Name: high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry
Uploaded: 2014-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי NIH 4R00HL094708-03, ענייני מחקר MCW ועדת ניו פקולטה פרס, וקרן קרן (קופות אתחול) במכללה הרפואית של ויסקונסין (RLG); מועצה למחקר מענקים של תכנית מחקר T13-706 / 11 (KRB) המבוסס על ערכת נושא הונג קונג; U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05,394, וAHA נוסד פרס חוקר (JCW); AHA דוקטורים המלגה 12POST12050254 (PWB). אנו מודים התקווה קמפבל בcytometry הזרימה Core של דם מכון המחקר של ויסקונסין לסיוע באיסוף הנתונים ובדיקה מעמיק של כתב היד.

.1 פתרון ומדיה הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מניות ציפוי מטריקס מוסמך hESC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט להפשיר hESC מטריצה ​​מוסמכת (5 מ&quot;ל) על קרח בשעה 4 ºC לילה. לוותר aliquots לתוך צינורות microcentrifuge מראש צונן, 1.5 מ&quot;ל סטר...

קריטי להצלחה של פרוטוקול הבידול הוא השימוש בתרבויות באיכות גבוהה של hPSCs כי כבר passaged ברמת התא הבודד לפחות חמישה קטעים שקדמו לתחילתו של בידול. יעילות בידול דומה נצפתה באופן שיגרתי בין קווי hPSC שונים אם הם מחוברות 100% בתחילת הבידול, עצמאיות של שורת תאים. היעילות הכי מוצלחת...

הדור של שריר לב מhPSCs, כולל hESC וhiPSC, יכול לתפקד כמודל במבחנה של תהליכים התפתחותיים לב אנושיים מאוד מוקדם, מתן תובנה שלבים לא אחרת נגישים למחקרים מכניסטית. מערכת מודל זה מספקת הזדמנויות ייחודיות ללמוד את המסלולים המולקולריים השולטים במחויבות שושלת לב ומפרט גורל תא. בשנים האחרונות, היכולת לייצר תאי cardiomyogenic ביעילות מhPSCs השתפרה 1-15 מאוד. עם זאת, בין פרוטוקולים יש וריאציה שורת תאים ביחס ליעילות ביצירת תאי cardiomyogenic ועיתוי שבו התאים להביע סמני תא ספציפי (לדוגמא, חדר ופרוזדורים). באופן אידיאלי, ליישומים עתידיים של מערכת מודל זה, אוכלוסיות הומוגניות יותר של תאים מוגדרים מבחינה תפקודית הן רצויים. בניגוד לשיטות קודמות, פרוטוקול בידול cardiomyocyte מתואר כאן אינו דורש ceצבירת ll או התוספת של חלבון Activin או עצם המוךפו&quot;גנטי 4 (BMP4) ובאופן עמיד יוצרת תרבויות חיוביות מאוד עבור TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v, וMLC2a ביום 10 תאים על פני כל קווי hESC וhiPSC נוסו עד היום. האסטרטגיה היא פשוטה מבחינה טכנית ליישום, במיוחד בהשוואה לתרבויות תלת ממדים, תרבות המונים, או אסטרטגיות המבוססות גוף embryoid 4-9, והוגדרה לאחרונה במחקר שמתאר מולקולה קטנה עם רעילות סלקטיבית לhPSCs (Boheler et al. ) 65. תכונות של פרוטוקול זה כוללים בידול של hPSCs בתרבות monolayer באמצעות שכבה יחידה של מטריצה ​​מוסמכת hESC (Matrigel), תקשורת מוגדרת באופן מלא באמצעות מולקולות קטנות לווסת איתות של Wnt (דומה, אך שונה מ1,2,7,13), ו זרימה מותאמת cytometry שיטות צביעה להערכת יעילות בידול וזהות תא. לסיכום, יתרונות של פרוטוקול זה בהשוואה לדוחות קודמים כוללים עלות effectiveness, שחזור, ויעילותו הגבוהה ליצירת שריר לב בקרב שורות hPSC מרובות, כולל קווי hESC וhiPSC. Cytometry זרימה הוא כלי אנליטי רב עוצמה להערכת האיכות של תאים בתרבית וקביעת ההומוגניות תת אוכלוסיות, ועם עיצוב ניסיוני נכון, יכול לספק מדידות כמותיות. כמו בכל האסטרטגיות המבוסס על הנוגדן, פרשנות מדויקת של תוצאות ניסויים דורשת כי אלמנטים של עיצוב assay כוללים ריכוז נוגדנים וקיבעון ותנאי permeabilization (כאשר מיקוד אנטיגנים תאיים) נבדקים בקפידה עבור כל נוגדן כתנאים תת אופטימליים להשפיע על יעילות של נוגדן באופן משמעותי מחייב, ולכן, פרשנות של תוצאות. חשוב לציין, אם נדרש לכמת, נוגדנים חד שבטיים הם חיוניים, כמו נוגדנים polyclonal יכולים לזהות אפיטופים רבים ונוטים לוריאציה אצווה ל-אצווה. נכון לעכשיו, מגוון רחב של נוגדנים (פופרוטוקולי lyclonal וחד שבטיים) והצביעה תוארו להערכת בידול במבחנה, ולכן קשה להשוות את היעילות של cardiomyogenesis בין פרוטוקולי 1,2,9,11. מסיבה זו, נוגדנים חד שבטיים משמשים בעת זמינה עבור כל cytometry זרימת מנתח. במבט קדימה, הוא צפוי סטנדרטיזציה של פרוטוקולים מכתים אלה, במיוחד בכל הקשור לכימות, צריכים טוב יותר לאפשר השוואה בין אסטרטגיות בידול. הבחירה של סמנים, והנוגדנים המקבילים שלהם, המשמש להערכת טוהר במבחנה cardiomyogenesis משתנים בין דיווחים. TNNT2 כבר נחשב מחוון של תאים מחויבים לגורל cardiomyogenic ומשמש באופן שגרתי כדי להעריך את היעילות של פרוטוקולי בידול לב. עם זאת, TNNT2 בא לידי ביטוי גם בשרירי שלד במהלך התפתחות אפרוח ועכברוש המוקדמת 16,17 והוא נמצא בשריר חלק אנושי 18 </sup&gt;. לפיכך, TNNT2 אינו בהכרח סמן ספציפי של cardiomyogenesis האנושי במבחנה. MLC2v וMLC2a משמשים באופן שגרתי כסמנים פונדקאיות של תת חדרית ופרוזדורים, בהתאמה. עם זאת, אתגרים עם הסתמכות על MLC2v וMLC2a כדי לקבוע תת סוג cardiomyocyte בהקשר של בידול במבחנה נובעים מהעובדה שמוצרי גן אלה לא יכולים להיות מוגבלים לחדר ספציפי בכל התפתחות של הלב, מצינור לב דרך מבוגר. במכרסמי כרך לב, MLC2a mRNA הוא השולט בפרוזדורים / האזור בדרכי יבוא וMLC2v mRNA הוא השולט באזורי מערכת חדרית / יצוא. בלב הכרך, שיתוף ביטוי של MLC2a וMLC2v mRNAs הם נצפו במערכת יבוא, תעלה בין עליות וחדרים, ומערכת יצוא 19,20. על ידי 3 ימים לאחר לידה, MLC2v mRNA מוגבל לחדר ועל ידי 10 ימים לאחר לידה, MLC2a מוגבל לפרוזדורים בלב החולדה בילוד 19. לכן, פרשנותנתונים על יעילות cardiomyogenesis וזהות תת סוג חייבת לא רק לקחת בחשבון את הנוכחות והכמות של רמות סמן התייחסות, אך יש לקחת בחשבון את השלב ההתפתחותי (ים) שנקודתי הזמן של בידול שמנותחים מתאימות. זה חשוב במיוחד בהתחשב בכך שהשלב ההבשלה של תאי cardiomyogenic שנוצרו על ידי במבחנה בידול של hPSCs הדומה ביותר אלה של התפתחות העובר / עוברית 21-25. לפיכך, בהסתמך על הביטוי המרחבי של סמן בלב לאחר הלידה לא יכול להיות מתאים להערכת נגזרים תאי hPSC, לפחות בחלק מהמקרים. במאמץ להקל על הפיתוח של קריטריונים ספציפיים יותר להגדרת זהות cardiomyocyte במבחנה, TNNI3 נחשב סמן חשוב להערכת cardiomyogenesis במבחנה כפי שהוא מוגבל לשריר לב בכל עובר בחומוס ודג הזברה 15,20והוא נעדר בשרירי שלד של העובר אנושי 26. בעוד TNNI1 נמצא בלבו של העובר אנושי, TNNI3 הוא הווה איזופורם TNNI רק בלב מבוגר נורמלי 27,28. לגבי זהות תת סוג cardiomyocyte, IRX4 29-31 הוא סמן אינפורמטיבי של תאים עם גורל חדרית. ברמת החלבון, IRX4 לאחרונה הוכח להיות מוגבל לחדר מצינור לב ליניארי דרך שלבים בילוד בעכבר 32. בהתאם לכך, פרוטוקולי צביעה מותאמות לניתוח TNNI3 וIRX4 ידי cytometry זרימה מתוארים. למיטב ידיעתנו, זה הוא התיאור הראשון של שיטה לצביעה יעילה המבוסס על נוגדן וניתוח של רמות IRX4 בשריר לב אנושי על ידי cytometry זרימה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="922">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Name of Reagent / Equipment</td>
			<td style="width:152px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:231px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Cell Culture</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Matrigel, hESC-qualified matrix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Accutase cell detachment solution</td>
			<td style="width:152px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:111px;">7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:431px;">Dubelcco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered)</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">53817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Citric acid</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C2404-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sodium selenite</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">S5261-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transferrin (Optiferrin &#8211; Defined, Animal-free, Recombinant Human)</td>
			<td style="width:152px;">Invitria</td>
			<td style="width:111px;">777TRF029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">4144-TC-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Transforming growth factor beta 1 (TGF&#946;1)</td>
			<td style="width:152px;">Peprotech</td>
			<td style="width:111px;">100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">CHIR-99021 HCl</td>
			<td style="width:152px;">Sellekchem</td>
			<td style="width:111px;">S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">IWR-1</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">I0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement Minus Insulin</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">B-27 Supplement (with Insulin)</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Flow cytometry reagents</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td style="width:152px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:111px;">119-069-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:431px;">Hank&#39;s balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Cytofix</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">BD Phosflow perm buffer III</td>
			<td style="width:152px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">558050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">179957-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Acetone</td>
			<td style="width:152px;">Mallenckrodt Chemicals&#160;</td>
			<td style="width:111px;">2440-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:152px;">Amresco</td>
			<td style="width:111px;">M236-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Goat serum</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Materials</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (without cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352008</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 &#181;M cell strainer snap cap)</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">352235</td>
			<td>for preparation of cells for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">2 ml rubber bulbs</td>
			<td style="width:152px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:111px;">03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">9&#34; borosilicate unplugged glass Pasteur pipets</td>
			<td style="width:152px;">BioExpress</td>
			<td style="width:111px;">P-2904-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3259-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red</td>
			<td style="width:152px;">GeneMate</td>
			<td style="width:111px;">C-3260-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Counting slides for TC20</td>
			<td style="width:152px;">BioRad</td>
			<td style="width:111px;">145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">6 well flat bottom tissue-culture treated plate</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">20 mL syringes</td>
			<td style="width:152px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:111px;">300613</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Sterile syringe filters, 0.2 &#181;m polyethersulfone</td>
			<td style="width:152px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">28145-501</td>
			<td>For filter sterilization of aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">250 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431096</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">500 mL filter system, 0.22 &#181;m polyethersulfone, sterilizing, low binding&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">431097</td>
			<td>For filter sterilization of bulk media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">Antibodies and Isotype Controls</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7))</td>
			<td style="width:152px;">Abcam</td>
			<td>ab19615</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-TNNT2 (clone: 1C11)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-16687</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>310111</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB131661</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anti-IRX4&#160;&#160;</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>BS-9464R</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21121</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21241</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:152px;">Life Technologies</td>
			<td>A21141</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:152px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:111px;">F0110</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557273</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mouse IgG2a</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-4724-81</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rabbit IgG-PE</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC105P</td>
			<td>Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:431px;">TaqMan Probesets for qRT-PCR</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ACTB</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01060665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Brachyury T</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00610080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">CASQ2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00154286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IRX4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01100809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">ISL1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00158126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MESP1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01001283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYH11 (SMMHC)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00224610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:431px;">MYH6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01101425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL2 (MLC2v)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00166405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYL7 (MLC2a)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01085598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MYOG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01072232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NKX2.5</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00231763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NPPA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs01081097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">POU5F1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SOX17</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00751752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00913333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00268536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNI3</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HS00165957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TNNT2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Hs00165960</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry

יש צורך דחוף לפתח גישות לתיקון הלב הפגוע, שגילו תרופות טיפוליות חדשות שאין להם השפעות רעילות על הלב, ושיפור אסטרטגיות לדגמן מחלות לב באופן מדויק. הפוטנציאל של ניצול טכנולוגיה אנושית מושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) כדי ליצור שריר לב &quot;בצלחת&quot; עבור יישומים אלה ממשיך לייצר גבוהה התלהבות. בשנים האחרונות, את היכולת ליצור ביעילות תאי cardiomyogenic מתאי גזע pluripotent האנושיים (hPSCs) השתפרה מאוד, מציעה לנו הזדמנויות חדשות למודל של פיתוח לב אנושי שלבים מוקדמים מאוד לא אחרת נגישות. בניגוד לרבים שיטות קודמות, פרוטוקול בידול cardiomyocyte מתואר כאן אינו דורש צבירת תא או תוספת של Activin או BMP4 וחסונה מייצר תרביות של תאים שהם חיוביים מאוד לטרופונין לבי וT (TNNI3, TNNT2), iroquois- חלבון homeodomain הכיתהIRX-4 (IRX4), שרשרת אור הרגולציה שרירן 2, איזופורם חדרית / שריר לב (MLC2v) ושרשרת אור הרגולציה שרירן 2, איזופורם פרוזדורים (MLC2a) ביום 10 בכל תא הגזע העוברי האנושי (hESC) וקווי hiPSC נבדק כדי תאריך. ניתן passaged תאים ונשמרו במשך יותר מ 90 ימים בתרבות. האסטרטגיה היא פשוטה מבחינה טכנית ליישום וחסכוני. אפיון של שריר לב שמקורם בתאי pluripotent לעתים קרובות כולל ניתוח של סמני התייחסות, הן בmRNA ורמת חלבון. לניתוח חלבונים, cytometry זרימה הוא כלי אנליטי רב עוצמה להערכת איכות של תאים בתרבית וקביעת ההומוגניות תת אוכלוסיות. עם זאת, וריאציה טכנית בהכנת מדגם יכולה באופן משמעותי להשפיע על איכות של cytometry זרימת הנתונים. לפיכך, סטנדרטיזציה של פרוטוקולים מכתים צריכה לאפשר השוואה בין אסטרטגיות בידול שונות. בהתאם לכך, מותאם פרוטוקולי צביעה לניתוח IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, וTNNT2 על ידי cytometry זרימה מתוארים.

ביום 0, תאים ומחוברות% 100 עם מורפולוגיה קומפקטית ופסולת תא מינימאלית. בימים 1-2, זה מקובל לצפות מוות של תאים משמעותיים (40-50%), אבל תאים מצורפים ישמרו מורפולוגיה קומפקטית (איור 1 א). במהלך תקופה זו, תקשורת היא כתומה ועכורה. תקשורת פינק מציינת מוות של תאים מופרזים, וב?...

Watch this Scientific Journal Video about High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry at JoVE.com

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

המאמר מתאר את המתודולוגיה מפורטת להבחין ביעילות תאי גזע pluripotent אנושיים לשריר לב על ידי באופן סלקטיבי ויסות מסלול Wnt, ואחרי ניתוח cytometry זרימה של סמני התייחסות להעריך הומוגניות וזהותה של האוכלוסייה.

בידול יעילות גבוה של תאי גזע pluripotent האדם לשריר לב ואפיון על ידי cytometry הזרימה

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfecting וNucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

מדידת תפוקה גבוהה Dictyostelium discoideum Macropinocytosis על ידי Cytometry זרימה

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

מדידת מיסת מיטוכונדריאלי ופוטנציאל ממברנה בתאי גזע ותאי T-תאים על ידי זרימה Cy,

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

אפיון חלבון טרנס-ממברנה חוץ-תאי יחיד על-ידי ציטומטריה של זרימה ננו

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...