Name: strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis
Uploaded: 2015-02-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis at JoVE.com

Vi takker Rev. Dr. Ralph Bohlmann og Rev. Dr. James Voelz for at foreslå ordet &quot;Anastasis&quot; til at beskrive tilbageførsel af apoptose; Douglas R. Green for HeLa-celler, der stabilt udtrykker cytochrom c GFP; Charles M. Rudin og Eric E. Gardner til H446 celler; Heather Lamb om bistand i tegneserie tegning på videoen; Yee Hui Yeo for værdifuld diskussion af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af en Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (HLT), Fulbright tilskud 007-2009 (HLT), Life Science Research Foundation fællesskab (HLT), NIH giver NS037402 (JMH) og NS083373 (JMH) og University Grants udvalg af Hongkong AOE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang er en Shurl og Kay Curci Foundation Fellow af Life Sciences Research Foundation.

1. Fremstilling af celler til live Cell Imaging <ol><li> For at lette påvisning af morfologiske ændringer ved at vælge adhærente celler, såsom HeLa (human cervical carcinoma) celler, der er fladt på underlaget bedre at visualisere ændring af plasmamembranen og intracellulære organeller. Bemærk: Tilbageførsel af apoptose er blevet observeret i forskellige pattedyrceller 12,13, herunder primær muselever, primærbatterier musemakrofager, primære rottecardiomyocytter samt cellelinier, såsom ...

Anastasis refererer til det fænomen, hvor celler, der har aktiveret celledød vej senere vende dødsprocessen og overleve. Her har vi vist, at levende celler kan bruges til at bekræfte, at de samme individuelle celler i virkeligheden kan vende apoptotisk celledød proces på et sent tidspunkt, og derefter fortsætte overlevende og reproducere. Vores protokoller beskriver flere optimeret celletype-specifik behandling betingelser for at inducere apoptose og tillader en stor del af cellerne til at gennemgå tilbageførse...

Apoptose (græsk for &quot;at falde til døden&quot;) generelt antages at være en ensrettet proces ender i celle selvmord 1-7. Genetisk afbrydelse af pro-dødsgener resulterer i overlevelse ekstra celler, der ellers ville dø i hele dyr, herunder celler, der er allerede iværksat apoptose pathway 8,9. Tilsvarende genetiske manipulationer tillader sunde pattedyrceller, der kunstigt vise &quot;Eat Me&quot; signaler eller der mister klæbeevne til deres ekstracellulære matrix at undslippe døden ved hel celle fagocytose eller entosis henholdsvis 10,11. Men vi og andre har vist, at uden genmanipulation normale pattedyrceller sunde og cellelinier kan også komme fra de tidlige stadier af apoptose 12-15. Brug værktøjer til at spore individuelle celler, har vi yderligere demonstreret genrejsning sene stadier af apoptose 12,13, efter at cellerne er gået vigtige checkpoints at typiskely markere &quot;point of no return&quot; 2-6. Disse checkpoints for sent tidspunkt apoptose omfatte mitokondrie frigivelse af cytochrom c, aktivering af caspaser, nuklear fragmentering, og dannelse af apoptotiske legemer. Vi vedtog en græsk sammensatte ord &quot;Anastasis&quot;, som betyder &quot;stigende til liv&quot;, til at beskrive denne tilbageførsel af apoptose på randen af celledød 2-6. Medmindre hele døende inddrivelse proces overholdes af levende celler, er det en udfordring at adskille celler, der har undergået Anastasis fra celler, der aldrig har oplevet apoptotiske begivenheder. Årtiers arbejde har vist, at de morfologiske træk celle selvmord ved apoptose er drevet af evolutionært konserverede biokemiske og molekylære begivenheder 16-19. Disse begivenheder fremmer selvdestruktion af celler til at regulere udviklingsmæssige og homoeostatic processer i encellede og flercellede organismer ved at fjerne beskadiget eller dFARLIGT celler 16-19. Mens apoptotiske celler kan let skelnes ved standardiserede morfologiske, biokemiske og molekylære manifestationer af apoptose 1,5,6,16,20, i øjeblikket er der ingen kendt markør specifikke for Anastasis 12,13. Vigtigt er det, celler, der har undergået Anastasis synes at være normale, sunde celler og celler, der bare begynde at vende apoptose vises som apoptotic døende celler 12,13. Således er nye værktøjer er nødvendige for at konkludere med sikkerhed, at en given overlevende celle tidligere havde oplevet aktive apoptotiske processer. Apoptose antages generelt som en irreversibel kaskade, fordi det er en hurtig og massiv proces ødelæggelse. Mens det kan tage minutter til dage for nogle celler til at indlede apoptose, når mitochondrier har frigivet apoptogenic faktorer såsom cytochrom c i cytosolen 21,22 kan caspaser aktiveres inden for 5 minutter 23,24, efterfulgt af cytoplasmatiske ognuklear kondens inden for 10 min 25-27, og celledød kort derefter 25-27. Aktiverede caspaser iscenesætte apoptose ved at spalte og inaktivere vigtige strukturelle og funktionelle komponenter med henblik på cellulær nedrivning 2,28, såsom endonuklease inhibitor DFF45 / ICAD 29,30. Caspaser også aktivere pro-apoptotiske faktorer, såsom Bcl-2 familiemedlem BID, som translokerer for mitokondrier at fremme mitochondrial frigivelse af cytochrom c 31,32. Caspaseaktivitet resulterer også i celleoverfladen af phosphatidylserin som en &quot;spise mig&quot; signal til fremme engulfment af døende celler af makrofager eller nabo celler gennem fagocytose 33. Desuden apoptotiske begivenheder gør mitokondrier dysfunktionelle, forstyrre cellulære bioenergetik og stofskifte 34,35,36. Således synes intuitivt usandsynligt genrejsning destruktionen. I modsætning til den oprindelige forventetioner kan celler vende apoptotisk celledød proces selv på et sent tidspunkt. Ved løbende at overvåge skæbne døende celler i kultur, observerede vi reversibiliteten af sent stadium apoptose i en række primære celler og cellelinier 12,13. Fjernelse af død stimulus tilladt indvinding fra de åbenlyse funktioner i apoptose, såsom mitokondrie fragmentering, chromatinkondensering, DNA-skader, plasma membranblæredannelse, celleoverfladen af phosphatidylserin, frigivelse af mitokondrie cytochrom c, caspaseaktivering, nuklear fragmentering, celle svind, og dannelse af apoptotiske legemer. Disse observationer rejser ubesvarede spørgsmål om de funktioner, konsekvenser, og mekanismerne i Anastasis. For at løse disse spørgsmål, en forudsætning er at pålideligt identificere celler, der har undergået Anastasis. Her beskriver vi live mikroskopi metoder og en caspase biosensor til påvisning af celler, der tidligere har vendt sent apoptose og then overlevede.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="667">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">LSM780 confocal microscopy</td>
			<td style="width:139px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:127px;">/</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Glass bottom culture dish</td>
			<td style="width:139px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:127px;">P35G-0-14-C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Transparent CultFoi</td>
			<td style="width:139px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:127px;">000000-1116-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">CO2 independent medium</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">18045-088</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">CellTracker</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">C34552</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Mitotracker Red CMXRos</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">M-7512</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">H1399</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Fluorescently labeled annexin V</td>
			<td style="width:139px;">Biovision</td>
			<td style="width:127px;">K201</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis

Anastasis (græsk for &quot;stigende til liv&quot;) henviser til inddrivelse af døende celler. Før disse celler komme sig, har de passeret vigtige checkpoints af apoptose, herunder mitokondrie fragmentering, frigivelse af mitokondrie cytochrom c i cytosolen, aktivering af caspaser, chromatinkondensering, DNA-skader, nuklear fragmentering, plasma membranblæredannelse, celle krympning, celleoverfladeeksponering af phosphatidylserin og dannelse af apoptotiske legemer. Anastasis kan opstå, når apoptotiske stimuli fjernes før døden, hvorved døende celler at vende apoptose og potentielt andre død mekanismer. Derfor synes Anastasis at involvere fysiologiske helbredende processer, der også kan opretholde beskadigede celler uhensigtsmæssigt. De funktioner og mekanismer Anastasis er stadig uklart, hæmmes dels af de begrænsede værktøjer til påvisning af tidligere begivenheder efter inddrivelse af tilsyneladende raske celler. Strategier til at påvise Anastasis vil sætte undersøgelser af de fysiologiske mekanismer, faren ved udøde celler i sygdom patologi og potentielle lægemidler til at modulere Anastasis. Her beskriver vi effektive strategier via levende celler mikroskopi og en pattedyr caspase biosensor til identifikation og sporing Anastasis i pattedyrsceller.

For at undersøge tilbageførsel af apoptose, er vævskulturceller først udsat for en død stimulus til at udløse apoptose. Når cellerne vise kendetegnende for apoptose, er frisk dyrkningsmedium derefter anvendt til at vaske væk stimulus og derefter inkuberes de døende celler til at tillade genvinding (figur 1A). Her er det centrale spørgsmål, der behandles, er, hvor langt de enkelte dør dyrkede celler kan fremskridt i retning af apoptose og stadig undergår Anastasis. Dette spørgsmål kan ende...

Watch this Scientific Journal Video about Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis at JoVE.com

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Strategier for Tracking Anastasis en celle Survival fænomen, Vender Apoptose

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Studies of cellular apoptosis have been significantly impacted since the introduction of flow cytometry-based methods. Propidium iodide (PI) is widely ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Formulations for Freeze-drying of Bacteria and Their Influence on Cell Survival

Formuleringer til frysetørring af bakterier og deres indflydelse på Cell Survival

Cellular water can be removed to reversibly inactivate microorganisms to facilitate storage. One such method of removal is freeze-drying, which is ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimeret farvning og spredning modelleringsmetoder for celledeling Overvågning ved hjælp cellesporing Farvestoffer

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Cellesporing hjælp Photoconvertible proteiner under zebrafisk Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Tomat / GFP-FLP / FRT Metode til Live Imaging af Mosaic Voksen<em&gt; Drosophila</em&gt; fotoreceptorceller

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

En guide til Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting med fejlfinding Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Vurdering af selektiv mRNA Translation i pattedyrceller polysom ​​Profilering

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...