Name: an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents
Uploaded: 2014-09-24T13:00:00
Duration: 10 min 36 s
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This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

Entsprechenden nationalen und institutionellen Ethik sollte vor der Durchführung von Tierversuchen gewonnen werden. 1. Entfernung von EDL Muskel und Nerv <ol><li> Wiegen und tief betäuben einen erwachsenen Maus mit inhalativen Isofluoran mit einem Verdampfer mit 5% Isofluran sowie ein 1,5 l / min Sauerstoffflussrate oder eine Glasglocke mit Isofluoran getränkten Watte auf der Unterseite. </li><li> Sicherzustellen, dass die Maus tief anästhesiert, und nicht zu einem Zehenklemm reagieren. Enthaupten schnell mit großen, geschärft einer Schere oder einem Guillotine. </li><li> Machen Sie eine ventralen Mittellinie Schnitt durch die Rippen mit einer Schere entfernen und die inneren Organe. </li><li> Die Haut des Tieres durch Greifen die Haut vom Halsbereich und ziehen vorbei an den Füßen. </li><li> Entfernen Sie die Beine, indem über den Hüften und legen Sie die Beine Haut in eine Schüssel mit kaltem (4 ° C), carbogenated (95% O 2, 5% CO 2) geringe Kalzium Hoch Magnesiumbicarbonat Kochsalzlösung contaiNing in mM: 128 NaCl, 1,9 KCl, 1,2 KH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 0,85 CaCl 2, 6.5 MgSO 4, und 10 Glucose (pH 7,4 ± 0,05) 16. Der niedrige Kalzium Hochmagnesiumlösung hemmt die synaptische Übertragung während der Präparation. </li><li> Legen Sie die Beine dorsale Seite nach oben in die Schüssel und stecken Sie die Beine und Hüften nach unten mit Nadeln oder Insekten Pins, so dass die Knie-und Knöchelgelenke im 90 ° Winkel sind. Legen Sie einen Stift an jedem Ende der Füße und auf jeder der vorderen und hinteren Oberschenkel einen Stift, um das Gewebe an Ort und Stelle zu halten. </li><li> Castroviejo mit Federschere, heben Sie die obere Schicht der Muskel an den Oberschenkeln und eine Mittellinie geschnitten, um den Ischiasnerv direkt unter aussetzen. Der Ischiasnerv ist knapp unter dem oberen Muskelschicht gelegen und verläuft oberhalb des Oberschenkelknochens aus seiner Ausfahrt in der Nähe von den Hüften bis es Niederlassungen in den gemeinsamen Wadenbein und Schienbeinnerv kurz vor dem Kniegelenk. </li><li> Entfernen Sie den Muskel über dem Ischiasnerv, bis die point, bei dem die tiefen Wadenbeinnerv Zweig taucht in das flexor hallucis longus (FHL) Muskel ist sichtbar. </li><li> Mit # 55 Pinzetten, sezieren das Bindegewebe rund um den Wadenbein Zweig, um ihn von den gastrocnemius und soleus Muskeln, die an der medialen Seite der Tibia sind kostenlos. Schneiden Sie die Sehnen der gastrocnemius und soleus Muskeln und sorgfältig entfernen Sie sie aus unter dem Nerv. </li><li> Entfernen Sie die oberflächliche Muskel auf der lateralen Seite des Schienbeins zu drei verschiedene Sehnenbündel am Sprunggelenk-von medial nach lateral aussetzen: FHL, EDS und tibialis anterior (TA), wobei der EDS unterhalb der TA verborgen. </li><li> Schneiden Sie die TA Sehne am Sprunggelenk, heben Sie die TA oben und weg von der EDL, und schneiden Sie den Muskel in der Nähe der Knie, um sie zu entfernen. </li><li> Schneiden Sie den FHL-Sehne am Knöchel und heben Sie sie zurück, um den Bereich, wo der Nerv in den FHL erreichen. Schneiden Sie direkt unter diesem Punkt und entfernen ~ 2/3 der FHL Muskel. </li><li> Schneiden Sie den Ischiasnerv so nahe dem Hüftgelenk als poslich und schonend entfernen alles Nervenäste mit Ausnahme der tiefen Wadenbein Zweig. </li><li> Schneiden Sie die EDL Sehnen an beiden Knöchel-und Kniegelenke mit großen Feder Schere. </li><li> Mit einer scharfen Schere, entfernen Sie die EDL, die verbleibende FHL und Nerven aus dem umgebenden Gewebe durch einen Schnitt durch die Tibia Knochen im Knie und in der Mitte des Oberschenkels. Schneiden Sie die verbleibende Tibiaknochen, so dass nur die EDL, ein Teil der FHL und Nerven bleiben. </li></ol> 2. Montage der EDL Muskel und Nerv in das Gewebe Bath (Abbildung 1A) <ol><li> Vor Beginn des Experiments vorbereitet Gewebebad. Ständig durchströmen das Bad mit Sauerstoff angereichertem (100% O 2) synthetische interstitiellen Flüssigkeit (SIF), die (in mM) 123 NaCl, 3,5 KCl, 0,7 MgSO 4, 1,7 NaH 2 PO 4, 2,0 CaCl 2, NaCl 9,5 6 H 11 O ( Natriumgluconat), 5.5 Glucose, 7.5 Saccharose und 10 N-2-hydroxyethylpiperazine- N &#39;-2 ethanesulfonic Säure (HEPES); pH 7,4 ± 0,05 17. Eine Fließgeschwindigkeit von 15-30 ml / min empfohlen. Gezeigt ist ein im Handel erhält Bad von 25 ml Kapazität mit zwei an der Unterseite der Wanne, brachten Gewebe Pfosten und einer Halterung für eine Kraft und Längenregler (ungefähre Abmessungen Badewanne befestigt stimulierenden Elektroden 8,5 cm x 3 cm x 1 cm; Spezifikationen siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung). </li><li> Verwenden Sie die restlichen FHL Gewebe, um das isolierte Muskelnerv behandeln und legen Sie sie in das Gewebe Badewanne. Legen Sie ein kleines Stück Sylgard auf der Unterseite der Schale und verwenden Sie ein Insektenstift durch die verbleibenden FHL Gewebe, um den Muskel zu stabilisieren. </li><li> Verwenden Sie 6-0 Seidenfäden, beide Sehnen binden und bringen ein Ende mit dem Gewebe Post und die andere mit dem Hebelarm der Kraft und Länge Controller (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Daten). Verwenden Sie den kleinsten Fadenlänge, die praktisch ist. Entfernen Sie die Insektenstift und Sylgard, nachdem Sie die Sehnen gebunden haben. HINWEIS: Um einfach zu erleichternVerbindung mit dem Hebelarm ein kleines Stück Draht in einen &quot;J&quot; förmigen Haken in der Hebelarm mit Epoxy gebogen und befestigt werden. Das Nahtmaterial kann dann mit dem Draht verbunden werden, anstatt in die kleine Öffnung am Hebelarm fädelt. </li><li> Machen Saugelektroden von SA 16 Glas indem Sie zuerst eine Glasmikropipette Puller (Heat = 286, Ziehen = 0, Velocity = 150, Time = 200); brechen Sie die Spitze zurück und manuell schleifen es auf einem Schleifstein, bis es zu einem 3 mm Konus. Schmelzen Sie die Spitze mit einem Mikroschmiede auf die gewünschte Innendurchmesser der Spitze von 10 - 100 um abhängig von dem Bereich der Nerven man von probieren möchte (siehe den 1B-1C für Elektrodenschaltplan und Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Produktinformationen). </li><li> Füllen Sie ein Glas vorgefertigten Saug-Elektrode mit der inneren Silberdraht mit SIF. </li><li> Absaugen des geschnittenen Endes des Nervs in der Elektrode und eine Verbindung zu dem positiven Anschluss des Differenzverstärkers. Wickeln Sie die Elektrode mit einem chlorierten SilberDraht, der mit dem negativen Port des heads verbindet. Erden Sie die SIF-Bad, indem Sie einen zweiten chlorierten Silberdraht aus dem Bad zu Boden-Port des heads ist. Auch erden Infusionsschlauch an den Faraday-Käfig an mehreren Punkten zu elektrischen Störungen über die Perfusion Pumpen eingeführt mildern. </li><li> Stimulieren die Muskeln über die auf beiden Seiten des Muskels im Gewebe Bad, ein Zucken Kontraktion induzieren montiert Elektroden. Alternativ stellen eine stimulierende Elektrode, die auf dem geschnittenen Ende des Nervs. Erhöhen Sie die anregende Spannung, bis eine Spitzenkontraktionskraft beobachtet und dann erhöhen die Spannung um weitere 15% auf supraSpannung (0,5 ms Pulsbreite) zu erreichen. Weiterhin Twitch Kontraktionen im supramaximaler Spannung mit einer 10 sec Rest dazwischen, sondern variieren die Länge des Muskels bis zu einem Spitzenkontraktionskraft erreicht ist, um die optimale Länge (L o) des Muskels zu finden. Alle Längen Rampen und Schwingungen mit dem Muskel an diesem Leng startenth. </li><li> Damit das Muskelnerven Zubereitung in dem Bad für mindestens 1 Stunde bleiben, bevor nachfolgende Datenerfassung zu ermöglichen, das Gewebe um die Badtemperatur zu erreichen und für die normale synaptische Übertragung zu erholen folgende Zerlegung in einem niedrigen Calciumlösung. </li><li> Um die Daten an einem anderen als Raumtemperatur Temperatur zu sammeln, legen Sie einen Temperaturfühler in das Gewebe Bad in der Nähe des Muskels. Langsam bringen das Bad auf Temperatur durch Pumpen erwärmte Wasser durch das Gewebe Bad Bodenplatte. Wickeln Ton mikrowellen Heizkissen um die SIF Reservoir zu helfen, eine gleichbleibende Temperatur. </li></ol> 3. Datensammlung <ol><li> Um eine afferente als afferenten identifizieren, notieren Sie die neuronale Aktivität während der wiederholten Kontraktionen Zucken von einem 0,5 ms supraSpannungsReiz produziert geliefert einmal pro Sekunde. HINWEIS: Muskelspindel-Afferenzen sollten während der Kontraktion Zucken 18,19 (Abbildung 2) zu unterbrechen. </li><li> Verwenden data Erfassungssoftware zu Längenänderungen bei unterschiedlichen Geschwindigkeiten und zu unterschiedlichen Längen gelten. Verwenden Sie ein benutzerdefiniertes Skript, um diese Aufgabe zu automatisieren (siehe Zusatzinformationen für einen Screenshot des Skripts und Anweisungen, wie man die Strecken gegeben anpassen). Anlegerampen-Halte-Abschnitte von 4 Sekunden bei Dehnungslängen von 2,5%, 5% und 7,5% L o und Dehnungsgeschwindigkeiten von 20, 40 oder 60% L o / s 15. HINWEIS: Siehe Bedienungsanleitung für spezifische Kraft und Länge Controller für notwendig Spannungs-Millimeter-Umrechnungsfaktor. </li><li> Am Ende des Experiments bestimmen Muskel Gesundheit bei 24 ° C mit maximalen isometrischen tetanischen Kontraktionen (500 ms Zug, Zug 120 Hz-Frequenz, 0,5 ms Pulsbreite, supraSpannung). Vergleichen Sie die Spitzenkontraktionskraft zu früher berichteten Werten (~ 24 N / cm 2 9,20). </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensitivity+of+group+III+and+group+IV+afferents+from+incised+muscle+in+vitro.">Increased sensitivity of group III and group IV afferents from incised muscle in vitro.</a> Pain. 151, 744-755 (2010).</li></ol>

The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

Das Ziel dieses Artikels war es, ein Verfahren zur Aufzeichnung von Muskelspindel-Afferenzen in einer isolierten Maus-Muskel-Nerv Zubereitung zu beschreiben. Wir haben festgestellt, dass der Maus Spindel Afferenzen reagieren ähnlich wie die von Ratten, Katzen und Menschen 15 zu dehnen, und anderen Laboratorien haben Mäuse als Modellorganismen verwendet, um sensorische Neuronen sowohl im Muskel-und Haut in vitro-Studie (zB 3,13) . Muskel sensorischen afferenten für mindestens 6-8 Stunden bei jeweils 24 ° C und 34 ° C aufgezeichnet. Zur Minimierung der Handhabung der EDL und Nerven, verwenden Sie den verbleibenden Teil der FHL, um das Gewebe zu behandeln, wenn möglich. Nach der Präparation, warten Sie mindestens 1 Stunde bis Datensammlung zu starten, damit das Gewebe, um zu baden und Temperatur für den normalen synaptischen Übertragung ins Gleichgewicht zu erholen. Zuvor war Muskel Gesundheit auf einer Untergruppe von Muskeln in dieser Zubereitung durch Bestimmen, dass der maximale tetanische Gegen verifiziertctile Kraft durch die Muskeln erzeugt wird, ist ähnlich derjenigen von anderen am Anfang und am Ende des Experiments 15 gemeldet. Muskelspindel Afferenzen wurden funktionell in dieser Zubereitung durch die Suche nach einer charakteristischen Pause beim Brennen entsprechend der Kontraktion twitch (Abbildung 2) sowie die erwarteten Momentanfrequenz erhöht sich in Abhängigkeit von Änderungen Länge (Figur 3) identifiziert. Nach unserer Erfahrung die meisten Afferenzen, die in Kontrollbedingungen Fire Muskelspindel-Afferenzen. Die Länge der in dieser Zubereitung (~ 7 mm maximal) beibehalten Nerven ist nicht lang genug, um Unterschiede afferenten Leitungsgeschwindigkeit verwenden, um Muskel afferenten Subtypen 13 zu identifizieren. Zusätzlich, anders als bei Katzen und Menschen, Maßnahmen der dynamischen Empfindlichkeit nicht in der Lage, klar zu unterscheiden Gruppe Ia und II Afferenzen in Mäusen (für eine weitere Diskussion siehe Wilkinson et al. 15). Andere Subtypen von Afferenzen (dh., Gruppe III und IV) können mit zusätzlichen funktionellen Tests in dieser Zubereitung identifiziert werden, beispielsweise durch Zugabe von Substanzen wie Capsaicin, ATP oder Bradykinin, abnehm Bad-pH, Aussetzen der Muskel Ischämie usw. 3,13,21-23 Verwendung Saugelektroden können die Aktivität von mehreren sensorischen Neuronen auf einmal aufgezeichnet werden kann, was die Menge der Daten, die von einer einzelnen Muskel gesammelt werden kann, erhöht. Diese Vorbereitung kann verwendet werden, um die Gesamtwirkung einer Störung der sensorischen Neuronenpopulation Antworten oder die Antworten der identifizierten Afferenzen messen werden. Wenn die Spitze Formen sind einzigartig genug ist, können bis zu 4 sensorischen Neuronen durch Software unterschieden werden (beide Spike2 (Cambridge Electronic Design) und LabChart Pro (AD Instruments) haben ähnlich durchgeführt). In Fällen, bei denen Neuronen nicht unterschieden werden, können Änderungen in der Elektrodenanordnung oder Spitzendurchmesser leicht implementiert werden. Zusammenfassend ist die Maus Muskel-Nerv in vitro preparation ist eine einfache experimentelle Ansatz, der verwendet werden kann, um die Reaktionseigenschaften des Muskels sensorischen afferenten verschiedenen physikalisch-chemischen Störungen, Verletzungen und Krankheitsmodellen untersucht werden. Zusätzlich wird dieses Präparat ideal geeignet, um die Vorteile der leistungsfähigen genetischen Werkzeuge zur Verfügung, bei Mäusen, einschließlich der transgenen Tiere und optogenetischen Werkzeugen zu nehmen.

Skelettmuskeln werden von sensorischen Neuronen, die das zentrale Nervensystem mit wichtigen Informationen über den Muskel-Umgebung bieten innerviert. Muskelspindeln sind hochspezialisierte eingekapselten Strukturen intrafusale Muskelfasern, die parallel extrafusalen Muskelfasern zusammengesetzt sind. Spindeln von Gruppe Ia und II Afferenzen, die Veränderungen in der Muskellänge und intrafusalen Faser Ton wird dynamisch durch innervier Gamma-Motoneuronen 1 geregelt kodieren innerviert. Gruppe Ib Afferenzen zwischen Muskelfasern und die Sehnenansätze angeordnet und sind empfindlich gegenüber Veränderungen der Muskelkraft, beispielsweise während der Muskelkontraktion 2. Die Gruppe Ia, Ib und II Afferenzen bieten propriozeptiven Rückmeldungen, die in den entsprechenden Motorsteuerung unterstützt. Weitere Populationen von Muskel Afferenzen in der gesamten Muskel befindet (Gruppe III und IV) dienen Metabolit Aufbau, das Vorhandensein von nozizeptiven Reize und Muskeltemperatursignal <sup&gt; 3. Dieser Muskel sensorische Informationen ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase, verhindert Muskelschäden und Regel Bewegung. Muskel Afferenzen können ihre Feuermuster, basierend auf früheren Erfahrungen 4 zu ändern. Aktivierung von Nozizeptoren können auf die Induktion von chronischen Schmerzzuständen und 5 abweichende Signalisierung von der Muskel Propriozeptoren führen kann, um Probleme mit dem Gleichgewicht oder Bewegungs 6 führen. Wir verwenden eine isolierte Muskelnerv in vitro Vorbereitung, um die Reaktion des Muskels sensorischen Neuronen Rezeptor Endungen von erwachsenen Mäusen beider Geschlechter zu studieren (abgebildet sind Antworten 2-4 Monate alten C57BL / 6 Mäuse). Die Maus ist das Modell genetische Spezies für Studien bei Säugetieren. Diese Vorbereitung erfordert die Isolierung des tiefen Wadenbein Zweig der Ischiasnerv und dem extensor digitorum longus (EDL) Muskels, ein schnell zuckenden Muskel der Peronealgruppe im lateralen Teil des Unterschenkels gefunden. Die EDL wird oft verwendet, um die Muskelkontraktionseigenschaften 7-9 zu studieren, hat tendons, die einfach sind, zu isolieren und ist klein genug, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung Diffusions in Ruhe und mit vernünftigen Kontraktion Arbeitszyklen 10 zu ermöglichen. Andere Muskeln in diesem Bereich (beispielsweise soleus und tibialis anterior) von ähnlicher Größe sind und diese Zubereitung kann leicht modifiziert werden, um von Afferenzen dieser Muskeln aufzunehmen. Eine Saugelektrode auf das Schnittende des Nervs zu Muskel sensorischen afferenten Brenn aufnehmen platziert. Einzelnen Neuronen identifiziert und basierend auf ihrer Spitzenform mit Spitze Sortiersoftware analysiert. Stimulationselektroden in der Badewanne oder auf den Nerv kann verwendet werden, um die Muskelkontraktion hervorzurufen. Muskellänge und Kraft gesteuert und gemessen unter Verwendung von kommerziell verfügbaren Systemen werden. Ähnliche In-vitro-Präparate haben in Nagetieren verwendet worden, um der Gruppe III und IV Muskel Afferenzen bei der Ratte, Gruppe Ia und II Spindel Afferenzen in der Ratte vierten Zehe Lumbrikalmuskel Muskel 12 und Gruppe III und IV Muskel Afferenzen in t studieren EDL 11er Maus Fußsohlenmuskel 13. Ein in vitro-System hat die Vorteile der pharmakologischen Zugänglichkeit und direkte Steuerung des Perfusat und physikochemischen Größen wie Temperatur und pH-Wert. Ein in vitro-Ansatz eliminiert das Potenzial in vivo verwechselt der Anästhesie-und Muskeldurchblutung Status. Während die Muskelnerven Herstellung ermöglicht die Untersuchung der direkten Reaktion einer Störung auf den Afferenzen, die Fähigkeit zur Modulation der Gamma efferenten Spindel Empfindlichkeit und anderen integrierten Antworten Studie, die mit in vivo-oder ex vivo-14 3 Zubereitungen als geopfert möglich ist keine neuronale Zellkörper in dieser Zubereitung. Dieses Präparat wurde früher verwendet, um die Reaktion der Maus Muskelspindel-Afferenzen zu einer Batterie von Rampe zu charakterisieren und zu halten Dehnungen und Schwingungen und es wurde festgestellt, dass die Maus afferenten Responses waren ähnlich denen in anderen Spezies, wie Ratten, Katzen und Menschen berichtet. Maus afferenten Reaktionen gefunden wurden ähnlich sowohl 24 ° C und 34 ° C Badtemperatur zu sein, obwohl bei 34 ° C absolut Feuerraten schneller waren und die Afferenzen waren in der Lage, schneller zu reagieren Länge ändert 15. Wir beschreiben im Folgenden, wie diese Vorbereitung kann verwendet werden, zu identifizieren und zu untersuchen die Muskelspindel-Afferenzen werden. Darüber hinaus kann diese Herstellung leicht modifiziert werden, um die Reaktion der anderen Muskel afferenten Subtypen 13 zu untersuchen, um die Eigenschaften der sensorischen afferenten in Reaktion auf ein Medikament oder einen Krankheitszustand oder verschiedene andere Variablen (zB Alter, Geschlecht, Gen-Knockout) zu vergleichen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Force and Length Controller &#38; Tissue Bath</td>
			<td>Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>300C-LR &#38; 809B-IV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &#38; Easy Load II Pump Head</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07523-80 &#38; EW-77200-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &#38; Headstage Amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 1800; 700000 &#38; 700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simulator</td>
			<td>Grass 
			OR 
			Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>S88 
			OR 
			701 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>892070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Fiberlite</td>
			<td>Model 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog to Digital Board</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition &#38; Analysis Software</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>LabChart Pro 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Glass</td>
			<td>Dagan</td>
			<td>SA16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-80/PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflourane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>18627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14014-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF 
			(Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

Muskel sensorischen Neuronen innervieren Muskelspindeln und Golgi-Sehnenorgane kodieren Länge und Kraftänderungen wesentlich, Propriozeption. Zusätzliche Afferenzen überwachen andere Eigenschaften der Muskelumgebung, einschließlich Metaboliten Aufbau, der Temperatur und nozizeptiven Reize. Insgesamt kann abnormale Aktivierung von sensorischen Neuronen von Bewegungsstörungen oder chronischen Schmerzsyndromen führen. Wir beschreiben die Isolierung des extensor digitorum longus (EDL) Muskel-und Nerven für in-vitro-Studie von Dehnungs-evozierte zuführenden Reaktionen in der erwachsenen Maus. Sensorischen Aktivität von Nerven mit einem Saug-Elektrode erfasst und einzelnen Afferenzen kann mit Spike-Sortiersoftware analysiert werden. In-vitro-Präparate erlauben eine gut kontrollierte Studien zur sensorischen Afferenzen ohne die möglichen verwechselt der Anästhesie oder verändert Muskeldurchblutung. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu identifizieren und testen Sie die Reaktion der Muskelspindel-Afferenzen zu strecken. Wichtig ist,diese Vorbereitung unterstützt auch die Studie von anderen Subtypen der Muskel Afferenzen, Antworteigenschaften nach der Arzneimittelanwendung und den Einbau von leistungsfähigen genetischen Ansätzen und Krankheitsmodellen in Mäusen.

Die Reaktion des Muskels Afferenzen kann nach einer Vielzahl von Störungen aufgezeichnet werden, je nachdem, welche afferenten Subtyp untersucht wird. Vertreter Reaktionen der Muskelspindel-Afferenzen die Muskelkontraktion und Rampe und halten Strecke werden hier gezeigt. Um eine afferente als afferenten identifizieren twitch Kontraktionen werden einmal pro Sekunde (0,5 ms Pulsbreite), um zu sehen, ob es eine Pause in der Brenn während der Kontraktion 18,19 gegeben. Figur 2 zeigt eine repräsentative Spur von neuronaler Aktivität und Muskelspannung während diese zuckenden Kontraktionen. Kein neuronale Aktivität während zucken Kontraktionen beobachtet, wie für Spindel Afferenzen erwartet. Wenn die aufgezeichnete afferenten eine Gruppe Ib Golgi-Sehnen-Organ afferenten eine Erhöhung Feuerrate während der Kontraktion zu erwarten. Unter Kontrollbedingungen meisten Afferenzen mit einem regelmäßigen Muster Brenn (~ 12 Impulse / s bei 24 ° C und ~ 32 Impulse / s bei 34 ° C) Sind Muskelspindel-Afferenzen. Eine Untergruppe der Spindel Afferenzen wird nur Feuer während Strecke (in der Hand ~ 11% der Spindel Afferenzen) 15. 3A zeigt eine repräsentative rohen Spur von zwei Muskelspindel-Afferenzen der Reaktion auf eine Rampe und halten Strecke durch die Kraft und Länge Controller erzeugt. Der Spike Histogramm Merkmal LabChart wird verwendet, um zu identifizieren und zu analysieren, die momentane Feuerfrequenz der beiden einzelnen Neuronen getrennt (3B-3C). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Isolierte Muskel-Präparat A) Die extensor digitorum longus (EDL) und innervierIschiasNerv in einem isolierten Gewebe Bad mit sauerstoff synthetischen interstitiellen Flüssigkeit (SIF) durchströmt montiert. Eine extrazelluläre Verstärker auf einen sucti verbundenauf der Elektrode zeichnet neuronalen Aktivität. Ein Dual-Kraft und Länge Controller-mit der entsprechenden Software-Kontrollen und Maßnahmen Muskelkraft und Länge. Die Gewebe Bad Elektroden liefern Reize zu erzeugen zucken oder tetanische Kontraktionen. Pumpen erwärmte Wasser durch interne Bad Plattenkanäle steuert die Gewebetemperatur Bad. B) gezogen Glaselektrode mit Saug ~ 3 mm verjüngten Spitze. C) Vergrößerte Darstellung der idealen Form der Spitze für die Absaugung Elektrode, die mit einem Mikroschmiede produziert wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. afferenten entsprechend der Kontraktion zucken. Neuronale activity (obere Kurve) und die Muskelspannung (untere Kurve) von 30 zucken Kontraktionen sind mit überlappenden oberen Spur in schwarz überlagert. Afferenten Aktivität Pausen während der Kontraktion-induzierte Spannungserhöhung, die eine charakteristische Antwort von Muskelspindel-Afferenzen ist. Klammer und Pfeil über der oberen Spur bezeichnen die Zeit während der Kontraktion, wenn die Aktivität angehalten wird. <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> Abbildung 3. afferenten Antwort während einer Rampe Rampe und Halten Stretch A) Raw neuronale Aktivität von zwei Afferenzen (obere Kurve) und halten strecken, um die EDL (untere Kurve in gezeigt Muskellänge). B) Sofortfeuerfrequenz (Inst angewendet. Fr., Impulse pro Sekunde) der Einheit zeigt Aktivität bei L o von A (in blau dargestellt). C) InstantanéOrganisationseinheiten Schussfrequenz der kleineren Einheit, die nur Brände während der Strecke (in orange dargestellt). Beide Geräte zeigen die Spitze Frequenzanpassung beim Streck, die charakteristisch für Muskelspindel-Afferenzen 1 ist.

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An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Adult Maus Muskel-Nerven Vorbereitung für das Studium der Brenneigenschaften des Muskel-Afferenzen

Muskel sensorischen Neuronen sind in proprioceptor Signalübertragung beteiligt und auch auf Stoffwechselzustand und Verletzungen bezogene Ereignisse zu berichten. Wir beschreiben einen erwachsenen Maus in vitro Muskel-Nerven Vorbereitung für Studien über Stretch-aktivierte Muskel Afferenzen.

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Die Untersuchung der Integration von Adult-geboren Neurons

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Forschung

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An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

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Ein<em&gt; In-vitro</em&gt; Vorbereitung von isolierten Neuronen und Glia Enteric vom Plexus myentericus der erwachsenen Maus

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

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