Name: an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents
Uploaded: 2014-09-24T13:00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

יש לקבל את אתיקה לאומית ומוסדית מתאימה לפני ביצוע ניסויים בבעלי חיים. .1 הסרה של שרירים EDL ועצב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול ועמוק להרדים עכבר מבוגר עם isofluorane בשאיפה באמצעות אידוי עם isofluorane 5% בתוספת 1.5 L / קצב זרימת חמצן דקות או צנצנת פעמון עם הכותנה isofluorane ספוג בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהעכבר הוא עמוק בהרדמה ואינו מגיב לקמצוץ הבוהן. במהירות לערוף באמצעות מספריים גדולים, חידדו או גיליוטינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קו האמצע הגחון דרך הצלעות באמצעות מספריים ולהסיר את האיברים הפנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עור בעלי החיים ידי אחיזה בעור מאזור הצוואר ומושך את זה בעבר הרגליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרגליים על ידי חיתוך מעל הירכיים ומניחים את רגלי עור לתוך צלחת עם (4 ° C) המצונן, carbogenated (95% O 2, 5% CO 2) סידן נמוך, contai תמיסת מלח ביקרבונט שנאגרו גבוה מגנזיוםנינג במ&quot;מ: 128 NaCl, KCl 1.9, 1.2 KH 2 PO 4, 26 3 NaHCO, 0.85 CaCl 2, 6.5 MgSO 4, ו10 גלוקוז (pH של 7.4 ± 0.05) 16. סידן הנמוך, פתרון הגבוה מגנזיום מעכב שידור סינפטי במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את רגלי צד גב בצלחת ולהצמיד את הרגליים וירכיים למטה באמצעות מחטים או סיכות חרקים, כך שמפרקי הברך וקרסול נמצאים בזווית של ° 90. הנח פינים בכל קצה של הרגליים וסיכה אחת בכל אחת מהקדמית וירכיים אחורי כדי להחזיק את הרקמה במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים אביב Castroviejo, להרים את השכבה העליונה של שריר בירכיים ולעשות קו האמצע לחתוך לחשוף את גיד הנשה ישירות מתחת. גיד הנשה ממוקם ממש מתחת לשכבת השריר העליונה והוא פועל מעל לעצם הירך מהיציאה שלה ליד הירכיים עד שסניפים לperoneal המשותף והעצב הטיביאלי רק לפני מפרק הברך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השריר מעל גיד הנשה עד פוint שבצלילות סניף עצב peroneal העמוקים לתוך שריר longus hallucis המכופף (FHL) הוא גלויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות # 55 מלקחיים, לנתח את רקמת החיבור סביב סניף peroneal כדי לשחרר אותו משרירי הגסטרוקנמיוס וsoleus, אשר נמצאים בצד המדיאלי של הטיביה. חותך את הגידים של שרירי הגסטרוקנמיוס וsoleus ולהסיר אותם בזהירות מתחת לעצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השרירים השטחיים בצד הלטרלי של הטיביה לחשוף שלוש חבילות גיד נפרדות בקרסול משותף מהמדיאלי לרוחב: FHL, EDL, וקדמי tibialis (ת&quot;א), עם EDL החבוי מתחת לת&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גיד ת&quot;א במפרק הקרסול, להרים את ת&quot;א למעלה מן האדים, ולחתוך את השריר ליד הברך כדי להסיר אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גיד FHL בקרסול ולהרים אותו חזרה כדי להגיע לאזור שבו העצב נכנס FHL. חותך רק מתחת לנקודה זו ולהסיר ~ 2/3 של שריר FHL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גיד הנשה הקרוב למפרק הירך כמו possible ועדינות להפשיט את כל ענפי העצב, פרט לסניף peroneal העמוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גידי EDL בשני מפרקי הקרסול והברך באמצעות מספריים אביב גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים חדים, להסיר את האדים, FHL שנותר ועצב מן הרקמה הסובבת על ידי חיתוך דרך עצם השוקה בברך ובאמצע הירך. לחתוך את עצם השוקה שנותר, כך שרק האדים, חלק מFHL והעצב יישארו. </li></ol> 2 הרכבה של השרירים EDL והעצב לתוך אמבט רקמות (איור 1 א) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת הניסוי, להכין את האמבטיה הרקמות. כל הזמן perfuse האמבטיה עם חומץ (100% O 2) נוזל ביניים סינטטי (SIF) המכיל (במ&quot;מ) 123 NaCl, KCl 3.5, 0.7 MgSO 4, 1.7 לאא 2 PO 4, 2.0 CaCl 2, 9.5 NAC 6 H 11 O ( gluconate נתרן), 5.5 גלוקוז, סוכרוז 7.5, ו10 N &#39;N -2-hydroxyethylpiperazine- -2-etחומצת hanesulfonic (HEPES); pH 7.4 ± 0.05 17. קצב זרימה של 15-30 מ&quot;ל / דקה מומלצת. מוצג היא אמבטיה זמינה מסחרי של 25 מ&quot;ל קיבולת עם שתי אלקטרודות גירוי קבועות לתחתית האמבטיה, הודעה רקמות רכובה והר לבקר כוח ואורך (מידות אמבטיה משוערת 8.5 סנטימטר x 3 ס&quot;מ x 1 סנטימטר; למפרטים ראה טבלה של חומרים / ציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ברקמת FHL שנותרה לטפל בשריר העצב הבודד ולמקם אותו לתוך האמבטיה הרקמות. מניחים חתיכה קטנה של sylgard בתחתית הצלחת ולהשתמש בסיכת חרקים דרך רקמת FHL שנותרה כדי לייצב את השרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 6-0 תפרי משי לקשור את שני הגידים ולהדביק קצה אחד לתפקיד רקמות ואחר לזרוע המנוף של הכוח ובקר אורך (ראה טבלה של חומרים / ציוד למפרט). השתמש באורך התפר הקטן ביותר שהוא מעשי. הסר את סיכת החרקים וsylgard לאחר שקשרת את הגידים. הערה: כדי להקל קלחיבור למנוף זרוע חתיכה קטנה של חוט יכולה להיות כפופה ל&quot; j &quot;וו בצורה וקבועה לזרוע המנוף עם אפוקסי. התפר אז יכול להיות קשור לחוט במקום מושחל לתוך החור הקטן על זרוע המנוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך אלקטרודות יניקה מSA 16 זכוכית באמצעות חולץ micropipette הכוס הראשון (חום = 286, משוך = 0, מהירות = 150, זמן = 200); לשבור את הקצה אחורי וידני לטחון אותו על אבן השחזה עד שיהיו על להתחדד 3 מ&quot;מ. ממסים את הקצה באמצעות microforge לקוטר הפנימי הקצה הרצוי של בין 10-100 מיקרומטר בהתאם לאזור של עצב אחד רוצה לטעום מ( ראה איורים 1 ב-1C לאלקטרודה סכמטי ולוח של חומרים / ציוד למידע על מוצר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא האלקטרודה יניקת זכוכית premade לחוט הכסף הפנימי עם SIF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יניקת סוף החתך של העצב לאלקטרודה ולהתחבר ליציאה החיובית של מגבר ההפרש. עטוף את האלקטרודה עם כסף chloridedחוט שמתחבר ליציאה השלילית של headstage. קרקע האמבטיה SIF על ידי הפעלת חוט כסף chlorided שני מהאמבטיה לנמל הקרקע של headstage. גם לקרקע את צינורות טפטוף לכלוב פאראדיי במספר רבים של נקודות כדי להקטין רעש חשמלי הציג באמצעות משאבות זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר את השרירים באמצעות אלקטרודות מוצמדות לכל צד של השריר באמבטיה הרקמות כדי לגרום להתכווצות עווית. לחלופין להציב אלקטרודה מגרה בקצה החתך של העצב. הגדל את מתח המגרה עד כוח התכווצות שיא הוא ציין ולאחר מכן להגדיל את המתח על ידי 15% נוספים כדי להגיע למתח supramaximal (0.5 רוחב פולס אלפיות שני). המשך התכווצויות העווית במתח supramaximal, עם שאר 10 שניות שביניהם, אבל להשתנות האורך של השריר עד כוח התכווצות שיא הוא הגיע כדי למצוא את האורך האופטימלי (o L) של השריר. כל רמפות האורך והתנודות יתחילו עם השרירים בleng זהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר הכנת שריר העצבים להישאר באמבטיה במשך שעה לפחות 1 לפני איסוף הנתונים הבא על מנת לאפשר לרקמות כדי להגיע לטמפרטורת האמבט ולשידור סינפטי רגיל להתאושש לאחר נתיחה בפתרון סידן נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף נתונים בטמפרטורה אחרת מאשר טמפרטורת חדר, למקם את הבדיקה טמפרטורה לאמבטיה הרקמות ליד השריר. לאט לאט מביא את האמבטיה עד לטמפרטורה על ידי שאיבת מים מחוממים באמצעות צלחת בסיס אמבטיה רקמות. לעטוף כריות חימום במיקרוגל חימר סביב מאגר SIF כדי לעזור לשמור על טמפרטורה יציבה. </li></ol> .3 אוסף נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות מביא כמביא ציר, להקליט את הפעילות העצבית במהלך צירים חוזרים ונשנים עווית המיוצרים על ידי גירוי מתח 0.5 supramaximal האלפיות השני נמסר פעם אחת בכל שנייה. הערה: afferents כישור השריר צריכה להשהות במהלך 18,19 התכווצות עווית (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש daתוכנת רכישת ta כדי להחיל את השינויים באורך במהירויות שונות ואורכים שונים. השתמש בתסריט מותאם אישית כדי להפוך משימה זו (ראה מידע נוסף לצילום מסך של התסריט והוראות כיצד להתאים אישית את המתיחות שניתנו). החל משתרע רמפה והחזקה של 4 שניות באורכי מתיחה של .2.5%, 5%, ו7.5% o L ומהירויות מתיחה של 20, 40, או 60% o L / 15 שניות. הערה: עיין במדריך למשתמש של כוח ספציפי ובקר אורך לגורם המרת מתח ל-מילימטר הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של הניסוי, לקבוע בריאות שריר ב24 מעלות צלזיוס באמצעות התכווצויות מקסימליים איזומטרי tetanic (500 רכבת אלפיות שנייה, תדירות רכבת הרץ 120, 0.5 רוחב פולס msec, מתח supramaximal). השווה את כוח התכווצות השיא לערכים שדווחו בעבר (~ 24V N / 2 סנטימטר 9,20). </li></ol>

<ol>
	<li>Matthews, P. B. C., Brookes, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+1,+The+Nervous+System,+Motor+Control.">Section 1, The Nervous System, Motor Control.</a> Handbook of Physiology. , 189-228 (1981).</li><li>Houk, J., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Golgi+tendon+organs+to+forces+applied+to+muscle+tendon.">Responses of Golgi tendon organs to forces applied to muscle tendon.</a> J Neurophysiol. 30, 1466-1481 (1967).</li><li>Jankowski, M. P., Rau, K. K., Ekmann, K. M., Anderson, C. E., Koerber, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotyping+of+group+III+and+IV+muscle+afferents+in+mouse.">Comprehensive phenotyping of group III and IV muscle afferents in mouse.</a> J Neurophysiol. 109, 2374-2381 (2013).</li><li>Nichols, T. R., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-bridge+mechanisms+underlying+the+history-dependent+properties+of+muscle+spindles+and+stretch+reflexes.">Cross-bridge mechanisms underlying the history-dependent properties of muscle spindles and stretch reflexes.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82, 569-576 (2004).</li><li>Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociception+from+skeletal+muscle+in+relation+to+clinical+muscle+pain.">Nociception from skeletal muscle in relation to clinical muscle pain.</a> Pain. 54, 241-289 (1993).</li><li>Proske, U., Gandevia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proprioceptive+Senses:+Their+Roles+in+Signaling+Body+Shape,+Body+Position+and+Movement,+and+Muscle+Force.">The Proprioceptive Senses: Their Roles in Signaling Body Shape, Body Position and Movement, and Muscle Force.</a> Physiol Rev. 92, 1651-1697 (2012).</li><li>Close, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force:+velocity+properties+of+mouse+muscles.">Force: velocity properties of mouse muscles.</a> Nature. 206, 718-719 (1965).</li><li>McCully, K. K., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+to+skeletal+muscle+fibers+of+mice+following+lengthening+contractions.">Injury to skeletal muscle fibers of mice following lengthening contractions.</a> J Appl Physiol. 59, 119-126 (1985).</li><li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young,+adult+and+aged+mice.">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J Physiol. 404, 71-82 (1988).</li><li>Barclay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diffusive+O(2)+supply+to+isolated+preparations+of+mammalian+skeletal+and+cardiac+muscle.">Modelling diffusive O(2) supply to isolated preparations of mammalian skeletal and cardiac muscle.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 26 (2), 225-235 (2005).</li><li>Taguchi, T., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscular+thin-fiber+receptors+in+aged+rats+recorded+in+vitro.">Augmented mechanical response of muscular thin-fiber receptors in aged rats recorded in vitro.</a> European Journal of Pain. 15, 351-358 (2011).</li><li>Simon, A., Shenton, F., Hunter, I., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride-sensitive+channels+are+a+major+contributor+to+mechanotransduction+in+mammalian+muscle+spindles.">Amiloride-sensitive channels are a major contributor to mechanotransduction in mammalian muscle spindles.</a> J Physiol. 588, 171-185 (2010).</li><li>Wenk, H. N., McCleskey, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+skeletal+muscle-nerve+preparation+and+in+vitro+model+of+ischemia.">A novel mouse skeletal muscle-nerve preparation and in vitro model of ischemia.</a> J Neurosci Methods. 159, 244-251 (2007).</li><li>Bullinger, K. L., Nardelli, P., Wang, Q., Rich, M. M., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaliplatin+neurotoxicity+of+sensory+transduction+in+rat+proprioceptors.">Oxaliplatin neurotoxicity of sensory transduction in rat proprioceptors.</a> J Neurophysiol. 106, 704-709 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+muscle+spindle+afferents+in+the+adult+mouse+using+an+in+vitro+muscle-nerve+preparation.">Characterization of muscle spindle afferents in the adult mouse using an in vitro muscle-nerve preparation.</a> PLoS One. 7, e39140 (2012).</li><li>Shreckengost, J., Calvo, J., Quevedo, J., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicuculline-sensitive+primary+afferent+depolarization+remains+after+greatly+restricting+synaptic+transmission+in+the+mammalian+spinal+cord.">Bicuculline-sensitive primary afferent depolarization remains after greatly restricting synaptic transmission in the mammalian spinal cord.</a> J Neurosci. 30, 5283-5288 (2010).</li><li>Koltzenburg, M., Stucky, C. L., Lewin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptive+properties+of+mouse+sensory+neurons+innervating+hairy+skin.">Receptive properties of mouse sensory neurons innervating hairy skin.</a> J Neurophysiol. 78, 1841-1850 (1997).</li><li>Matthews, B. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+muscle.">Nerve endings in mammalian muscle.</a> J Physiol. 78, 1-53 (1933).</li><li>Hunt, C. C., Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+receptor+discharges+during+muscle+contraction.">Stretch receptor discharges during muscle contraction.</a> J Physiol. 113, 298-315 (1951).</li><li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myo-mechanical+analysis+of+isolated+skeletal+muscle.">Myo-mechanical analysis of isolated skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Hoheisel, U., Rein&#246;hl, J., Unger, T., Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+and+capsaicin+activate+mechanosensitive+group+IV+muscle+receptors+in+the+rat.">Acidic pH and capsaicin activate mechanosensitive group IV muscle receptors in the rat.</a> Pain. 110, 149-157 (2004).</li><li>Taguchi, T., Sato, J., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscle+thin-fiber+sensory+receptors+recorded+from+rat+muscle-nerve+preparations+in+vitro+after+eccentric+contraction.">Augmented mechanical response of muscle thin-fiber sensory receptors recorded from rat muscle-nerve preparations in vitro after eccentric contraction.</a> J Neurophysiol. 94, 2822-2831 (2005).</li><li>Xu, J., Gu, H., Brennan, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensitivity+of+group+III+and+group+IV+afferents+from+incised+muscle+in+vitro.">Increased sensitivity of group III and group IV afferents from incised muscle in vitro.</a> Pain. 151, 744-755 (2010).</li></ol>

The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

מטרתו של מאמר זה הייתה לתאר שיטת רישום מafferents כישור שריר בהכנת שריר עצבים עכבר בודדת. מצאנו כי afferents ציר העכבר מגיבה באופן דומה למתוח כמו אלה מחולדות, חתולים ובני אדם 15, ומעבדות אחרות השתמשו עכברים כיצורי מודל ללמוד נוירונים חושיים בשני השרירים והעור במבחנה (לדוגמא 3,13) . afferents החושית השריר ניתן להקליט לפחות 6-8 שעות בשני 24 מעלות צלזיוס ו34 C °. כדי למזער את הטיפול באדים ועצב, להשתמש בחלק הנותר של FHL לטפל רקמה בכל ההזדמנות אפשרית. בעקבות הנתיחה, לחכות לפחות שעה 1 כדי להתחיל אוסף נתונים כדי לאפשר לרקמות לאזן לטמפרטורת אמבטיה ולשידור סינפטי נורמלי להתאושש. בעבר, בריאות שרירים אומתה על קבוצת משנה של שרירים המשמשים בהכנה זו על ידי קביעה כי קונטרה tetanic המקסימליכוח ctile שנוצר על ידי השרירים דומה לזה שדווח על ידי אחרים בתחילת והסיום של הניסוי 15. afferents כישור השריר זוהו פונקציונלי בהכנה זה על ידי מחפש אתנחתא אופיינית בירי בתגובה לעווית התכווצות (איור 2), כמו גם את העליות בתדירות מיידית הצפויות בתגובה לשינויים באורך (איור 3). מניסיוננו, רוב afferents שהופעלה בתנאי שליטה היא afferents כישור שריר. אורכו של העצב נשמר בהכנה זו (~ 7 מקסימום מ&quot;מ) הוא לא מספיק זמן כדי להשתמש בהבדלי מהירות הולכה מביא לזהות תת מביא שריר 13. בנוסף, שלא כמו בחתולים ובני אדם, באמצעים של רגישות דינמית לא היו מסוגלים להבחין בבירור הקבוצה Ia והשני afferents בעכברים (לדיון נוסף ראה וילקינסון et al. 15). סוגים אחרים של afferents (כלומר., הקבוצה שלישית ורביעי) יכול להיות מזוהה בבדיקות פונקציונליות נוספות בהכנה זו, למשל על ידי הוספת חומרים כמו קפסאיצין, ATP, או ברדיקינין, ירידת pH אמבטיה, חושף את השרירים לאיסכמיה, וכו &#39;3,13,21-23 באמצעות אלקטרודות יניקה מאפשר הפעילות מתא עצב חושי מרובה שתירשם בו זמנית, דבר המגדיל את כמות הנתונים שניתן לאסוף משריר אחד. הכנה זו יכולה לשמש כדי לאמוד את ההשפעה הכוללת של ההפרעות על תגובות אוכלוסיית נוירון חושיות או התגובות של afferents המזוהות. אם צורות ספייק הן ייחודיות מספיק, עד 4 תאי עצב תחושתיים יכולה להיות מופלה על ידי תוכנה (שני Spike2 (Cambridge אלקטרוני עיצוב) ו( מכשירים לספירה Pro LabChart) ביצע באופן דומה). במקרים בהם לא יכולים להיות מופלים נוירונים, שינויים במיקום האלקטרודה או קוטר קצה יכולים בקלות להיות מיושמים. לסיכום, שריר העצבים עכבר בהכנה מבחנהני הוא גישה ניסויית פשוטה, שניתן להשתמש כדי לחקור את מאפייני התגובה של afferents החושית שרירים לדגמי הפרעות, פציעה והמחלה physicochemical שונים. בנוסף, הכנה זו היא אידיאלית לנצל את כלים רבי עוצמה הגנטיות הזמינים בעכברים, כולל בעלי חיים מהונדסים וכלים optogenetic.

שרירי שלד מעוצבבים על ידי נוירונים חושיים המספקים את מערכת העצבים המרכזית עם מידע חשוב על סביבת השריר. צירים שריר מאוד מתמחים מבנים במארז מורכבים מסיבי שריר intrafusal הממוקמים במקביל לסיבי שריר extrafusal. צירים מעוצבבים על ידי הקבוצה Ia והשני afferents שלקודד שינויים באורך שריר וטונוס סיבי intrafusal מוסדרים באופן דינמי על ידי הנוירונים מוטוריים גמא innervating 1. afferents Ib הקבוצה ממוקמות בין סיבי שריר והוספות גידם ורגישים לשינויים בכוח שרירים, למשל בעת התכווצות שרירים 2. Ia הקבוצה, Ib והשני afferents לספק משוב הפרופריוצפטיבית שמסייע בשליטה מוטורית מתאימה. אוכלוסיות נוספות של afferents שרירים הממוקמים ברחבי השריר (קבוצה שלישית ורביעי) משמש כדי לאותת הצטברות המטבוליט, הנוכחות של גירויי nociceptive, וטמפרטורת שריר <sup&gt; 3. מידע חושי שריר זה הוא קריטי לשמירה על הומאוסטזיס, מניעת נזק לשרירים וויסות תנועה. afferents השריר יכולה לשנות את דפוסי הירי שלהם המבוססת על הניסיון קודם 4. הפעלה של nociceptors יכולה להוביל לגיוס של מדינות כאב כרוניות 5 ואיתות סוטה מproprioceptors השריר יכול להוביל לבעיות של שיווי משקל או תנועה 6. אנו משתמשים בשרירי עצבים מבודדים בהכנת מבחנה ללמוד את התגובה של הסופים קולט נוירון חושי שרירים מעכברים בוגרים משני המינים (המוצגים הם תגובות של 2-4 חודש C57Bl / 6 עכברים ישנים). העכבר הוא המין הגנטי המודל למחקרים ביונקים. הכנה זו דורשת הבידוד של הסניף העמוק peroneal של העצב משית ושרירי longus digitorum פושטי (אדי), שרירים עווית מהירים של קבוצת peroneal נמצאת בחלק הלטרלי של הרגל התחתונה. EDL משמש לעתים קרובות כדי לחקור את תכונות התכווצות השרירים 7-9, יש tendons כי הם קלים לבודד והוא קטן מספיק כדי לאפשר אספקת חמצן diffusive נאותה במנוחה ועם מחזורי חובת התכווצות סבירים 10. שרירים אחרים באזור זה (לדוגמא soleus וקדמי tibialis) הם בגודל דומה והכנה זה יכול לשנות בקלות כדי להקליט מafferents משרירים אלו. האלקטרודה יניקה ממוקמת על קצה החתך של העצב להקליט ירי מביא חושי שריר. ניתן לזהות נוירונים בודדים ונותחו על פי צורת ספייק שלהם באמצעות תוכנת מיון ספייק. גירוי אלקטרודות באמבטיה או על העצב יכול לשמש כדי לעורר התכווצות שרירים. אורך שריר וכוח יכולים להיות מבוקר ונמדדו באמצעות מערכות זמינות מסחרי. דומה במבחנה הכנות כבר בשימוש במכרסמים כדי ללמוד afferents שריר הקבוצה השלישית והרביעית בחולדה 11 EDL, afferents ציר הקבוצה Ia והשנייה בשריר בוהן העכברוש הרביעי lumbrical 12 ושרירים הקבוצה שלישי והרביעיים afferents בtהוא שריר plantar העכבר 13. מערכת במבחנה יש את היתרונות של נגישות תרופתית ושליטה ישירה של משתני perfusate וphysiochemical כמו טמפרטורה וחומציות. גישה במבחנה מבטלת את הפוטנציאל in vivo מבלבל מעמד זלוף הרדמה ושרירים. בעוד הכנת שריר העצבים מאפשרת לחקר התגובה הישירה של ההפרעות בafferents, היכולת ללמוד אפנון efferent גמא של רגישות ציר ותגובות משולבות אחרות שאפשרי עם in vivo 14 או ex vivo 3 הכנות הוא הקריבה כ אין גופי תא עצביים בהכנה זו. הכנה זו שימשה בעבר כדי לאפיין את התגובה של afferents כישור שריר עכבר לסוללה של רמפה ולהחזיק מתיחות ורעידות ונקבע כי respons מביא ציר העכברes היו דומה לאלו שדווחו במינים אחרים כגון חולדות, חתולים, ובני אדם. תגובות מביא ציר עכבר נמצאו דומה בשתי מעלות צלזיוס 24 ו34 ° טמפרטורות האמבטיה C, אם כי ב34 ° שיעורי ירי מוחלט C היו מהירים יותר וafferents היו יותר מסוגל להגיב לאורך מהר משנה 15. אנו מתארים בהמשך כיצד הכנה זו יכולה לשמש כדי לזהות וללמוד את afferents כישור שריר. יתר על כן, הכנה זו יכולה בקלות להיות שונה כדי ללמוד את התגובה של תת מביא שריר אחר 13, כדי להשוות את המאפיינים של afferents החושית בתגובה למדינת תרופה או מחלה או משתנה שונים אחרים (למשל, גיל, מין, נוקאאוט גן).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Force and Length Controller &#38; Tissue Bath</td>
			<td>Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>300C-LR &#38; 809B-IV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &#38; Easy Load II Pump Head</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07523-80 &#38; EW-77200-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &#38; Headstage Amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 1800; 700000 &#38; 700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simulator</td>
			<td>Grass 
			OR 
			Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>S88 
			OR 
			701 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>892070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Fiberlite</td>
			<td>Model 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog to Digital Board</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition &#38; Analysis Software</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>LabChart Pro 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Glass</td>
			<td>Dagan</td>
			<td>SA16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-80/PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflourane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>18627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14014-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF 
			(Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

עצב סנסורי שריר innervating צירים שרירים ואיברי גיד Golgi לקודד אורך וכוח שינויים חיוניים לפרופריוספציה. סיבים הביא נוספים לפקח על מאפיינים אחרים של סביבת השריר, כוללים הצטברות המטבוליט, טמפרטורה, וגירויים nociceptive. בסך הכל, הפעלה לא תקינה של תאי עצב תחושתיים יכולה להוביל להפרעות תנועה או תסמונות כאב כרוניות. אנו מתארים את הבידוד של longus digitorum פושטי השריר (EDL) ועצב למחקר במבחנה של תגובות מביא עורר קטע בעכבר המבוגר. פעילות חושית נרשמה מהעצבים עם האלקטרודה יניקה וניתן לנתח afferents בודדת באמצעות תוכנת מיון ספייק. במבחנה הכנות לאפשר למחקרים מבוקרים היטב על afferents החושית ללא בלבול הפוטנציאלי של הרדמה או זלוף השריר שינה. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזהות ולבחון את התגובה של afferents כישור השריר למתוח. חשוב לציין,הכנה זו תומכת גם במחקר של סוגים אחרים של afferents שריר, מאפייני התגובה הבאים יישום סמים ושילוב של גישות חזקות גנטיות ומודלי מחלה בעכברים.

התגובה של afferents שריר ניתן להקליט הבא מגוון של הפרעות, תלוי באיזה מביא תת סוג נחקר. תגובות נציג של afferents כישור שריר להתכווצות שרירים ורמפה ולהחזיק מתיחה מוצגות כאן. מקבלות התכווצויות לזהות מביא כמביא ציר, תפרפרו פעם אחת בכל שנייה (0.5 רוחב פולס אלפיות שני) כדי לראות אם יש הפסקה בירי במהלך 18,19 התכווצות. איור 2 מראה עקבות נציג של פעילות עצבית ומתח שרירים במהלך התכווצויות עווית אלה. אין פעילות עצבית שנצפתה במהלך צירים עווית, כצפוי לafferents ציר. אם מביא נרשם היה מביא איבר גיד הקבוצה Ib Golgi, עלייה בירי שיעור במהלך ההתכווצות שניתן היה לצפות. בתנאי השליטה ביותר afferents עם דפוס קבוע ירי (~ 12 דחפים / sec ב24 ° C ו~ 32V דחפים / sec ב34 ° C) הם afferents כישור שריר. קבוצת משנה של afferents הציר יהיה רק באש במהלך המתיחה (בידיים שלנו ~ 11% מafferents הציר) 15. איור 3 א מציג עקבות גלם נציג של שתי afferents כישור השריר מגיבות לרמפה ולהחזיק מתיחה המיוצרת על ידי בקר הכוח ואורך. תכונת ספייק היסטוגרמה של LabChart משמשת לזיהוי ולנתח אותם בתדר הירי של שני נוירונים בודדים בנפרד (איורים 3 ב-C3). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 שריר מבודד הכנה) longus digitorum פושטי (EDL) וגיד הנשה innervating הם רכובים באמבטית רקמות מבודדת perfused עם נוזל החומץ סינטטי ביניים (SIF). מגבר תאי מחובר לsuctiעל האלקטרודה רושמת פעילות עצבית. כוח כפול ואורך בקר עם תוכנת בקרה ואמצעים מתאימות בכוח שריר ואורך. אלקטרודות האמבטיה הרקמות לספק גירויים כדי לייצר עווית או התכווצויות tetanic. שאיבת מים מחוממים בערוצי צלחת אמבטיה פנימיים שולטת בטמפרטורת האמבטיה רקמות. B) משך האלקטרודה יניקת זכוכית עם תיאור ~ 3 מ&quot;מ קצה מחודד. C) מוגדל של צורת הקצה האידיאלית עבור האלקטרודה היניקה כי הוא מיוצר באמצעות microforge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2 ציר מביא תגובה לעווית התכווצות. Activit עצביy (זכר עליון) ומתח שרירים (זכר תחתון) מ30 התכווצויות עווית הם על גבי עם עקבות חופפות העליונים בשחור. פעילות מביא עוצרת בעליית מתח מושרה התכווצות, אשר היא תגובה אופיינית לafferents כישור שריר. Bracket וחץ מעל העקבות העליונים מציינים את הזמן במהלך התכווצות כאשר הפעילות מושהה. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> איור 3 ציר מביא תגובה לרמפה והחזיקו למתוח) פעילות עצבית גלם של שתי afferents (זכר עליון) במהלך רמפה ולהחזיק מתיחה להחיל את אדי (אורך שריר מוצג בזכר תחתון). B) תדירות הזרקה מיידית (Inst. האב, דחפים לשנייה) של היחידה המציגה את הפעילות בo L מ( מוצגים בכחול). C) Instantaneתדירות היחידות הארגוניות ירי של היחידה קטנה יותר שרק שריפות במהלך המתיחה (המוצגת בכתום). שני היחידות להפגין הסתגלות תדירות ספייק במהלך מתיחה אופייני לafferents כישור שריר 1.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

<em&gt; במבחנה</emהכנת שרירים עצבים&gt; עכבר למבוגרים ללימוד מאפייני ירי afferents השריר

עצב סנסורי שרירים מעורב באיתות proprioceptor וגם לדווח על אירועים ממלכתיים ופציעה קשורה חילוף חומרים. אנו מתארים עכבר בוגר בהכנת שריר עצבים מבחנה ללימודים בafferents שרירים מופעל מתיחה.

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Studying the Integration of Adult-born Neurons

שילוב של לימוד למבוגרים, יליד נוירונים

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

<em&gt; חוץ גופייה</em&gt; הכנה של נוירונים enteric המבודדים וגליה ממקלעת Myenteric של העכבר הבוגר

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

במבחנה אפיון של המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של סיבי מביא שטיפת המעי הגס בחולדות

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

העכבר Hindbrain כמודל ללימוד נוירוג'נסיס עובריים

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

במבחנה שיטת לימוד הצבירה של חלבון טאו, והתרופות הקרנה

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

הכנת בקצב אחיד-פעיל חוץ גופית Neonatal מכרסמים גזע המוח-השדרה, פרוסה דק

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...