Name: an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents
Uploaded: 2014-09-24T13:00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

Lämpliga nationella och institutionella etik bör inhämtas innan du utför djurförsök. 1 Borttagning av EDL Muscle och Nerve <ol><li> Väg och djupt söva en vuxen mus med inhalerat isofluoran med användning av en förångare med 5% isofluoran plus en 1,5 l / min syreflöde eller en glaskupa med isofluoran indränkt bomull på botten. </li><li> Se till att musen är djupt sövd och inte svarar på en tå nypa. Snabbt halshugga använda stora, vässade saxar eller en giljotin. </li><li> Gör ett ventrala mittlinjen snitt genom revbenen med sax och ta bort de inre organen. </li><li> Hud djuret genom att ta tag i huden från nacken och dra den förbi fötterna. </li><li> Avlägsna benen genom skärning ovanför höfterna och placera de flådda ben i en skål med kall (4 ° C), carbogenated (95% O2, 5% CO2) låg kalcium, hög magnesiumbikarbonat saltlösning containing i mM: 128 NaCl, 1,9 KCl, 1,2 KH 2 PO 4, 26 NaHCOs 3, 0,85 CaCl2, 6,5 MgSO 4 och 10 glukos (pH på 7,4 ± 0,05) 16. Den låga kalcium hämmar hög magnesiumlösning synaptisk transmission under dissekering. </li><li> Placera benen ryggsidan upp i skålen och nåla benen och höfter ner med nålar eller insektsnålar så att knä och fotleder är i 90 ° vinkel. Placera ett stift på varje ände av fötterna och en tapp på var och en av de främre och bakre lår för att hålla vävnaden på plats. </li><li> Använda Castroviejo våren sax, lyft upp det översta lagret av muskler på låren och göra en mittlinje klippa att exponera ischiasnerven direkt under. Ischiasnerven ligger precis under den övre muskellagret och körs över lårbenet från dess utträde nära höfterna tills den grenar i den gemensamma peroneal och tibialnerven precis innan knäleden. </li><li> Ta muskeln ovanför ischiasnerven tills point där de djupa peroneusnerven filial dyk in i flexor hallucis longus (FHL) muskel syns. </li><li> Använda # 55 pincett, dissekera bindväv runt peroneal grenen för att befria det från gastrocnemius och soleus muskler, som är på den mediala delen av skenbenet. Skär senor i gastrocnemius och soleus muskler och ta försiktigt bort dem från under nerven. </li><li> Ta bort ytliga muskler på den laterala delen av skenbenet för att exponera tre olika senor buntar vid fotleden-från medial till lateral: FHL, EDL och tibialis anterior (TA), med EDL gömd under TA. </li><li> Skär TA senan på fotleden, lyft TA upp och bort från EDL och skär muskeln nära knät för att ta bort den. </li><li> Skär FHL senan vid ankeln och lyft tillbaka till det område där nerven kommer in i FHL. Klipp precis under den punkten och ta bort ~ 2/3 i FHL muskeln. </li><li> Skär ischiasnerven så nära höftleden som posligt och försiktigt skala bort alla nervgrenar utom den djupa peroneal grenen. </li><li> Skär EDL senor på både fotled och knäled använder stora våren sax. </li><li> Använda vass sax, ta bort EDL, resterande FHL och nerv från den omgivande vävnaden genom att skära genom skenbenets ben vid knä och halvvägs genom låret. Skär bort den återstående tibia benet så att bara EDL, en del av FHL och nerv kvar. </li></ol> 2 Montering av EDL Muscle och Nerve i Tissue Bath (Figur 1A) <ol><li> Innan starten av experimentet, förbereda vävnadsbadet. Ständigt BEGJUTA badet med syresatt (100% O2) syntetisk interstitialvätska (SIF) innehållande (i mM) 123 NaCl, 3,5 KCl, 0,7 MgSO 4, 1,7 NaH 2 PO 4, 2,0 CaCl2, 9,5 NAc 6 H 11 O ( natriumglukonat), 5,5 glukos, 7,5 sackaros och 10 N -2-hydroxyethylpiperazine- N &#39;-2-ethanesulfonic syra (HEPES); pH 7,4 ± 0,05 17. En flödeshastighet av 15-30 ml / min rekommenderas. Visas en kommersiellt tillgänglig bad på 25 ml kapacitet med två stimulerande elektroder fästa vid botten av badet, en monterad vävnads inlägg och ett fäste för en kraft och längd controller (ungefärlig bad mått 8,5 cm x 3 cm x 1 cm; för specifikationer se tabell för material / utrustning). </li><li> Använd den återstående FHL vävnad för att hantera den isolerade muskel-nerven och placera den i vävnadsbadet. Placera en liten bit av Sylgard på botten av skålen och använda ett insektsstift genom den återstående FHL vävnaden stabiliseras muskeln. </li><li> Använd 6-0 silkessuturer att knyta både senor och fäst ena änden till vävnaden stolpen och den andra till hävarmen på den kraft och längd controller (se tabell för material / Utrustning för specifikationer). Använd den minsta suturen längd som är praktiskt. Ta insekten stift och sylgard efter att du har bundna senorna. OBS: För att underlätta enkelförbindelse med hävarmen en liten bit av tråd kan böjas in i ett &quot;j&quot; formad krok och fixerades i hävarmen med epoxi. Suturen kan sedan knytas till viran istället för att gängas in i det lilla hålet på hävarmen. </li><li> Gör sug elektroder från SA 16 glas genom att först använda en glasmikropipett avdragare (Heat = 286, Pull = 0, Velocity = 150, Time = 200); bryta spetsen tillbaka och manuellt slipa den på en slipsten tills det handlar om en 3 mm kona. Smält spetsen med hjälp av en microforge till önskad spets innerdiameter mellan 10 - 100 nm beroende på vilket område av nerv man vill ta prov från (se diagram 1B-1C för elektrodschematiska och Tabell över Materials / Utrustning för produktinformation). </li><li> Fyll en premade glas sug elektrod till innersilvertråd med SIF. </li><li> Sugning den skurna änden av nerven i elektroden och ansluter till den positiva porten på en differentialförstärkare. Linda elektroden med en klorerad silvertråd som ansluter till den negativa porten på huvudsteg. Jorda SIF badet genom att köra en andra klorerad silvertråd från badet till huvudsteg: s markport. Också jorda perfusion slangen till Faradays bur på flera punkter för att minska elektriska störningar införs via perfusion pumparna. </li><li> Stimulera muskler via elektroderna som är monterade på vardera sidan av muskeln i vävnadsbadet för att framkalla en ryckning kontraktion. Alternativt placera en stimulerande elektrod på den avskurna ändan av nerven. Öka stimulerande spänning tills en topp kontraktionskraft observeras och sedan öka spänningen med ytterligare 15% för att nå supramaximal spänning (0,5 ms pulsbredd). Fortsätta de muskelsammandragningar vid supramaximal spänning, med en 10 sek vila i-mellan, men variera längden på muskeln tills en topp sammandragande kraft är uppnådd för att hitta den optimala längden (Lq) av muskeln. Alla längd ramper och vibrationer börjar med muskeln vid denna Length. </li><li> Låt muskelnerv förberedelse för att stanna kvar i badet i minst 1 timme före efterföljande insamlingen av uppgifter så att vävnaden att nå badtemperaturen och för normal synaptisk transmission för att återhämta sig efter dissektion i en låg kalciumlösning. </li><li> För att samla in data på ett annat sätt än rumstemperatur temperatur, placera en temperatursond i vävnaden bad nära muskeln. Sakta föra badet upp till temperaturen genom att pumpa uppvärmt vatten genom vävnaden badet basplatta. Wrap lera microwavable värmedynor runt SIF reservoaren för att upprätthålla en jämn temperatur. </li></ol> 3 Datainsamling <ol><li> För att identifiera en afferenta som en spindel afferenta, registrera nervaktivitet under upprepade rycka sammandragningar som produceras av en 0,5 msek supramaximal spänning stimulans levererat en per sekund. OBS: Muscle spindel afferenter bör stanna under rycka kontraktion 18,19 (figur 2). </li><li> Använd data förvärvs programvara för att tillämpa ändringar längd vid olika hastigheter och i olika längder. Använd ett eget skript för att automatisera denna uppgift (se kompletterande information om en skärmdump av manus och anvisningar om hur du anpassar sträckor ansvaret). Applicera ramp och håll sträckor av 4 sek vid stretch längder av 2,5%, 5% och 7,5% L o och stretch hastigheter på 20, 40, eller 60% L o / s 15. OBS: Se användarhandboken för specifik styrka och längd controller för erforderlig spänning-till-millimeters omräkningsfaktor. </li><li> Vid slutet av experimentet, bestämma muskelhälsa vid 24 ° C med hjälp av maximal isometrisk tetanic sammandragningar (500 msek tåg, 120 Hz tåg frekvens, 0,5 ms pulsbredd, supramaximal spänning). Jämför topp kontraktionskraft till tidigare rapporterade värden (~ 24 N / cm 2 9,20). </li></ol>

<ol>
	<li>Matthews, P. B. C., Brookes, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+1,+The+Nervous+System,+Motor+Control.">Section 1, The Nervous System, Motor Control.</a> Handbook of Physiology. , 189-228 (1981).</li><li>Houk, J., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Golgi+tendon+organs+to+forces+applied+to+muscle+tendon.">Responses of Golgi tendon organs to forces applied to muscle tendon.</a> J Neurophysiol. 30, 1466-1481 (1967).</li><li>Jankowski, M. P., Rau, K. K., Ekmann, K. M., Anderson, C. E., Koerber, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotyping+of+group+III+and+IV+muscle+afferents+in+mouse.">Comprehensive phenotyping of group III and IV muscle afferents in mouse.</a> J Neurophysiol. 109, 2374-2381 (2013).</li><li>Nichols, T. R., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-bridge+mechanisms+underlying+the+history-dependent+properties+of+muscle+spindles+and+stretch+reflexes.">Cross-bridge mechanisms underlying the history-dependent properties of muscle spindles and stretch reflexes.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82, 569-576 (2004).</li><li>Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociception+from+skeletal+muscle+in+relation+to+clinical+muscle+pain.">Nociception from skeletal muscle in relation to clinical muscle pain.</a> Pain. 54, 241-289 (1993).</li><li>Proske, U., Gandevia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proprioceptive+Senses:+Their+Roles+in+Signaling+Body+Shape,+Body+Position+and+Movement,+and+Muscle+Force.">The Proprioceptive Senses: Their Roles in Signaling Body Shape, Body Position and Movement, and Muscle Force.</a> Physiol Rev. 92, 1651-1697 (2012).</li><li>Close, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force:+velocity+properties+of+mouse+muscles.">Force: velocity properties of mouse muscles.</a> Nature. 206, 718-719 (1965).</li><li>McCully, K. K., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+to+skeletal+muscle+fibers+of+mice+following+lengthening+contractions.">Injury to skeletal muscle fibers of mice following lengthening contractions.</a> J Appl Physiol. 59, 119-126 (1985).</li><li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young,+adult+and+aged+mice.">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J Physiol. 404, 71-82 (1988).</li><li>Barclay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diffusive+O(2)+supply+to+isolated+preparations+of+mammalian+skeletal+and+cardiac+muscle.">Modelling diffusive O(2) supply to isolated preparations of mammalian skeletal and cardiac muscle.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 26 (2), 225-235 (2005).</li><li>Taguchi, T., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscular+thin-fiber+receptors+in+aged+rats+recorded+in+vitro.">Augmented mechanical response of muscular thin-fiber receptors in aged rats recorded in vitro.</a> European Journal of Pain. 15, 351-358 (2011).</li><li>Simon, A., Shenton, F., Hunter, I., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride-sensitive+channels+are+a+major+contributor+to+mechanotransduction+in+mammalian+muscle+spindles.">Amiloride-sensitive channels are a major contributor to mechanotransduction in mammalian muscle spindles.</a> J Physiol. 588, 171-185 (2010).</li><li>Wenk, H. N., McCleskey, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+skeletal+muscle-nerve+preparation+and+in+vitro+model+of+ischemia.">A novel mouse skeletal muscle-nerve preparation and in vitro model of ischemia.</a> J Neurosci Methods. 159, 244-251 (2007).</li><li>Bullinger, K. L., Nardelli, P., Wang, Q., Rich, M. M., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaliplatin+neurotoxicity+of+sensory+transduction+in+rat+proprioceptors.">Oxaliplatin neurotoxicity of sensory transduction in rat proprioceptors.</a> J Neurophysiol. 106, 704-709 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+muscle+spindle+afferents+in+the+adult+mouse+using+an+in+vitro+muscle-nerve+preparation.">Characterization of muscle spindle afferents in the adult mouse using an in vitro muscle-nerve preparation.</a> PLoS One. 7, e39140 (2012).</li><li>Shreckengost, J., Calvo, J., Quevedo, J., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicuculline-sensitive+primary+afferent+depolarization+remains+after+greatly+restricting+synaptic+transmission+in+the+mammalian+spinal+cord.">Bicuculline-sensitive primary afferent depolarization remains after greatly restricting synaptic transmission in the mammalian spinal cord.</a> J Neurosci. 30, 5283-5288 (2010).</li><li>Koltzenburg, M., Stucky, C. L., Lewin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptive+properties+of+mouse+sensory+neurons+innervating+hairy+skin.">Receptive properties of mouse sensory neurons innervating hairy skin.</a> J Neurophysiol. 78, 1841-1850 (1997).</li><li>Matthews, B. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+muscle.">Nerve endings in mammalian muscle.</a> J Physiol. 78, 1-53 (1933).</li><li>Hunt, C. C., Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+receptor+discharges+during+muscle+contraction.">Stretch receptor discharges during muscle contraction.</a> J Physiol. 113, 298-315 (1951).</li><li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myo-mechanical+analysis+of+isolated+skeletal+muscle.">Myo-mechanical analysis of isolated skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Hoheisel, U., Rein&#246;hl, J., Unger, T., Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+and+capsaicin+activate+mechanosensitive+group+IV+muscle+receptors+in+the+rat.">Acidic pH and capsaicin activate mechanosensitive group IV muscle receptors in the rat.</a> Pain. 110, 149-157 (2004).</li><li>Taguchi, T., Sato, J., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscle+thin-fiber+sensory+receptors+recorded+from+rat+muscle-nerve+preparations+in+vitro+after+eccentric+contraction.">Augmented mechanical response of muscle thin-fiber sensory receptors recorded from rat muscle-nerve preparations in vitro after eccentric contraction.</a> J Neurophysiol. 94, 2822-2831 (2005).</li><li>Xu, J., Gu, H., Brennan, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensitivity+of+group+III+and+group+IV+afferents+from+incised+muscle+in+vitro.">Increased sensitivity of group III and group IV afferents from incised muscle in vitro.</a> Pain. 151, 744-755 (2010).</li></ol>

The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

Målet med denna artikel var att beskriva en metod för inspelning från muskelspindel afferenter i en isolerad mus muskel-nerv beredning. Vi har funnit att spindel musen afferenter reagerar på samma sträcka som de från råttor, katter och människor 15, och andra laboratorier har använt möss som modellorganismer för att studera sensoriska neuroner i både muskler och huden in vitro (t.ex. 3,13) . Muskel sensoriska afferenter kan spelas in i minst 6-8 timmar vid både 24 ° C och 34 ° C. För att minimera hanteringen EDL och nerv, använda den återstående delen av FHL att hantera vävnad när det är möjligt. Efter dissektion, vänta minst 1 timme för att starta datainsamlingen för att låta vävnaden till jämvikt till badtemperatur och för normal synaptisk transmission att återhämta sig. Tidigare har muskelhälsa kontrolleras på en delmängd av muskler som används i denna beredning genom att bestämma att den maximala tetanic contractile kraft som genereras av musklerna är liknande den som rapporterats av andra vid början och slutet av experimentet 15. Muskelspindel afferenter identifierades funktionellt i denna beredning genom att leta efter en karakteristisk paus i bränning som svar på rycka kontraktion (figur 2) samt de förväntade momentana frekvensen ökar som svar på förändringar längd (Figur 3). Vår erfarenhet är att de flesta afferenter att brand inom kontrollvillkoren muskelspindel afferenter. Längden på nerven kvar i denna beredning (~ mm max 7) är inte tillräckligt lång för att använda afferenta ledningshastighet skillnader för att identifiera muskel afferenta subtyper 13. Dessutom, till skillnad från katter och människor, åtgärder för dynamisk känslighet inte kunde tydligt skilja Group Ia och II afferenter i möss (för vidare diskussion se Wilkinson et al. 15). Andra subtyper av afferenter (dvs.., Grupp III och IV) kan identifieras med hjälp av ytterligare funktionstester i denna beredning, till exempel genom att lägga till ämnen som capsaicin, ATP eller bradykinin, sjunkande bad pH, utsätta muskeln till ischemi, etc. 3,13,21-23 Använda sug elektroder gör att aktiviteten från flera sensoriska nervceller som ska spelas in på en gång, vilket ökar mängden data som kan samlas in från en enda muskel. Detta preparat kan användas för att mäta den totala effekten av en störning på sensoriska neuron befolknings svar eller svaren från identifierade afferenter. Om spik former är unikt nog, upp till 4 sensoriska neuroner kan diskrimineras av programvara (både Spike2 (Cambridge Electronic Design) och LabChart Pro (AD Instruments) har utförts på liknande sätt). I de fall där nervceller inte kan diskrimineras, kan förändringar i elektrodplacering eller spetsdiameter lätt implementeras. Sammanfattningsvis musen muskel-nerv in vitro preparation är en enkel experimentell metod som kan användas för att undersöka svarsegenskaper muskel sensoriska afferenta nerver till olika fysikalisk-kemiska störningar, skador och sjukdomsmodeller. Dessutom är denna beredning idealiskt lämpad för att dra fördel av de kraftfulla genetiska verktyg som finns i möss, inklusive transgena djur och optogenetic verktyg.

Skelett muskler innerveras av sensoriska nervceller som ger det centrala nervsystemet med viktig information om muskelmiljön. Muscle spindlar är högt specialiserade inkapslade strukturer sammansatta av intrafusal muskelfibrer som finns parallellt med extrafusal muskelfibrer. Spindlar är innerveras av koncern Ia och II afferenter som kodar förändringar i muskellängd och intrafusal fiberston dynamiskt regleras av innervating gamma motoriska nervceller 1. Grupp Ib afferenter är placerade mellan muskelfibrer och deras senor insättningar och är känsliga för förändringar i muskelkraft, till exempel vid muskelsammandragning 2. Koncernen Ia, Ib och II afferenter ger proprioceptiva återkoppling som stöd i lämplig motorstyrning. Ytterligare populationer av muskel afferenter ligger i hela muskeln (grupp III och IV) tjänar till att signalera metabolit uppbyggd, förekomsten av nociceptiva stimuli, och muskeltemperatur <sup&gt; 3. Denna muskel sensorisk information är avgörande för att upprätthålla homeostas, förebygga muskelskador och modulerande rörelse. Muskel afferenter kan förändra sina bränning mönster baserade på tidigare erfarenhet 4. Aktivering av nociceptorer kan leda till induktion av kroniska smärttillstånd 5 och avvikande signalering från muskel proprioceptorer kan leda till problem med balans eller rörelse 6. Vi använder en isolerad muskel-nerv in vitro förberedelse för att studera responsen av muskel sensoriska neuron receptor ändelser från vuxna möss av båda könen (visas är responser 2-4 månader gamla C57BL / 6 möss). Musen är modellen genetiska arter för studier i däggdjur. Denna beredning kräver isolering av den djupa peroneal grenen av ischiasnerven och extensor digitorum longus (EDL) muscle, en snabb ryckning muskeln i peroneal grupp funnen i den laterala delen av underbenet. EDL används ofta för att studera muskel sammandragande egenskaper 7-9, har tendons som är lätta att isolera och är tillräckligt liten för att ge tillräcklig diffusesyretillförsel i vila och med rimliga kontraktion driftcykler 10. Andra muskler i detta område (t.ex. soleus och tibialis anterior) är av liknande storlek och detta preparat kan lätt modifieras för att spela in från afferenter från dessa muskler. Ett sug elektrod placeras på den avskurna ändan av mage att spela muskel sensoriska afferenta bränning. Enskilda nervceller kan identifieras och analyseras utifrån deras spik form med spik sortering programvara. Stimulerande elektroder i badet eller på nerven kan användas för att framkalla muskelsammandragning. Muskel längd och kraft kan kontrolleras och mätas med hjälp av kommersiellt tillgängliga system. Liknande in vitro-preparat har använts i gnagare för att studera i grupp III och IV muskel afferenter i råtta EDL 11, Group Ia och II spindel afferenter på råtta fjärde lumbrical tå muskler 12 och grupp III och IV muskel afferenter i tHan mus plantar muskeln 13. Ett in vitro-system har fördelarna med farmakologisk tillgänglighet och direkt kontroll perfusat och fysiokemiska variabler såsom temperatur och pH. En in vitro-metod eliminerar potential in vivo confounds av anestesi och muskel perfusion status. Medan muskelnerv förberedelse möjliggör studier av direkt respons av en störning på afferenter, förmågan att studera gamma efferenta modulering av spindel känslighet och andra integrerade lösningar som är möjligt med in vivo 14 eller ex vivo 3 preparat offras som det finns inga nervcellkroppar i denna beredning. Detta preparat har tidigare använts för att karakterisera svaret av musen muskelspindel afferenter till ett batteri av ramp och håll sträckor och vibrationer, och det bestämdes att spindel mus afferenta responses liknade dem som rapporterats i andra arter såsom råttor, katter och människor. Mus spindel afferenta svar befanns vara liknande på både 24 ° C och 34 ° C badtemperaturer, men vid 34 ° C absolut bränning priser var snabbare och afferenter var mer kunna bemöta snabbare längdförändringar 15. Vi beskriver nedan hur detta preparat kan användas för att identifiera och studera de muskelspindel afferenter. Dessutom kan denna beredning lätt modifieras för att studera svaret av andra muskel afferenta subtyper 13, att jämföra egenskaperna hos sensoriska afferenter som svar på ett läkemedel eller sjukdomstillstånd eller diverse andra variabler (t.ex. ålder, kön, gen knockout).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Force and Length Controller &#38; Tissue Bath</td>
			<td>Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>300C-LR &#38; 809B-IV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &#38; Easy Load II Pump Head</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07523-80 &#38; EW-77200-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &#38; Headstage Amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 1800; 700000 &#38; 700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simulator</td>
			<td>Grass 
			OR 
			Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>S88 
			OR 
			701 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>892070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Fiberlite</td>
			<td>Model 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog to Digital Board</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition &#38; Analysis Software</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>LabChart Pro 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Glass</td>
			<td>Dagan</td>
			<td>SA16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-80/PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflourane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>18627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14014-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF 
			(Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

Muscle sensoriska nervceller som innerverar muskelspolar och Golgisenans organ koda förändringar som är väsentliga för proprioception längd och kraft. Ytterligare afferenta fibrer övervaka andra egenskaper hos muskelmiljön, bland metabolit uppbyggd, temperatur och nociceptiva stimuli. Sammantaget kan onormal aktivering av sensoriska neuroner leda till rörelserubbningar eller kroniska smärtsyndrom. Vi beskriver isoleringen av extensor digitorum longus (EDL) muskel och nerv för in vitro-studie av stretch-framkallade afferenta svar i den vuxna musen. Sensorisk aktivitet registreras från nerven med en sug elektrod och individuella afferenter kan analyseras med hjälp av spik sortering programvara. In vitro förberedelserna möjliggöra välkontrollerade studier på sensoriska afferenta nerver utan de potentiella blandar ihop narkos eller förändrad muskelblödning. Här beskriver vi ett protokoll för att identifiera och testa svaret av muskelspindel afferenter att sträcka. Viktigtdetta preparat stöder också studiet av andra undergrupper av muskel afferenter, svars egenskaper enligt läkemedelsansökan och införlivandet av kraftfulla genetiska metoder och sjukdomsmodeller i möss.

Svaret från muskel afferenter kan spelas in efter en mängd olika störningar, beroende på vilken afferenta subtyp studeras. Representativa svar muskelspindel afferenter till muskelsammandragning och ramp och håll stretch visas här. För att identifiera en afferenta som en spindel afferent, rycka sammandragningar ges en gång per sekund (0,5 ms pulsbredd) för att se om det finns en paus i bränning under kontraktion 18,19. Figur 2 visar ett representativt spår av neuronal aktivitet och muskelspänningar under Dessa rycka sammandragningar. Ingen neuronal aktivitet observeras under rycka sammandragningar, som förväntat för spindel afferenter. Om den inspelade afferenta var en grupp Ib Golgisenans organafferent, en ökad eldhastighet under kontraktion skulle förväntas. Under kontrollförhållanden flesta afferenter med en vanlig tändmönster (~ 12 impulser / s vid 24 ° C och ~ 32 impulser / sek vid 34 ° C) Är muskelspindel afferenter. En undergrupp av spindel afferenter kommer bara eld under stretch (i våra händer ~ 11% av spindel afferenter) 15. Figur 3A visar ett representativt rå spår av två muskelspindel afferenter svarar på en ramp och håll stretch som produceras av den kraft och längd controller. Den Spike Histogram funktion i LabChart används för att identifiera och analysera den momentana skottfrekvens av de två enskilda nervceller separat (figur 3B-3C). <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1 Isolerad Muskel Framställning A) extensor digitorum longus (EDL) och innerverar ischiasnerven är monterade i ett isolerat vävnadsbadet perfunderades med syrsatt syntetisk interstitialvätska (SIF). En extracellulär förstärkare ansluten till en magnet ppå elektroden registrerar neural aktivitet. En dubbel kraft och längd controller-med lämplig mjukvara-kontroller och åtgärder för muskelkraft och längd. De vävnads bad elektroder levererar stimuli för att producera rycka eller tetanic sammandragningar. Pumpning uppvärmt vatten genom interna bad plattkanaler styr vävnads badtemperaturen. B) Drog glas sug elektrod med ~ 3 mm avsmalnande spets. C) Förstorad återgivning av den perfekta spetsform för sug elektroden som produceras med hjälp av en microforge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">klicka här Vänligen för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2 Spindelafferent Svar på Twitch kontraktion. Neuronal Verksamhety (övre kurvan) och muskelspänningar (bottenspår) från 30 rycka sammandragningar lagras med topp lappande spår i svart. Afferenta aktivitet pausar under kontraktion-inducerade spänningsökning, vilket är en egenskap svar muskelspindel afferenter. Fäste och pilen ovanför den övre kurvan anger den tid under kontraktion när verksamheten är i pausläge. <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> Figur 3 Spindel Afferent Svar på Ramp och Hold Stretch A) Rå neural aktivitet av två afferenter (övre spår) under en ramp och håll stretch tillämpas på EDL (muskellängden visas i bottenspår). B) Momentan skottfrekvens (Inst. Fr., impulser per sekund) för enheten som uppvisar aktivitet vid L o från A (visas i blått). C) Instantaneligt avfyrningsfrekvens på mindre enhet som endast bränder under stretch (visas i orange). Båda enheterna uppvisar spetsen frekvensanpassning under stretch som är kännetecknande för muskelspindel afferenter 1.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Adult Mouse Muskel-nerv Förberedelse för Studera Förbränningsegenskaper för Muscle afferenter

Muscle sensoriska nervceller är inblandade i proprioceptor signalering och även rapportera om metabola statliga och skaderelaterade händelser. Vi beskriver en vuxen mus i muskel-nerv vitro förberedelse för studier på stretch-aktiverade muskel afferenter.

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Att studera integration av vuxna födda Neuroner

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Ett<em&gt; In-vitro</em&gt; Beredning av isolerade Enteriska neuroner och glia från plexus myentericus av vuxen mus

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion Plasticitet hos astrocytiska Receptorer genom manipulering av neuron priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Framställning av primära blandade Glial kulturer från vuxen mus ryggmärg

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En enkel steg Dissection protokoll för hel-mount Framställning av Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Framställning av horisontella skivor Adult mus Retina för elektrofysiologiska studier

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

In Vitro Karakterisering av elektrofysiologiska egenskaper Colonic afferenta fibrer i råttor

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

Mus bakhjärnan som modell för att studera embryonala neurogenes

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

In Vitro Analys för att studera sammanläggning av Tau-Protein- och drogkontroll

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Beredning av rytmiskt aktiva i Vitro Neonatal gnagare hjärnstammen-ryggmärgen och tunn skiva

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...