hoe dit preparaat kan worden gebruikt om de spierspoel afferente identificeren en bestuderen. Bovendien kan dit preparaat eenvoudig worden aangepast om de reactie van andere spieren afferente subtypen 13 bestuderen van de eigenschappen van sensorische afferenten vergelijken in reactie op een geneesmiddel of ziektetoestand of diverse andere variabelen (bijvoorbeeld leeftijd, geslacht, knockout).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Force and Length Controller &#38; Tissue Bath</td>
			<td>Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>300C-LR &#38; 809B-IV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &#38; Easy Load II Pump Head</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07523-80 &#38; EW-77200-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &#38; Headstage Amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 1800; 700000 &#38; 700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simulator</td>
			<td>Grass 
			OR 
			Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>S88 
			OR 
			701 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>892070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Fiberlite</td>
			<td>Model 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog to Digital Board</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition &#38; Analysis Software</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>LabChart Pro 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Glass</td>
			<td>Dagan</td>
			<td>SA16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-80/PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflourane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>18627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14014-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF 
			(Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

Muscle sensorische neuronen innerveren spierspoeltjes en Golgi pees organen coderen lengte en kracht veranderingen essentieel voor proprioceptie. Aanvullende afferente vezels controleren andere kenmerken van de spier milieu, waaronder metaboliet opbouw, temperatuur en nociceptieve stimuli. Al met al kan abnormale activatie van sensorische neuronen leiden tot bewegingsstoornissen of chronische pijn syndromen. Wij beschrijven de isolatie van de extensor digitorum longus (EDL) spier en zenuw in vitro studie van afferente stretch opgewekte responsen in de volwassen muis. Activiteit van de zintuigen wordt opgenomen met de zenuw met een zuig-elektrode en individuele afferentia kunnen worden geanalyseerd met behulp van spike sorteren software. In vitro voorbereidingen zorgen voor goed gecontroleerde studies over sensorische afferenten zonder de potentiële verwart van anesthesie of veranderde spier perfusie. Hier beschrijven we een protocol voor het identificeren en testen van de reactie van de spier spindel afferentia te rekken. Belangrijkdeze voorbereiding ondersteunt ook de studie van andere subtypen van spier afferenten, respons eigenschappen overeenkomstig drug toepassing en de integratie van krachtige genetische benaderingen en ziekte modellen in muizen.

De reactie van spier afferenten kan worden opgenomen om een ​​verscheidenheid van storingen, afhankelijk van de afferente subtype wordt bestudeerd. Representatieve respons van de spier spindel afferentia om spiercontractie en oprit en houd stretch worden hier getoond. Een afferente identificeren als een spindel afferente, kramp samentrekkingen worden viermaal per seconde (0,5 msec pulsbreedte) gegeven of er een pauze in ovens tijdens contractie 18,19. Figuur 2 toont een representatief spoor van neuronale activiteit en spierspanning tijdens deze twitch contracties. Geen neuronale activiteit wordt waargenomen tijdens de twitch weeën, zoals verwacht voor spindel afferenten. Indien de vastgestelde afferente een groep Ib Golgi pees orgaan afferente een toename vuren tijdens de contractie zou verwachten. Onder controlecondities meest afferente met een regelmatige reeks flitsen (~ 12 impulsen / s bij 24 ° C en ~ 32 impulsen / s bij 34 ° C) Zijn spier spindel afferenten. Een subset van spindel afferentia zal alleen brand tijdens stretch (in onze handen ~ 11% van de spil afferentia) 15. Figuur 3A toont een representatief ruwe spoor van twee spier spindel afferentia reageren op een ramp en houd stretch geproduceerd door de kracht en de lengte controller. De Spike Histogramfunctie van LabChart wordt geïdentificeerd en de momentane spuitfrequentie de twee individuele neuronen afzonderlijk (Figuren 3B-3C) geanalyseerd. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1 Geïsoleerde Muscle Voorbereiding A) De extensor digitorum longus (EDL) en innerveren heupzenuw zijn gemonteerd in een geïsoleerde weefsel bad doorbloed met zuurstofrijk synthetische interstitiële vloeistof (SIF). Een extracellulair versterker verbonden met een zuigelektrode registreert neurale activiteit. Een dubbele kracht en lengte controller-met de juiste software-controles en maatregelen spierkracht en lengte. Het weefsel bad elektroden leveren stimuli om te produceren twitch of tetanische contracties. Verpompen verwarmd water door middel van interne bad plaatkanalen controleert het weefsel badtemperatuur. B) Getrokken glas zuig-elektrode met ~ 3 mm taps toelopende tip. C) Vergrote weergave van de ideale tip vorm voor de zuig-elektrode die wordt geproduceerd met behulp van een microforge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> Figuur 2 Spindel Afferent Reactie op Twitch contractie. Neuronal activity (bovenste spoor) en spierspanning (bodemtracé) vanaf 30 twitch contracties worden gelegd met top overlappende sporen in het zwart. Afferente activiteit pauzeert tijdens krimp veroorzaakte spanning te verhogen, wat een karakteristieke reactie van de spier spindel afferenten. Beugel en pijl boven de bovenste trace duiden de tijd tijdens het samentrekken wanneer de activiteit wordt gepauzeerd. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> Figuur 3 Spindel Afferent Reactie op Ramp en Hold Stretch A) Raw neurale activiteit van twee afferentia (bovenste spoor) tijdens een hellingbaan en houd stretch toegepast op de EDL (spierlengte getoond in bodemspoor). B) Onmiddellijke spuitfrequentie (Inst. Pater, impulsen per seconde) van de eenheid die activiteit vertonen bij L o van A (in blauw weergegeven). C) Instantanélende spuitfrequentie van de kleinere eenheid die alleen branden tijdens het traject (in oranje). Beide eenheden vertonen piekfrequentie aanpassing tijdens rek die kenmerkend spierspoel afferenten 1.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Adult Mouse spier-zenuw Voorbereiding voor het bestuderen van de Firing Eigenschappen van Muscle afferenten

Muscle sensorische neuronen betrokken zijn bij proprioceptor signaleren en rapporteren over metabole toestand en verwondingen gerelateerde gebeurtenissen. We beschrijven een volwassen muis in vitro spier-zenuw voorbereiding op studies over-stretch geactiveerde spieren afferenten.

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Het bestuderen van de integratie van Adult geboren Neuronen

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Een<em&gt; In-vitro</em&gt; Voorbereiding van Geïsoleerde enterische neuronen en Glia uit de myenterische Plexus van de Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende Plasticiteit van astrocyten receptoren door Manipulatie van neuronale tarieven

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Een eenvoudige één stap Dissection protocol voor Whole-mount voorbereiding van Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Voorbereiding van de Horizontale Schijfjes van Adult Mouse Retina voor elektrofysiologisch onderzoek

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

In Vitro Karakterisering van de elektrofysiologische eigenschappen van Colon Afferent vezels in ratten

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

De muis Hindbrain als een Model voor het bestuderen van embryonale neurogenese

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Assay voor het bestuderen van de aggregatie van eiwitten Tau en Drug Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Voorbereiding van ritmisch-actief In Vitro neonatale knaagdier hersenstam-ruggenmerg en dun plakje

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...