Name: the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures
Uploaded: 2014-10-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af universitetet i Basel, Institut for Biomedicin, og den schweiziske National Science Foundation (31003A_141007). Markus Saxer ydet teknisk støtte.

Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med De Europæiske Fællesskabers direktiv af 22. september 2010 (2010/63 / EU) og blev revideret og godkendt af de schweiziske myndigheder. 1. Opsætning Organotypiske Entorhino-hippocampus skivekulturer <ol><li> Forbered entorhino-hippocampus organotypiske skive kulturer (EHOSCs) fra postnatal dag 4 (P4) museunger ved hjælp af den statiske inkubation metode 4,11. Her, brug C57BL6 og CB6F1 mus. <ol><li> Tage cirka 30 minutter pr mus ...

<ol>
	<li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection:+navigating+past+failure+to+future+success.">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li><li>Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke.+Part+two:+modeling+cerebral+ischemia.">Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia.</a> Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).</li><li>Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhino-dentate+projections+in+organotypic+slice+cultures:+mode+of+axonal+regrowth+and+effects+of+growth+factors.">Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors.</a> Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).</li><li>Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhinal+fibers+in+mouse+slice+cultures+is+age+dependent+and+can+be+stimulated+by+NT-4,+GDNF,+and+modulators+of+G-proteins+and+protein+kinase.">Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase.</a> C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model.">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).</li><li>Rytter, A., Cronberg, T., Aszt&#233;ly, F., Nemali, S., Wieloch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+hippocampal+organotypic+tissue+cultures+exposed+to+in+vitro+&#8216;ischemia&#8217;+show+selective+and+delayed+CA1+damage+that+is+aggravated+by+glucose.">Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro &#8216;ischemia&#8217; show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).</li><li>Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+modulates+density+of+blood+vessels+and+preserves+tight+junctions+in+organotypic+cortical+cultures+of+mice:+a+new+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier.">Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier.</a> J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).</li><li>Camenzind, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+transendothelial+glucose+transporter+1+and+P-glycoprotein+transporters+in+a+cortical+slice+culture+model+of+the+blood-brain+barrier.">Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier.</a> Neuroscience. 170, 361-371 (2010).</li><li>De Jong, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+hypoperfusion+yields+capillary+damage+in+the+hippocampal+CA1+area+that+correlates+with+spatial+memory+impairment.">Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment.</a> Neuroscience. 91, 203-210 (1999).</li><li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia.">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li><li>Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subfield-specific+neurovascular+remodeling+in+the+entorhino-hippocampal-organotypic+slice+culture+as+a+response+to+oxygen-glucose+deprivation+and+excitotoxic+cell+death.">Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li></ol>

Med de metoder, der præsenteres her, hippocampus organotypiske skive kulturer anvendes som et alsidigt værktøj til at studere ændringer plast i nervevæv efter skade. Mens organotypiske skive kulturer er blevet anvendt i fortiden for at studere neuronale reaktioner efter iskæmi 6, 7, nyt aspekt af den samtidige undersøgelse af vaskulære ændringer forbedrer de potentielle anvendelser af denne metode. Induktionen af ​​OGD eller hypoksi alene kan anvendes ved forholdsvis simple midler i organotypiske...

Det centrale nervesystem er særlig følsomt over for et tab eller reduktion af ilt og glukose levering fra karrene. Selv en forholdsvis kort afbrydelse af blodforsyning til hjernen kan inducere et permanent tab af funktion af de relevante områder i hjernen, der fører til de typiske slagtilfælde syndromer. Ud over den neuronale tab i de primære berørte områder, der typisk er yderligere forsinket neuronal tab gennem sekundær skade. Desværre indtil nu, ingen neurobeskyttende behandling til reduktion af sekundær neuronal død var tilgængelig 1. Forskningsindsatsen for at studere de mekanismer for sekundær skade stole på brugen af dyremodeller for cerebral iskæmi som mellem-cerebral arterieokklusion og forskellige trombotiske okklusion teknikker (for en nylig se 2). Parallelt hermed på grund af begrænsninger og etiske betænkeligheder ved brug af dyremodeller, organotypisk skive kultur af flere forskellige CNS væv også have været brugt som tillader study af neuronale reaktioner på forskellige typer af skader 3-5. For at studere den neuronale reaktion under betingelser, der efterligner iskæmisk hjerneskade, har modelsystemet af ilt glucosemangel (OGD) blevet udviklet. I denne model er skivekulturer midlertidigt udsat for et medium, der mangler glukose og er blevet ækvilibreret med nitrogengas i fravær af oxygen. Med en sådan behandling, er det muligt at inducere neuronal skade og tab, som er temmelig svarer til den observeret efter iskæmisk skade in vivo 6, 7. I hippocampus sådan behandling inducerer neurontab specifikt i CA1, men ikke i CA3-området eller gyrus dentatus i hippocampus. I modsætning hertil, undersøgelse af vaskulære reaktioner i skivekulturer hidtil ikke blevet bredt iværksat. En oplagt årsag er den manglende cirkulation og blodkar perfusion i skive kultur modellen. Men vi har tidligere vist, at det er muligt at opretholde bLood fartøjer i CNS skivekulturer i flere dage 8, 9. Det overordnede mål med denne metode er at ikke blot overvåge skæbnen af ​​neuroner efter OGD men udvide undersøgelsen til skæbne og ombygning af karrene, som er en vigtig del af den skade respons. Indtil nu sådanne undersøgelser har krævet brugen af dyreforsøg (De Jong et al, 1999;. Cavaglia m.fl., 2001.). I protokollen fremlagt her, vil vi beskrive, hvordan sådanne undersøgelser kan udføres i entorhino-hippocampus organotypiske skive kulturer udfordret, enten med hypoxi eller excitotoksiske læsioner efterfulgt af analyse af både neuronal overlevelse og blodkar reaktioner. Denne protokol er baseret på en tidligere offentliggjort undersøgelse om dette emne 10 og kan være nyttige for alle laboratorier interesseret i neurovaskulære interaktioner i centralnervesystemet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11012-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>stabilized form of L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millicell cell culture inserts</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Basal medium Eagle&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Horse serum</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anaerobic strips</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">59886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AMPA</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td>0169-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CNQX</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">0190/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TTX</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">1078/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">polyclonal anti-laminin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9393&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-MAP2</td>
			<td style="width:71px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab11267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti mouse 350</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti mouse 488</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti rabbit 350</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti rabbit 488</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Statistics software</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:119px;">GraphPad Prism</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hypoxia chamber</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td style="width:119px;">MIC-101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures

Iskæmisk hjerneskade er blandt de mest almindelige og ødelæggende betingelser, som forringer korrekt hjernens funktion og ofte fører til vedvarende funktionelle mangler i de berørte patienter. Trods intensiv forskning, er der stadig ingen effektiv behandling til rådighed, der reducerer neuronal skade og beskytter neuroner i iskæmiske områder fra forsinket sekundær død. Forskning på dette område involverer typisk brugen af ​​kunstfærdige og problematiske dyremodeller. Entorhino-hippocampus organotypisk skivekulturer udfordret med ilt og glukose afsavn (OGD) er etableret in vitro modeller, der efterligner cerebral iskæmi. Det hidtil ukendte aspekt ved denne undersøgelse er, at ændringer i hjernens blodkar undersøgt i tillæg til neuronale ændringer og omsætning af både neuronale rum og det vaskulære rum kan sammenlignes og korreleret. De metoder, der præsenteres i denne protokol væsentligt udvide de potentielle anvendelser af ellerganotypic skive kultur tilgang. Induktionen af ​​OGD eller hypoksi alene kan anvendes ved forholdsvis simple midler i organotypiske skive kulturer og fører til en pålidelig og reproducerbar skader i nervevæv. Dette er i skarp kontrast til de komplicerede og problematiske dyreforsøg inducerer slagtilfælde og iskæmi in vivo. Ved at udvide analysen til også at omfatte undersøgelse af reaktionen af ​​karrene kunne give nye måder om, hvordan at bevare og genoprette hjernens funktioner. Den skive kultur strategi, der fremlægges her, kan udvikle sig til et attraktivt og vigtigt redskab for studiet af iskæmisk hjerneskade og kan være nyttig til at teste potentielle terapeutiske foranstaltninger med henblik på neuroprotektion.

Ilt glucosemangel og hypoxi fremkalde neuronal død og reduktion blodkar specifikt i hippocampus CA1 regionen. OGD eller oxygen-berøvelse alene i 15 min inducerede en stærk induktion af celledød, som ses ved propidiumiodidfarvning specifikt i CA1-området i hippocampus (figur 3), som svarer som tidligere beskrevet 7. Med markører at visualisere netværk af blodkar, blev det konstateret, at blodkar tæthed og organisation at være lig kontrollen efter OGD udfordring i de fl...

Watch this Scientific Journal Video about The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures at JoVE.com

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

En protokol til entorhino-hippocampus organotypisk skivekulturer, som gør det muligt at gengive mange aspekter af iskæmisk hjerneskade, er præsenteret. Ved at studere ændringer i neurovasculature udover ændringer i neuroner denne protokol er et alsidigt værktøj til at studere ændringer plast i nervevæv efter skade.

Analysen af ​​neurovaskulære Remodeling i Entorhino-hippocampus organotypisk skivekulturer

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypiske Slice Kulturer af Embryonale ventrale midthjernen: et system til undersøgelse Dopaminerge Neuronal Udvikling In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypiske skivekulturer at studere oligodendrocyt Dynamics og myelinering

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic hippocampus skive kulturer som en Model til undersøgelse Neuroprotection og invasionsevne af tumorceller

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Analysen af ​​neurovaskulære Remodeling i Entorhino-hippocampus organotypisk skivekulturer

Analysen af neurovaskulære Remodeling i Entorhino-hippocampus organotypisk skivekulturer