Name: preparation of a blood culture pellet for rapid bacterial identification and antibiotic susceptibility testing
Uploaded: 2014-10-15T14:00:00
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私たちは、実験室での技術を実装するために彼らの助けのためにローザンヌ大学病院センターの細菌学研究室の技術者に感謝します。

このプロトコルが開発され、日常的なツールとして実装される前に、当社の機関の研究開発プロセスや倫理的なルールに従う検証されています。 塩化アンモニウム赤血球溶解手順による血液培養細菌ペレットの調製<ol><li>その後の遠心分離のための血液培養陽性の調製。 <ol><li>血液培養キャップを滅菌する。ボトルのキャップ上に70％エタノールを追加し、それを燃や?...

<ol>
	<li>Alberti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+sepsis+and+infection+in+ICU+patients+from+an+international+multicentre+cohort+study.">Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study.</a> Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).</li><li>Angus, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+severe+sepsis+in+the+United+States:+analysis+of+incidence,+outcome,+and+associated+costs+of+care.">Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care.</a> Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).</li><li>Vincent, J. 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L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+treatment+of+bloodstream+infection:+laboratory+reporting+and+antimicrobial+management.">Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management.</a> J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).</li><li>Clerc, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+on+the+clinical+management+of+patients+with+Gram-negative+bacteremia+a+prospective+observational+study.">Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study.</a> Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).</li><li>Meex, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+identification+of+bacteria+from+BacT/ALERT+anaerobic+positive+blood+cultures+by+MALDI-TOF+MS+MALDI+Sepsityper+kit+versus+an+in-house+saponin+method+for+bacterial+extraction.">Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction.</a> Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).</li><li>Moussaoui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+identifies+90%+of+bacteria+directly+from+blood+culture+vials.">Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials.</a> Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).</li><li>Seng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ongoing+revolution+in+bacteriology+routine+identification+of+bacteria+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).</li><li>Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+bacteria+in+positive+blood+culture+broths+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry.">Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry.</a> J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).</li><li>Croxatto, A., Prod&amp;34hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology.">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+bacterial+identification+in+positive+blood+cultures+by+use+of+two+commercial+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+systems.">Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems.</a> J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).</li><li>Prod&amp;34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+for+direct+bacterial+identification+from+positive+blood+culture+pellets.">Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets.</a> J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).</li><li>Prod&amp;34hom, G., Durussel, C., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+blood-culture+bacterial+pellet+preparation+for+faster+accurate+direct+bacterial+identification+and+antibiotic+susceptibility+testing+with+the+VITEK+2+system.">A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system.</a> Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).</li><li>Clerc, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+and+PCR-based+rapid+diagnosis+of+Staphylococcus+aureus+bacteraemia.">Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia.</a> Clin Microbiol Infect. , (2013).</li><li>Martiny, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+rapid+microbial+identification+directly+from+positive+blood+cultures+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+on+patient+management.">Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management.</a> Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).</li><li>Stoneking, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Would+earlier+microbe+identification+alter+antibiotic+therapy+in+bacteremic+emergency+department+patients.">Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients.</a> The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).</li><li>Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+extended-spectrum-beta-lactamase-producing+Enterobacteriaceae.">Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).</li></ol>

従来の血液培養陽性診断アプローチと比較して、塩化アンモニウム溶解遠心分離法を用いて、細菌ペレットの迅速な取得が24時間と48時間と24によってASTを報告する時間（ 図1および 16による識別を報告するための時間を短縮3）。 適切な抗生物質治療の迅速な導入が血流感染に罹患している患者の転帰を改善するために極めて重要である。このよ?...

入院患者における血流感染および敗血症は、罹患率および死亡率の主な原因である。したがって、感染血流に関連した死亡率は、入院患者の37％に約14％で観察され、集中治療室に35％の患者1-3を増加させることができる。感染性病原体の迅速な同定は、最適な抗菌処理を案内すると、抗菌薬治療4,5の成功の結果を高めるために極めて重要である。陽性の血液培養からのグラム染色の迅速な分析がすでに抗菌療法6,7が、感染性因子の正確な同定の適応に重要な影響を持っている患者への最適な適応抗生物質治療を提供するために必要である。例えば、異なる抗生物質による治療レジメンは、グラム染色によって区別す​​ることが困難であり、腸球菌および連鎖球菌による菌血症以下に実装されなければならない。同様に、種での識別がLEVエルは、8ラクタムβに増加した抵抗性を付与する染色体がAmpC遺伝子をコードするグラム陰性腸内細菌を検出する必要がある。 血液培養陽性の場合、従来の診断アプローチは、生化学検査、異なる選択培地上での成長および自動化された微生物同定システムを含むさまざまなアプローチを有する追加のインキュベーションの前に識別の数時間を必要とする別の寒天プレート上の感染性病原体を、継代培養することである。従来の診断アプローチの結果までの時間は約1〜3日間である。 微生物の迅速な同定のためのマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF）技術の出現は、迅速に陽性の血液から直接、また、寒天プレート上で増殖させたコロニーから微生物しかしを識別するための新しいツールを提供している培養物（ 図1）9-12。のTh血液培養から感染性病原体を識別するために、MALDI-TOFのEの使用は、数分の代わりに伝統的な方法が必要とする時間と曜日に、結果までの時間を削減しました。 Croxatto ら 13で説明したように、MALDI-TOF同定の効率は、微生物の純度と量など、さまざまなパラメータに依存しています。これらの2つの基準が簡単に寒天プレート上で増殖させた個別のコロニーから得られたが、MALDI-TOF識別を妨害する可能性が複数の細胞およびタンパク質の成分を含んでいてそのような血液培養などの複雑なサンプルからの細菌の濃縮および精製のための分析前処理が必要である。 血液培養から各種微生物&#39;単離方法は、サポニンまたは細菌抽出9,14、血清分離方法10のための他の中性洗剤法を含む多くの研究が、溶解遠心分離方法12において使用されている</sアップ&gt;などsepsityperキットとして市販ソリューションを提供しています。当社の細菌学診断研究所は、MALDI-TOFによる細菌や酵母の迅速同定および自動識別システム（ 図2）15 を許可し 、塩化アンモニウム赤血球溶解に基づく簡単な血液培養細菌ペレット製剤を開発しました。この血液培養ペレット製剤はまた、グラム染色、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 （MRSA）の迅速な検出、およびと抗生物質感受性試験用のPOCT-PCRのような自動化されたPCRベースの診断テストのような他の直接下流のアプリケーションのためのサンプルを提供自動化されたASTシステムおよび/ ​​または寒天プレート上のディスク拡散アッセイ（ 図3）による。 Prod&#39;hom らが説明したように、本 ​​研究では、血液培養細菌ペレットを製造するための異なるステップを説明します。15（ 図4）。また、解除しますMALDI-TOF 15による同定、識別（ID）と、 腸内細菌やブドウ球菌および自動化されたPCR-のための自動化されたシステム16と抗生物質感受性試験（AST）：血液培養ペレット上で実行できる主なアプリケーションの3のためのプロトコルをスクライブMRSA 17の検出のためのベースの診断テスト。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1130">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">20 needle gauge&#160;</td>
			<td style="width:268px;">Terumo, Leuven, Belgium</td>
			<td style="width:239px;">NN-2038R</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">50 ml Falcon tube</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>352070</td>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ammonium chlorure</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>101145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Potassium hydrogen carbonate</td>
			<td>Fluka, St. Louis, MO, USA&#160;</td>
			<td>60340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&#160;</td>
			<td>F0507</td>
			<td>Flammable, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Fluka, St. Louis, MO, USA&#160;</td>
			<td>70990</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&#160;</td>
			<td>271004</td>
			<td>Flammable, acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&#160;</td>
			<td>T6508</td>
			<td>Corrosive, acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vitek 2 60 instrument</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>27202</td>
			<td>automated microbial system instrument</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vitek 2 Gram-positive (GP) card</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>21342</td>
			<td>automated GP&#160; identification card</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vitek 2 AST-P580 card</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>22233</td>
			<td>automated microbial AST system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vitek 2 Gram-negative (GN) card</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>21341</td>
			<td>automated GN&#160; identification card</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vitek 2 AST-N242 card</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>413391</td>
			<td>automated microbial AST system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Xpert MRSA</td>
			<td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA</td>
			<td>&#160;GXMRSA-100N-10</td>
			<td>nucleic acid amplification technology MRSA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">GeneXpert IV instrument</td>
			<td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA</td>
			<td>GXIV-4-D</td>
			<td>nucleic acid amplification technology instrument</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Microflex LT MALDI-TOF MS instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td>BDAL microflex LT/SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MSP 96 target&#160; steel BC</td>
			<td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td>280799</td>
			<td>MALDI target plate</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Densitometer Densicheck instrument</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>27208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MALDI Sepsityper kit 50</td>
			<td>Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td>8270170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Mac Conkey agar</td>
			<td>Biolife, Milano, Italy</td>
			<td>4016702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Mueller-Hinton agar</td>
			<td>Oxoid, Hampshire, England</td>
			<td>CM0337</td>
			<td>Mueller-Hinton agar (MH)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MHF agar</td>
			<td>Biom&#233;rieux, Marcy-l&#39;Etoile, France</td>
			<td>43901</td>
			<td>Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">BD columbia III agar</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>254071</td>
			<td>blood agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">BD chocolate agar</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>254089</td>
			<td>chocolate agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">BD schaedler agar</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>254084</td>
			<td>Schaedler agar</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a blood culture pellet for rapid bacterial identification and antibiotic susceptibility testing

血流感染および敗血症は、罹患率および死亡率の主な原因である。菌血症を患っている患者の成功した結果は、最適な抗生物質治療を導くために、感染因子の迅速な同定に依存する。陽性の血液培養からのグラム染色の解析が急速に行われ、すでに大幅に抗生物質投与計画に影響を与えることができます。しかし、感染因子の正確な同定は、依然として最適な標的治療を確立するために必要とされる。ここでは、ディスク拡散アッセイまたは自動ASTシステムによるMALDI-TOF MSによる同定、抗生物質感受性試験（AST）などのいくつかの本質的なダウンストリームアプリケーションのための試料とすることができる陽性の血液培養から簡単かつ迅速に細菌ペレット製剤を提示自動化されたPCRベースの診断試験による。血液培養、細菌のペレットに直接適用これらの異なる識別およびASTシステムの性能は非常にSiである通常、寒天プレート上で増殖させた単離されたコロニーから得られた性能にmilar。従来のアプローチと比較して、細菌ペレットの迅速な取得が有意に識別およびASTの両方を報告する時間が短縮される。したがって、血液培養陽性以下、MALDI-TOFによって同定はそれぞれ8〜18時間内、自動ASTシステムやディスク拡散アッセイによりASTの結果に対し、1時間未満以内に報告することができる。同様に、迅速なPCRに基づくアッセイの結果は、菌血症の報告後2時間未満で臨床医に伝えることができる。まとめると、これらの結果は、血液培養細菌ペレットの迅速な調製が同定およびASTのターンアラウンド時間に、従って、血流感染に罹患している患者の成功した結果に大きな影響を与えることを示している。

Prod&#39;hom ら 15による研究において、78人の患者から122血液培養陽性の塩化アンモニウム溶解遠心分離によって得られた細菌ペレットを、MALDI-TOF MSにより分析した。 122血液培養陽性のうち、95（77.9％）が正しく属レベルでの種レベル一つ（0.8％）で同定された。残りの26（21.3％）の血液培養ペレットMALDI-TOFによって信頼性の識別を与えなかった。このうち、21が13連鎖球菌と5コ?...

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Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

陽性の血液培養からの急速な細菌ペレット製剤は、MALDI-TOFによる識別、グラム染色、抗生物質感受性試験およびPCRに基づく試験のような用途のための試料とすることができる。結果は、急速に血流感染症に罹患している患者の転帰を改善するために臨床医に伝えることができる。

迅速な細菌同定および抗生物質感受性試験のための血液培養ペレットの調製

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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