Name: in vitro methylation assay to study protein arginine methylation
Uploaded: 2014-10-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation at JoVE.com

وأيد هذه الدراسة من قبل جائزة تقدير من وزارة الخارجية الامريكية للشؤون المحاربين القدامى، والمعاهد الوطنية للصحة منح R01CA138528 إلى RW.

1. إعداد التركيبات التعبير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في البروتوكول، PRMTs استنساخ في ناقلات التعبير الثدييات مع-N محطة حاتمة العلامة (MYC أو HA)، والركيزة في الإطار مع الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز (GST) للتعبير البروتين رفيع المستوى وتنقيتها من ?...

<ol>
	<li>Paik, W. K., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+methylase+I.+Purification+and+properties+of+the+enzyme.">Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme.</a> J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).</li><li>Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+immediate-early+TIS21+protein+and+the+leukemia-associated+BTG1+protein+interact+with+a+protein-arginine+N-methyltransferase.">The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase.</a> J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).</li><li>Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+NG,+NG,-dimethylarginine+in+nuclear+protein+fractions.">Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions.</a> Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).</li><li>Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+methylation+at+a+glance.">Arginine methylation at a glance.</a> J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).</li><li>Lee, Y. H., Stallcup, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+protein+arginine+methylation+of+nonhistone+proteins+in+transcriptional+regulation.">Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.</a> Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).</li><li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methylation+in+mammals:+who,+what,+and+why.">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Mol Cell. 33, 1-13 (2009).</li><li>Bikkavilli, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dishevelled3+is+a+novel+arginine+methyl+transferase+substrate.">Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate.</a> Scientific reports. 2, 805 (2012).</li><li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+methylation+of+G3BP1+in+response+to+Wnt3a+regulates+{beta}-catenin+mRNA.">Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA.</a> J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).</li><li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt3a-stimulated+LRP6+phosphorylation+is+dependent+upon+arginine+methylation+of+G3BP2.">Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2.</a> J Cell Sci. , (2012).</li><li>Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+arginine+methylation+in+transcription.">Biochemical analysis of arginine methylation in transcription.</a> Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).</li><li>Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+protein+methylation.">Techniques in protein methylation.</a> Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).</li><li>Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+applied+to+the+study+of+protein+arginine+methylation.">Methods applied to the study of protein arginine methylation.</a> Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).</li><li>Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+protein+arginine+methyltransferase+7+(PRMT7)+is+a+type+III+enzyme+forming+omega-NG-monomethylated+arginine+residues.">Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues.</a> J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).</li></ol>

يتم استخدام بروتوكول الموصوفة هنا بشكل روتيني لتحديد الوضع مثيلة من ركائز PRMT تحديدها. وهذا الاختبار قوي، ومتماسك تقدم أيضا دليل قاطع على خصوصية PRMTs لركائز بهم. المكونات الرئيسية لنجاح هذا الاختبار هي: 1. التعبير عن PRMTs في خلايا الثدييات، 2. آخر من PRMTs المنقى، 3. التعبير و...

وكان أول وصف مثيلة البروتين في عام 1968 1. لم يكن حتى استنساخ أول من PRMT1 في عام 1996، أن الباحثين بدأوا نقدر أهمية هذا التعديل بعد متعدية 2. ومن المثير للاهتمام، الميثيلي وحوالي 2٪ من بقايا أرجينين في البروتينات مقتطفات النووية 3، مما يدل على وفرة من هذا التعديل. أرجينين هو حمض أميني موجبة مع سلسلة الجانبية الأساسية والنيتروجين / س في غضون السلاسل الجانبية للأرجينين يمكن أن يكون بعد translationally تعديل عن طريق إضافة مجموعة الميثيل، وهي عملية تعرف باسم أرجينين مثيلة 4-6. يتم تحفيز أرجينين مثيلة من قبل فئة من الإنزيمات وهي، transferases البروتين الميثيل أرجينين (PRMTs). Arginines يمكن أن تكون إما monomethylated أو dimethylated وهذا الأخير يمكن أن يكون إما متماثل أو غير متماثل تبعا لنوع من PRMTs تحفيز عملية 4-6. البروتينات التي تعرض argininزخارف الإلكتروني جليكاين الغنية هي أهداف محتملة لبوساطة PRMT الحفز. وقد تبين بوساطة PRMT مثيلة من ركائز لتعديل التفاعل البروتين البروتين، البروتين النووي تفاعل حامض، وظيفة البروتين، والتعبير الجيني، و / أو الإشارات الخلوية، والتي تعتبر بالغة الأهمية لالتوازن الخلوي العادي 7-9. من أجل فهم الدور البيولوجي للبروتين أرجينين مثيلة، يطلب فحوصات دقيقة وفعالة، وقابلة للتكرار لإنشاء مركز مثيلة من ركائز PRMT تحديدها. في المختبر فحص الحامض، الذي يقيم قدرات PRMTs تنقيته لتحفيز مثيلة من ركائز بهم، هو فحص مقبولة تماما لدراسة مثيلة أرجينين 10-12. النجاح الشامل لهذا الاختبار يعتمد إلى حد كبير على نشاط PRMTs المنقى. ويمكن التعبير عن PRMTs وتنقيته من البكتيريا، أو خلايا الثدييات 10،11. هذا الفحص في المختبر مثيلة، ودetailed في قسم البروتوكول، وبناء على الطريقة الموصوفة في الأصل من قبل تيني وزملاؤه 10. في هذا البروتوكول، وتبين لنا بالتفصيل الخطوات المتبعة في التعبير وتنقية PRMT1 في خلايا الثدييات. تم تقييم قدرة PRMT1 تنقيته لتحفيز مثيلة على رأس GTPase تفعيل بروتين بروتين ملزمة 1 (G3BP1)، وPRMT الركيزة المعروف 8، في وقت لاحق وجود S-أدينوزيل-L- [ميثيل 3 H] ميثيونين باسم المانحة الميثيل. باستخدام هذا الاختبار، يمكننا تحديد موثوق قدرات PRMTs لرواية ميثيل أو ركائز معروفة، وهي الخطوة الأولى في دراسة البروتين أرجينين مثيلة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="673">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ecoscint ultra&#160;</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bottle top dispenser</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AutoFluor</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>LS-315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 ml Scintillation Vials</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>SKU:SVC-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GST-sepharose</td>
			<td style="width:136px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-Glutathione Reduced</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">G4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Lipofectamine</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Beas2B</td>
			<td style="width:136px;">ATCC</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Optimem</td>
			<td style="width:136px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">NP-40</td>
			<td style="width:136px;">US-Biologicals</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">SDS</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">PMSF</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">anti-HA affinity matrix</td>
			<td style="width:136px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Tris</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Nacl</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Bio-rad gel doc</td>
			<td style="width:136px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">anti-HA antibody</td>
			<td style="width:136px;">roche</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Ponseau S</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro methylation assay to study protein arginine methylation

بروتين أرجينين مثيلة هي واحدة من التعديلات بعد متعدية الأكثر وفرة في النواة. يمكن تحديد البروتين أرجينين مثيلة و / أو عبر تحديد النهج البروتين و / أو immunoblotting مع الأجسام المضادة المحددة ميثيل أرجينين. ومع ذلك، هذه التقنيات يمكن أن تكون أحيانا مضللة وغالبا ما تقدم نتائج إيجابية كاذبة. الأهم من ذلك، يمكن لهذه التقنيات لا توفر دليلا مباشرا في دعم خصوصية PRMT الركيزة. في المختبر فحوصات الحامض، من ناحية أخرى، هي فحوصات الكيمياء الحيوية المفيدة، التي تعتبر حساسة، وتكشف باستمرار إذا كانت البروتينات التي تم تحديدها هي في الواقع ركائز PRMT. يتضمن نموذجية في المختبر فحص الحامض المنقى، PRMTs النشطة، الركيزة المنقى والنظائر المشعة وصفت المانحة الميثيل (S-أدينوزيل-L- [ميثيل 3 H] ميثيونين). نحن هنا وصف بروتوكول خطوة بخطوة لعزل PRMT1 نشطة حفاز، أحد أفراد الأسرة PRMT أعرب بتواجد مطلق. وليتم اختبار الأنشطة ترانسفيراز thyl من PRMT1 تنقيته في وقت لاحق الراس GTPase تفعيل البروتين البروتين 1 (G3BP1) ملزمة، ركيزة PRMT معروف، في حضور S-أدينوزيل-L- [ميثيل 3 H] ميثيونين كما المانح الميثيل. يمكن استخدام هذا البروتوكول ليس فقط لإنشاء وضع ركائز جديدة مثيلة من PRMT1 الفسيولوجية، ولكن أيضا لفهم الآلية الأساسية من البروتين أرجينين مثيلة.

<html> تم تحديد قدرات HA-PRMT1 إلى ميثيل GST-G3BP1 من قبل في المختبر فحص الحامض. كان يعمل PRMT1 HA الموسومة تنقيته من الخلية لست] Beas2B في رد فعل مثيلة تحتوي GST-G3BP1، و1 μCi من S-أدينوزيل-L- [ميثيل 3 H] ميثيونين، باعتباره المانح الميثيل. PRMT1 يمكن أن تحفز بكفاءة مثيلة من GST-G3BP1 (الشك...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation at JoVE.com

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

بروتين أرجينين مثيلة، يحفزه فئة من الإنزيمات وهي، البروتين الميثيل أرجينين transferases (PRMTs)، هو عملية إضافة الأنزيمية من مجموعة الميثيل (ق) إلى arginines داخل البروتينات. في المختبر فحص الحامض هو الأداة الأكثر الاعتماد عليها لتقييم حالة مثيلة من ركائز PRMT معروفة أو جديدة.

في المختبر مثلأيشن الفحص لدراسة البروتين أرجينين مثلأيشن

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

تقرير من الحامض النووي من الجينات في مطبوع Arabidopsis السويداء

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

الفحص البروتين تراكب الأغشية : بروتوكول لاختبار التفاعل بين البروتينات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في المختبر</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

الحامض النووي : Bisulphite تعديل وتحليل

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

تطبيق على<em&gt; في المختبر</em&gt; الحمض النووي الفحص حماية لتصور الإجهاد خصائص الوساطة من البروتين DPS

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

البطانية أنبوب تشكيل خلية الفحص ل<em&gt; في المختبر</em&gt; دراسة الأوعية الدموية

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

المحسن انخفاض التمثيل بيسلفيت تسلسل لتقييم الحامض النووي في قرار قاعدة زوج

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...